הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את ההשפעות של חשיפה לאתנול על דגי זברה בשלבי התפתחותם. הדבר מבוצע תחילה על ידי חשיפת דגי זברה למינונים של אתנול במי embryos רגילים במהלך ההתפתחות המוקדמת. לאחר מכן, האתנול מוסר והדגים מורשים להתפתח עד לנקודת הזמן הרצויה.

לאחר מכן, נבדקים הן שינויים פיזיים גולמיים והן שינויים בביטוי גנים בעוברים שעברו טיפול בהשוואה לעוברי ביקורת. לבסוף, העוברים מטופלים באמצעות mRNA, מורפולינואו או תרופות כדי לקבוע אם ניתן לשנות את הפגמים ההתפתחותיים שהשראת האתנול. בסופו של דבר, שילוב של qPCR והכלאה באתר (in situ hybridization) מראה כי השפעות האתנול על עוברי זבראפיש המתפתחים קשורות לשינוי בביטוי גנים.

מניפולציה עוקבת של רמות ביטוי הגנים עשויה לשפר או למנוע פגמים התפתחותיים המושרים על ידי אתנול. הטכניקות שאנו מדגימים היום מרחיבות את הידע שלנו על טבעה של תסמונת אלכוהול עוברית, וכן על שימור תהליכי התפתחות בחוליתיים. תפגין זאת היום סטף ארהארדט, טכנאית במעבדה שלי, לצורך טיפול בעובריים באתנול.

גדלו אותם מהשבחות של סוג בר (wild type) עד לשלב כיפה (dome stage) בטמפרטורה של 28 degrees Celsius במי עוברים. פזרו את העוברים משנייה אחת למספר המנותים הרצוי, כאשר בכל מנתית יהיו בין 10 ל-50 עוברים. הוסיפו לעוברים תמיסת אתנול בריכוז של 0.2% עד 2.5% volume to volume במי דגים, והחזירו למדגרה למשך עד 24 שעות לאחר משך החשיפה הרצוי.

החליפו את האתנול המכיל מים במי עוברים טריים למשך תקופה ספציפית של התפתחות כדי לאסוף mRNA עבור qPCR כמותי. העבירו עוברים תואמים של H למבחנות epinephrine. הסירו את מי הדגים והוסיפו תמיסת ליזיס עם TCEP.

באמצעות טחנה ממוטרת, הפר את העוברים פיזית ולאחר מכן העבר אותם לצנטריפוגה לסבב איטי. העבר את התמיסה לעמודת טיהור מקדימה (pre-clear column), ולאחר מכן צנטריפוג את העמודה, כדי להסיר חלקי רקמה גדולים שהופרדו.

השתמשו בערכה לבידוד RNA כדי להפיק את ה-RNA. לאחר מכן, סנתזו cDNA בשיטות סטנדרטיות לניתוח QPCR או Microarray כדי להכין את העוברים עבור היברידיזציה in situ וצביעה בנוגדנים. קבעו עוברים 6 עד 24 שעות לאחר ההפריה ב-4% paraformaldehyde למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, לאחר שלושה שטיפות ב-PBS פלוס 0.1% tween.

הסר את ה-choon באמצעות שתי פינצטות חדות תחת המיקרוסקופ. לאחר מכן, העבר את העוברים למתנול באמצעות סדרה של החלפות נוזלים עם ריכוז מתנול עולה וריכוז PBT יורד. לאחר העברת העוברים ל-100% methanol, אחסן אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצביעת הסחוס.

גדלו את העובריים עד חמישה או שישה ימים לאחר ההפריה. קבעו אותם למשך לילה ב-4%paraform aldehyde בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב-PBT כדי לקבוע אילו רמות ביטוי של גנים השתנו כתוצאה מחשיפה לאתנול.

בצעו qPCR על ידי תכנון ראשוני של הפריימרים כדי לתקף אותם. בחנו אותם על שלוש דגימות ביולוגיות. דגימות ביקורת ביולוגיות אלו יכולות להיות מכל גיל, כל עוד הגן הנחקר מתבטא באותו גיל ספציפי.

לאחר אימות הפריימרים, השתמש ב-cDNA שהוכן מראש לביצוע qPCR, כאשר הדגימות מורצות בשלוש חזרות וכוללות דגימת בקרה. עבור בקרת zebrafish, אנו משתמשים בפריימרים עבור gap dh. נרמלי את התוצאות לרמות של gap DH. לאחר מכן, חשב את הרמה היחסית של ביטוי הגן באמצעות שיטת ה-powerful.

וריאציה של שתי שיטות delta delta CT המציגה את ההבדל בין הדגם הניסויי לסוג הפרא. עבור C, שני מבני היברידיזציה. probes ריבונוקלאזיים מסומנים לגן המטרה.

לאחר מכן, דגרו אותם עם עוברים תואמים בגיל תחת תנאים סטנדרטיים וזהו את תבנית ההיברידיזציה באמצעות פוספטאזה עילית; צלמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי להעריך את ההתפתחות המורפוגנית, כגון צורת הגוף. צלמו עוברים חיים כדי להעריך את המרחק הבין-עיני ואת אורך הגוף. ראשית, קבעו את העוברים בפרפורמאלדהיד. לאחר מכן, אספו תמונות כדי לבחון את השפעות הטיפול באלכוהול על מבני הסחוס המתפתחים בזחל הצבוע.

קיבעו את דגי zebrafish באמצעות lc וכחול למשך מספר שעות או ללילה כדי להשהות ולהבהיר את העובריים לפני ההדמיה. נתוחו מוות תאי בעובריים חיים על ידי דגירה שלהם ב-5 mg/mL של aine orange ב-PBS למשך שעה אחת. שטפו את העובריים שלוש פעמים ב-PBS, לאחר מכן הניחו את העובריים על שקופיות, הדמיעו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי והשתמשו ב-Z series כדי ליצור תמונות מורכבות (composites).

לאחר זיהוי הגנים שביטויים פחת בעקבות חשיפה לאתנול, מזריקים 25 עד 200 picograms per nanoliters של mRNA מצופה (capped) עבור הגן המבוקש לשלב של תא אחד או שניים. מאפשרים לביצים להתאושש באינקובטור המחומם ל-28 °C עד שהן מגיעות לשלב כיפה (dome stage), ולאחר מכן מטפלים בהן באתנול כפי שנעשה קודם לכן. עבור גנים שביטויים עלה כתוצאה מחשיפה לאתנול, מבצעים השתקה (knock down) על ידי הזרקת כמויות של picogram עד nanogram של morphos antisense לעוברי שלב תא אחד או שניים.

פרוטוקול זה דומה לזה של mRNA עם כיסוי (capped mRNA). במקרה של הזרקת mRNA או morpholino לסבייסינג (splicing morpho), יש למדוד את היעילות באמצעות R-T-P-C-R כדי להשוות בין כמויות התמלילים שעברו סבייסינג לאלו שלא עברו, זאת לצורך ניתוח פעילות גנים תלוית-מינון. יש לבצע טיטרציה של המורפולינו המוזרק ולאפשר לעוברים להתפתח לשלב הרצוי לפני הטיפול באתנול. חשיפת עוברי דג הזברה לאתנול מובילה למספר פגמים התפתחותיים וגנטיים הקשורים לפנוטיפים הנמצאים בחולייתים אחרים.

התפתחות לא תקינה של רקמות אקסיאליות, כולל של ה-Noor, מובילה ל-noord מקוצר ולעיתים מקוטע, מה שגורם בחלקו להפרות המאוחרות בסומיטים כפי שמוצג כאן. בעוד שבביקורות שלא טופלו יש צורה חזקה של חץ (chevron), הסומיטים שטופלו באתנול מקבלים מראה בצורת U הנראה כאשר יש סיגנל מופחת של sonic hedgehog. כפי שניתן לראות כאן.

השלכה נוספת של חשיפה לאתנול, שייתכן שהיא תוצאה של עיכוב התפתחותי מוקדם ופגמי Noor עוקבים, היא קיצור של אורך העובר. ממצא זה דומה לתופעה של גבליות של שלב טרום הבעירות וקומה נמוכה הנמצאים בקרב ילדים שנחשפו לאתנול במהלך ההתפתחות, דבר המרמז כי מודל דג הזברה רלוונטי להבנת מום מולד זה בבני אדם. הוכח במודלים של בעלי חיים כי חשיפה חמורה לאתנול מובילה לפנוטיפים בולטים של תסמונת אלכוהול עוברית, כולל synthia ו-opia.

בדגי זברא, המרחק הבין-עיני או ה-IOD קטן באופן התלוי במינון האתנול, באופן התואם לאופי המום מולד זה בבני אדם. אופיה (Opia) נמצאת רק במינונים גבוהים מאוד, אך מינונים נמוכים יותר גורמים להפחתה משמעותית ב-IOD, מה שמעיד על כך שדגם חיה זה סובל מפגם דומה בהתפתחות קו האמצע של הפנים. באיור זה, רמות הביטוי המוקדמות של הגנים six3b ו-gli1 מושווים בעוברים שלא טופלו ובעוברים שטופלו באתנול.

שני הגנים הראו רמות ביטוי מופחתות בדגימות שטופלו באתנול. באמצעות היברידיזציה כפולה של NC, נותחו דפוסי הביטוי עבור six3B ו-gooID כפי שניתן לראות. כאן, שני הגנים הראו ירידה בביטוי המרחבי בעוברי עוברים שטופלו באתנול בהשוואה לביקורות שלא טופלו.

מכיוון ששני הגנים מתבטאים ברקמות שdestined להפוך לרקמות קו האמצע הקרניו-פציאליות (C), הפחתתם שמונה שעות לאחר ההפריה עולה בקנה אחד עם הפחתת IOD בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות. לאחר זיהוי הגנים המושפעים מהאתנול, קיימים מנגנוים שבאמצעותם ניתן להגביר או להפחית את ביטוים. בדוגמה זו, הוזרק mRNA עבור sonic hedgehog, ליגנד המגביר את רמות glee one, ובכך הוא תיקן את הפגמים המורפולוגים שנבעו מהפחתת glee one בעובריים שטופלו באתנול.

עם זאת, הזרקה של six three B לא הצליחה להציל את הפנוטיפ שנחשף לאתנול. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לחקור את הפגמים הגנטיים וההתפתחותיים שנגרמו על ידי אתנול בעובר של דג זברה בשלבי התפתחות. ניתן ליישם את הטכניקות שנעשה בהן שימוש כאן גם עבור אלו המעוניינים לחקור את הרעילות של תרכובות מסיסות במים אחרות בעובר של חולייתן בשלבי התפתחות.