Name: אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו In Vivo ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: למדו את שיטת השתלת מח עצם במודל עכברי לחקר תנועת תאי T במחלת שתל נגד מארח. השיטה מאפשרת ניטור תאי T בזמן אמת באמצעות הדמיה ביולומינסצנטית לחקירת מנגנונים אימונולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו חייבים תודה לאליס Gaughan ומחמם-ג&#39;ינג וואנג, שמצטיין טכניים תמיכה, הזנה רוחנית ותמיכה מוסרית היו תפקיד מרכזי במחקרים אלו נעים קדימה. מחקרים אלה נתמכו על ידי מענק NIH AI036532 לgah.

1. הקרנה קטלנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 10 עכברי נמען לכלוב microisolator תואם irradiator לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין ב2 מנות שווות מסכמות מינון כולל (מנה כוללת = 9 cGy למקבלי BALB.B). הקרנה שנייה צריכה להיות 3 שעות אחרי הראשון. הזריקה אמורה להתרחש בין 4-6 שעות לאחר הקרנה סופית. עכברים להקרין באו 137 מקור Cs או RS2, 000, irradiator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההקרנות במינון, עכברי החנות השני בכלוב microisolator עם מי acidified עד למועד השתלה. </li></ol> 2. הכנת Splenocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר תורם אחד בהתאם להנחיות מוסדיות. כל תורם בדרך כלל מניב 75x10 6 - 125x10 6 splenocytes. שימוש CD8 ערכות טיהור, כל עכבר בדרך כלל מניב 6x10 6 - 12x10 6 תאי T CD8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הטחול ידי ביצוע 2 2 סנטימטר חתך סנטימטר אנכי הימני של קו האמצע ישירות 1תחת כלוב הצלעות. לחתוך את הפרווה, עור, וקרום בטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת טחול וליצור השעית תא בודדה על ידי הצבת מסך טחול ברשת μl 40 בצלחת פטרי עם 1640 RPMI עם 5% FBS. השתמש בוכנת מזרק כדי להתפרק טחול עד שכל הטחול כבר עבר דרך מחיצת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור כל WT וL2G85.B6 תורם. לאסוף את כל השעיות התא הבודדה WT בצינור חרוטים 1-50 מ&quot;ל, ולאסוף את כל L2G85.B6 השעיות התא הבודדות בצינור חרוטי מ&quot;ל נפרד 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ב 1200 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב 4 ° C. כדורי resuspend ב1640 RPMI עם 5% FBS ותאים לספור. </li></ol> 3. הכנת מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עור מאיבר אחורי אחת של עכבר תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך כמו רקמת שריר כמה שאפשר מעצם הירך ועצם שוקה / שוקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת גפיים אחוריים על ידי חיתוך עצם ירך משם במפרק הירך. לחתוך כפה אחורית ממש מתחת לצומת שוקה / שוקית. כל קיצוצי העצם צריכים להתבצע באמצעות מספריים חסונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל רקמת שריר שנותר. חתוך את השוקית-יחסית מח עצם קטן נמצא בשוקית ולא שווה את המאמץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רגל אחורית ב5% תהליך קר 1640 RPMI FBS וחוזר עם האיבר האחורי השני. כל עכבר אמור להניב בין 20x10 6 - 40x10 6 תאים במח עצם. </li></ol> 4. הסרת מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת גפיים אחוריים אחת מתקשורת והמקום בצלחת פטרי גדולה עם כמות קטנה של מדיה קרה (~ 1 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מפרק הברך. שימוש במזרק (נפח מ&quot;ל&gt; 5), מחט תת עורית להכניס לתוך השוקה ומדכא את המזרק עד שכל החומר האדום הוסר מפנים של שוקה. חזור על תהליך עם עצם ירך. השלך עצמות נטולות מח עצם שנותרו. חזור על תהליך עם גפה אחורית שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעית תא בודדה על ידי תקשורת pipetting המכיל מח עצם לתוך צלחת פטרי גדולה ובוכנת מזרק שימוש ו40 μl<html> רשת מסך. השעית פיפטה תא בודדה לתוך צינור חרוטים 50 מ&quot;ל ולשמור על קרח. </li></ol> 5. CD3 אזילה יש מגוון דרכים לפוגעות CD3 + תאים ממח העצם. המעבדה שלנו משתמשת בערכה שנעשתה על ידי Miltenyi BIOTEC (CD3-ביוטין - 130-093-021). לכלות CD3 + תאים ממח העצם בעקבות הפרוטוקול של היצרן. החיץ לערכות Miltenyi להלן ייקרא מאגר MACS (2 mM EDTA, BSA 0.5% ב PBS, 7.2 pH). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי צנטריפוגה splenocytes ותאי מח עצם ב 1200 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב 4 ° C וספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל supernatant. תאי resuspend מח עצם ב100 μl לכל 10 מיליון תאי מח עצם במאגר המקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם CD3 דלדול באמצעות מייצר פרוטוקול &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את תאי מוח עצם מדולדל CD3 3 פעמים ב PBS סטרילית. הרוזן CD3 מתרוקן תאי מח עצם וresuspend בנפח מתאים כדי להזריק 10 7 תאים. </li></ol>תחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. L2G85.B6 CD8 + טיהור תאי T יש מגוון של דרכים לטהר CD8 תאי T מL2G85.B6 עכברים. כמו כן, יש כמה דרכים לפוגעות CD8 תאי T מתורמי splenocyte WT. המעבדה שלנו משתמשת בערכות מMiltenyi BIOTEC (CD8 דלדול - 130-049-401, CD8 טיהור - 130-095-236). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend WT הגלולה במאגר MACS μl 90 ל10 7 תאים. המשך עם דלדול התא CD8 T לפי מייצר &#39;פרוטוקול (CD8 דלדול - 130-049-401). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend L2G85.B6 הגלולה במאגר MACS μl 40 ל10 7 תאים. המשך עם טיהור התא CD8 T לפי מייצר &#39;פרוטוקול (CD8 טיהור - 130-095-236). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור כל אוכלוסייה בתא ולשטוף את כל אוכלוסייה 3 פעמים עם PBS סטרילית. Resuspend כל אוכלוסייה בנפח המתאים כדי להזריק 18x10 6 WT (CD8 המדולדל) וsplenocytes 2x10 6 L2G85.B6 המטוהר CD8 תאי T. </li></ol>7. הכנת הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 10 7 CD3 תאי מח עצם מדולדל, 18x10 6 WT (CD8 המדולדל) splenocytes ו2x10 6 L2G85.B6 מטוהרים CD8 תאי T בצינור microcentrifuge. לשטוף עם סטרילי PBS וresuspend ב 300 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הכנת תא לוריד הזנב של עכברי נמען. זריקות צריכים להיעשות באמצעות 28 מחטי מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי חנות בכלוב microisolator עם מי acidified. עכברי ציון יומי באמצעות שיטת ניקוד GVHD ניקוד שפותחה על ידי קוק ואח&#39; 1. </li></ol> 8. Bioluminescent הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלה לאחר שישה ימים, להזריק עכברי נמען עם 4 מ&quot;ג D-luciferin. אפשר 5 דקות לluciferin להגיב בלוציפראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר בתא isoflurane של imager פליטת האור ומקבלי תמונה למשך 5 דקות עם binning הקטן. פעולה זו תיצור תמונה ברזולוציה גבוהה תוך איסוף כמו אירועים רבים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים באמצעות חייםתוכנת תמונה. קנה המידה של התמונה פסאודו הצבעים יכול להיות שונה כדי להניב את התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, זוהי חובתו של אותו קנה המידה לשימוש בכל ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים של עניין ניתן ליצור באמצעות תוכנת תמונה חייה וemittance אור ניתן לכמת על ידי חישוב הזרם (פוטונים / sec) שנפלט מכל אזור של עניין. </li></ol> 9. נציג תוצאות כ 7-10 ימים לאחר השתלה, עכברים יתחילו להופיע סימנים קליניים של GVHD. עכברים מופיעים מוזנח בשל חוסר הטיפוח. נמענים גם יתחילו לרדת במשקל בין השתלת הודעה 7-10 ימים. הפעילות והיציבה של עכברי נמען תישארנה נורמלים יחסית עד השתלה לאחר כ 12-14 יום. עשרות GVHD מצטברים בהתמדה להגדיל באמצעות השתלת 1 2-3 שבועות לאחר (איור 1 א). מהלך המחלה משתנה מאוד בין עכברים, אולם מקבלים צריכים אחיד להיכנע לGVHD ידי ד 30-40השתלת ays הודעה (1B איור). איור 2 מראה עכברי נמען שצפו בי 6 השתלת הודעת ימים. היקף פסיאודו צבעוני מופעים שונים emittance אור בכל הגוף עם עוצמת האור הגבוהה ביותר שנפלטת בטחול והמעיים. הצטברות תאי T CD8 במעיים עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 6. עכברי נמען ניתן להציב שוב בכלוב microisolator להיות צלמו בנקודת זמן מאוחר יותר או מורדם להדמית vivo לשעבר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קריטריונים </td><td> כיתה 0 </td><td> כיתה 1 </td><td> כיתה 2 </td></tr><tr><td> ירידה במשקל (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> יציבה </td><td> נורמלי </td><td> Hunching רק במנוחה </td><td> Hunching כמה; פוגע movement </td></tr><tr><td> פעילות </td><td> נורמלי </td><td> קל עד בינוני ירידה בפעילות </td><td> נייח אלא אם מגורה </td></tr><tr><td> מרקם פרווה </td><td> נורמלי </td><td> קל עד מתונה פורעת </td><td> עלעול קשה / הזנחה עצמית </td></tr><tr><td> מרקם עור </td><td> נורמלי </td><td> קנה מידה של כפות / זנב </td><td> אזורים בולטים של עור נכרתים </td></tr></tbody></table> הטבלה 1. קוק ואח&#39; פתח שיטת ניקוד זה ב -1996 1. עכברים צריכים להיות בקיע מדי יום בכל אחד מהקריטריונים שבצד השמאל. כל עכבר מקבל ציון של 0-2 לכל קריטריון והציון הכולל הוא סכום של כל הציונים הבודדים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> האיור 1. קטלני BALB.B המוקרן הושתלו עם 10 7 עצםתאי מח לבד או עם 18x10 6 splenocytes תא CD8 T המדולדל WT ו2x10 6 המטוהרים L2G85.B6 CD8 תאי T. א) נתוני ציון קליניים של מקבלי מח עצם לבד או עם תאי T CD8 מדולדל splenocytes WT וטהר L2G85.B6 CD8 תאי T. B) נתוני הישרדות של מקבלי מח עצם לבד או עם CD8 תאי T מדולדל splenocytes WT וטהר L2G85.B6 CD8 תאי T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> איור 2. עכברי BALB.B קטלני מוקרנים הושתלו עם 10 7 תאי מח עצם לבד או עם 18x10 6 splenocytes תאי T CD8 מדולדל WT ו2x10 6 המטוהרים L2G85.B6 CD8 תאי T. מקבלים הוזרקו 4 מ&quot;ג D-luciferin באמצעות הזרקת intraperitoneal והיו צלמו באמצעות IVIS Xenogen למשך 5 דקות בbinning הקטן. נ.ב.תמונות eudo צבע מוצגות בי סגולים מייצגת עצמה נמוכה ואדום מייצג אזורים בעצמה גבוה של עניין היו סגור מסביב לכל העכבר ושטף כולל (פוטונים / sec) הייתה לכימות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> איור 3. עכברי BALB.B קטלני מוקרנים הושתלו עם 10 7 תאי מח עצם לבד או עם 18x10 6 splenocytes תאי T CD8 מדולדל WT ו2x10 6 המטוהרים L2G85.B6 CD8 תאי T. מקבלים הוזרקו 4 מ&quot;ג D-luciferin באמצעות הזרקת intraperitoneal והיו צלמו באמצעות IVIS Xenogen למשך 5 דקות בbinning הקטן. תמונות פסיאודו צבעוניים מוצגות בי סגולים מייצגת עצמה נמוכה ואדום מייצג עצמה גבוהה. מקבלים היו צלמו ב) יום 4, ב &#39;) יום 6, ו-C) העברת הודעה היום 8.

<ol><li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li>
<li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+CD8%2B+cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li>
<li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li>
<li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment%2C+rejection%2C+and+survival+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li>
<li>Asady, R. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%7Bbeta%7D-dependent+CD103+expression+by+CD8%28%2B%29+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+%28alpha+E+beta+7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li>
<li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li>
<li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen%2C+H60%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול לגרימת GVHD בעכברים שהוצגו כאן מהווה מודל רלוונטי קליני של GVHD העכברי. הוקם במקור על ידי ברגר ואח&#39;. בשנת 1994, / 6 C57Bl לשילוב מתח BALB.B הוא MHC-תאם, עם תמותת GVHD מתווכת על ידי CD4 CD8 התלוי, גורמי אש T 2, דומים מאוד לתרחיש הקליני השכיח ביותר 3. זה ידוע כי השתלת תאי T CD8 לבד אינה גורמת GVHD במודל זה, עם זאת, התקדמות מחלה באופן משמעותי יותר כאשר שני CD4 CD8 ותאי T נמצא בהשוואה לתאי T מסוג CD4 בלבד. יתר על כן, יש כבר עבודה נרחבת המצי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא 40 מיקרומטר </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-ביוטין </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Microbeads אנטי ביוטין </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a microbeads </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-049-401 </td><td> נהג לכלות CD8 תאי T מטחול. </td></tr><tr><td> קוקטייל נוגדן טיהור CD8a </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-095-236 </td><td> משמש לטיהורCD8 תאי T מטחול. </td></tr><tr><td> D-luciferin </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; in vivo</em&gt; ניטור תא t תוך שימוש במודל murine mhc התאמה

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

מחלת שתל נגד מארח (GVHD) היא המחסום להגבלת השימוש הרחב של השתלת מח עצם כטיפול מרפא למגוון ליקויים המטולוגיות. GVHD נגרם על ידי תאי T alloreactive בשלים הנמצאים במח עצם השתל שהחדירו לתוך הנמען ולגרום ניזק לאיברים מארחים. עם זאת, בעכברים, תאי T יש להוסיף לבידוד מח העצם גורמים GVHD. למרות עבודה מקיפה שנעשתה לאפיין השתלת הודעת T תא תגובות, טכנולוגיית הדמית bioluminescent היא שיטה לא פולשנית כדי לעקוב אחר דפוסי סחר בתאי ה T בגוף חי. בעקבות קרינה קטלנית, עכברי נמען מושתלים עם תאי מח עצם וsplenocytes מעכברים תורמים. תת תאי T מL2G85.B6 (עכברים הטרנסגניים שconstitutively מבטאים לוציפראז) נכללים בהשתלה. על ידי השתלת תאי T מסוים תת בלבד, אחד הוא מסוגל לעקוב אחר תת תאי T ספציפי בגוף חי,ובהתבסס על המיקום שלהם, לפתח השערות בדבר תפקידו של תת תאי T ספציפי בקידום GVHD בנקודתי זמן שונות. בהשתלת הודעת מרווחים קבועים מראש, עכברי נמען הם צלמו באמצעות מצלמת CCD IVIS Xenogen. עוצמת אור ניתן לכמת באמצעות תוכנת תמונת חיים כדי להפיק תמונה פסאודו צבע המבוססת על עוצמת פוטון (אדום = בעצמה גבוהה, סגולות = עצימות נמוכות). בין השתלה לאחר 4-7 ימים, עכברי נמען מתחילים להראות סימנים קליניים של GVHD. קוק ואח&#39;. 1 פתח שיטת ניקוד ללכמת את התקדמות מחלה המבוססת על מרקם נמען עכברי פרווה, שלמות עור, פעילות, ירידה במשקל, ויציבה. עכברים הם הבקיעו יומיים, ומורדמים כשהם הופכים לגוססים. עכברים בדרך כלל מטופלות הפכו גוססים השתלת 20-30 ימי הודעה. מודלים עכבריים הם כלים רבים ערך ללימוד אימונולוגיה של GVHD. סלקטיבי השתלת התאים T מסוים תת אלשפל לזיהוי מדוקדק של התפקידים כל תת מחזות. הלא פולשני מעקב תגובות תא T in vivo מוסיף עוד שכבה של ערך למודלים עכבריים GVHD.

השתלת מח עצם Murine היא טכניקה בשימוש נרחב ללמוד מנגנונים אימונולוגיים המסדירים את מחלת שתל נגד מארח בבני אדם. היכולת לעקוב אחר דפוסי סחר בתא T<em&gt; In vivo</em&gt; מאפשר ניתוח מפורט של ההתפתחות וההנצחה של תגובות תא T במחלת שתל נגד מארח.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

מחלה של השתלה מהתורם למקבל (GVHD) היא המחסום המגביל את השימוש הנרחב בהשתלת מחיתיים כטיפול ריפואי למגוון של מחלות המטולוגיות...

מטרתו של הליך זה היא לחקור את דפוסי התנועה וההצטברות של תאי T במהלך מחלת השתל נגד המארח. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד מחית גרמית ותאים מעכברי תורם. השלב השני הוא טהרת אוכלוסיות התאים הרלוונטיות והכנתן להשתלה.בשלב הבא, אוכלוסיות התאים המטוהרות משולבות ומושתלות לעכברי מקבל שהוקרנו. השלב הסופי הוא ויזואליזציה של דפוסי התנועה וההצטברות של תאי T בעכברי המקבל. לבסוף, נעשה שימוש בדימות ביו-לומנינסנטי כדי להראות את דפוסי התנועה וההצטברות של תאי T במהלך GVHD.היתרון המרכזי של דימיון ביו-לומנינסטי על פני טכנולוגיות קיימות הוא שהוא מאפשר אמצעי לגילוי לימפוציטים בכל רחבי העכבר, בניגוד לאתר ספציפי כפי שנעשה בטכנולוגיות קיימות. יש להקרין את העכברים המקבלים במינון קטלני לפני השתלת מחית גרמית ותאי T. מקמו עד 10 עכברים מקבלים בכלוב בידוד מיקרוסקופי התואם את המקרין שבו נעשה שימוש.בשלב הבא, הקרינו את העכברים באמצעות מקור cesium 137 או RS 2000, רדיאטור עם מינון ראשוני של 4.5 centigrade. לאחר שלוש שעות, הקרינו את העכברים שוב במינון של 4.5 centigrades, לסך של תשעה centigrades של קרינה. לאחר המינון השני, אחסנו את העכברים המקבלים בכלוב מיקרו-בידוד עם מים מחמיצים ב-pH של 3 עד למועד ההשתלה.מים מחומצים יסייעו בבקרת זיהומים אופורטוניסטיים במקלטים להשגת תאי PLE. בצעו חתך אנכי של שני סנטימטרים בעורו של עכבר תו

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

השתלת עור זנב היא מודל רב עוצמה לחקר דחייה תלויה בתאי T והשראת סבילות במהלך תגובות חיסוניות אלוגניות בעכברים. היתרונות של פרוטוקול זה הם ניתוח פולשני קל, וקלות ניטור ללא צורך להקריב את העכבר המקבל.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת אינטרפוזיציה של אבי העורקים בעכברים. מטרת הפרוטוקול היא לספק מודל שבאמצעותו ניתן לחקור תהליכים פתולוגיים ואסטרטגיות טיפוליות הרלוונטיות לתגובות אלואימוניות בעורקים ולשינויים העורקיים הנובעים מכך התורמים לכישלון השתלת איברים.

עכבר דגם של דחיית כלי דם הנוצרת על-Alloimmune וטרשת עורקים להשתלות

השתלת עור בעובי מלאת Murine היא מודל ומבוסס ללמוד דחייה בסביבת alloimmune. כאן, אנו מספקים הדרכה של כל שלב המעורב בביצוע BALB / ג - השתלת עור&gt; C57BL / 6 בעובי מלא.

השתלת עור בעובי מלא Murine

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מתאר השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic ומאפשרת חוזרות הערכות מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי באתרו נוכחות, מאפיינים של חומרת דלקת מעי בתוך בשידור חי עכברים הסובלים מעיים שתל – מול – מארח מחלות.

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

אנו מתארים היקפית אנושית תא היקפי (pbmc)-מבוסס הומניזציה מודל העכבר מבע שתלת עבור מחקר translational-אונקולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כמנחה כללי להקמת ולאפיון מודלים דומים להערכת הטיפול של I-O.

תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזעיר פולשנית להשתלה והדמיה של תאי NIT-1 בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD) - עכברים משולבים בעלי כשל חיסוני חמור המאותגרים בטחול מטוהר מעכברי NOD סוכרתיים ספונטניים.

ניטור ביולומינסנטי של הישרדות השתל במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים

למדו את שיטת השתלת מח עצם במודל עכברי לחקר תנועת תאי T במחלת שתל נגד מארח. השיטה מאפשרת ניטור תאי T בזמן אמת באמצעות הדמיה ביולומינסצנטית לחקירת מנגנונים אימונולוגיים.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו

גלה סרטונים נוספים