Name: הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למדו להעריך שינויים טרטוגניים ב-Danio rerio לאחר חשיפה לאתנול עוברית. השיטה משלבת PCR כמותי והכלאה in situ לניתוח שינויי ביטוי גנים ופגמים פיזיים בפגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות מונטה ווסטרפילד, מקוטו קוביאשי ו יאצק Topczewski על המתנות של פלסמידים שכן ההכלאה באתרם microinjections mRNA. אנו מודים סטף ארהרד עבור המופיע בסרטון. כמו כן, אנו רוצים להודות סיוע של ויליאם Goossens עם מיקרוסקופיה confocal רואים בסרט. טיילר שוונד סיפק תמונות בשימוש וידאו, ואת רודני דייל סייעה לקראת וידאו. כמו כן, אנו מודים לצוות CMRC טיפול בבעלי חיים לעבודה עם בעלי דג הזברה. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R21 AA13596 כדי SCA.

<ol><li>Streissguth, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+in+adolescents+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome in adolescents and adults.</a> Jama. 265 (15), 1961-1967 (1991).</li>
<li>Floyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+from+the+CDC.+Preventing+alcohol-exposed+pregnancies+among+women+of+childbearing+age%3A+the+necessity+of+a+preconceptional+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Womens+Health+Gend.+Based+Med%22%5BJournal%5D)">Observations from the CDC. Preventing alcohol-exposed pregnancies among women of childbearing age: the necessity of a preconceptional approach.</a> J. Womens Health Gend. Based Med. 8 (6), 733-736 (1999).</li>
<li>Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+acute+ethanol+exposure+in+zebrafish+development%3A+a+critical+time+window+and+resilience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of acute ethanol exposure in zebrafish development: a critical time window and resilience.</a> PLoS One. 6 (5), e20037-e20037 (2011).</li>
<li>Dlugos, C. A., Rabin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional effects of developmental exposure to ethanol on the zebrafish heart.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 34 (6), 1013-1021 (2010).</li>
<li>Fernandes, Y., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+behavioral+changes+in+response+to+early+developmental+exposure+to+ethanol+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33 (4), 601-609 (2009).</li>
<li>Bilotta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+embryonic+exposure+to+ethanol+on+zebrafish+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Effects of embryonic exposure to ethanol on zebrafish visual function.</a> Neurotoxicol. Teratol. 24 (6), 759-766 (2002).</li>
<li>Tanguay, R. L., Reimers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ethanol+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of ethanol developmental toxicity in zebrafish.</a> Methods Mol. Biol. 447, 63-74 (2008).</li>
<li>Blader, P., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+impairs+migration+of+the+prechordal+plate+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethanol impairs migration of the prechordal plate in the zebrafish embryo.</a> Dev. Biol. 201 (2), 185-201 (1998).</li>
<li>Loucks, E., Carvan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3rd%2C+Strain-dependent+effects+of+developmental+ethanol+exposure+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">3rd, Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).</li>
<li>Ahlgren, S. C. Molecular Mechanisms of Fetal Alcohol Syndrome: Shh-signaling. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhlgren%2C+SC+%22Comprehensive+Handbook+of+Alcohol+Related+Pathology%22">Comprehensive Handbook of Alcohol Related Pathology</a>. Preedy, V. , (2004).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), 45-45 (2001).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJowett%2C+T+%22Tissue+in+situ+hybridization%3A+methods+in+animal+development%22">Tissue in situ hybridization: methods in animal development</a>. , John Wiley & Sons. New York. 128-128 (1997).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 86, 556-567 (2009).</li>
<li>Schwend, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Npc1+and+availability+of+cholesterol+for+early+embryonic+cell+movements+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Requirement of Npc1 and availability of cholesterol for early embryonic cell movements in zebrafish.</a> J. Lipid Res. 52 (7), 1328-1344 (2011).</li>
<li>Spohr, H. L., Willms, J., Steinhausen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders+in+young+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders in young adulthood.</a> J. Pediatr. 150 (2), 175-179 (2007).</li>
<li>Strauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+intrauterine+environment+on+childhood+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effects of the intrauterine environment on childhood growth.</a> Br. Med. Bull. 53 (1), 81-95 (1997).</li>
<li>Loucks, E. J., Schwend, T., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+associated+with+teratogen-induced+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Molecular changes associated with teratogen-induced cyclopia.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 79 (9), 642-651 (2007).</li>
<li>Schwend, T., Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Gli+activity+in+craniofacial+tissues+of+hedgehog-pathway+reporter+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of Gli activity in craniofacial tissues of hedgehog-pathway reporter transgenic zebrafish.</a> PLoS One. 5 (9), 14396-14396 (2011).</li>
<li>Chrisman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+ethanol+exposure+disrupts+the+expression+of+FGF8+and+Sonic+hedgehog+during+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Gestational ethanol exposure disrupts the expression of FGF8 and Sonic hedgehog during limb patterning.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 70 (4), 163-171 (2004).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

בשיטות שתוארו כאן את התוצאות המוצגות להוכיח רק קצה איך דג הזברה יכול לשמש כדי לחקור ליקויים התפתחותיים. בגלל הנגישות של העובר, מספר גבוה של ביצים על המצמד כל אחד, שחזור גבוהה של התוצאות, חוליות אלה הם אידיאליים עבור מחקרים טרטוגניות. הדג יכול גם לטפל להכיל מולקולות ניאון להשתמש ככתב חזותית גן מסוים או מסלול של ריבית 19. במחקרים אתנול, במינונים המשמשים נראה די גבוה לעומת רמות אלכוהול בדם יונקים. עם זאת, רמות אלה משקפים את מה נמצא בתוך המים, ולא כל אתנול מועבר לעובר. יחדיו, בשיטות המתוארות ו כמפורט לעיל עולה כי עוברי דג הזברה הם שימושיים מאוד בדוגמנות מומים מולדים אדם הקשורים לחשיפה אתנול. יתר על כן, הביטוי של גנים השינויים שנמצאו דג הזברה אושרו על ידי אחריםבמערכות מודל יונקים 20, טוען כי השפעת ההתפתחות של אתנול נשמרות על פני החוליות. רבים טכניקות הפגינו לעיל ניתן להשתמש עם עלבונות סביבתיים או תרופות אחרות על מנת לאתר בקלות ובמהירות teratogens פוטנציאליים ולקבוע את המנגנונים התורמים teratogenesis של חומר מסוים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> רקמת RNA ערכת: 5-ראש PerfectPure </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> פלטינום SYBR ירוק QPCR SuperMix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage תשואה גבוהה mMachine כתרים ערכת שעתוק RNA </td><td> יישומי Biosystems </td><td> תלוי פולימראז רנ&quot;א פלסמיד שלך </td></tr></tbody></table>

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

תסמונת אלכוהול עוברית (FAS) הוא ביטוי חמור של חשיפה עוברית על אתנול. הוא מציג עם מומים האופייניים על הפנים איברים, כולל פיגור שכלי עקב התפתחות המוח ועל סדר פגום. ספקטרום אלכוהול עוברית הפרעה (FASD) הוא מונח המשמש לכיסוי רצף של מומים מולדים המתרחשות עקב צריכת אלכוהול של האם, ומופיע כ -4% מהילדים שנולדו בארצות הברית. עם 50% הפוריות לנשים בגיל דיווח על צריכת אלכוהול, ומחצית ההריונות להיות מתוכנן, חשיפה לא מכוונת הוא נושא מתמשך 2. על מנת להבין בצורה הטובה ביותר את הנזק המיוצר על ידי אתנול, ובנוסף לייצר מודל שבאמצעותו אפשר לבדוק התערבויות פוטנציאליות, פיתחנו מודל של חשיפה באמצעות אתנול התפתחותית עובר דג הזברה. דג הזברה הם אידיאליים עבור סוג זה של מחקר teratogen 3-8. כל זוג מטילה מאות ביצים, אז מה שיכול להיות שנאספו מבלי לפגוע הבוגרתדגים. עובר דג הזברה שקוף ניתן הדמיה בקלות עם כל מספר של כתמים. ניתוח של עוברים אלה לאחר חשיפה אתנול במינון ובזמנים שונים של משך מראה כי יישום הליקויים ההתפתחותיים ברוטו אתנול המיוצר על ידי עולים בקנה אחד עם מום הלידה האנושית. שתוארו כאן הם הטכניקות הבסיסיות המשמשות ללמוד ולטפל מודל FAS דג הזברה.

כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של אתנול הנזק הנגרמת התפתחותית, פיתחנו מודל של דג הזברה חשיפה אתנול בוחנים את פיזיים, שינויים הסלולר, וגנטיים המתרחשות לאחר החשיפה אתנול<sup&gt; 1</sup&gt;. לאחר מכן, אנו מבקשים למצוא התערבויות פוטנציאליות במהירות לבדוק אותם במודל בעלי חיים.

תסמונת אלכוהול עוברית (FAS) היא ביטוי חמור של חשיפה לאתנול בשלב העוברי. היא מתאפיינת בפגמים אופייניים בפנים ובאיברים, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את ההשפעות של חשיפה לאתנול על דגי זברה בשלבי התפתחותם. מטרה זו מושגת תחילה על ידי חשיפת דגי זברה למנות אתנול במי עוברים רגילים במהלך ההתפתחות המוקדמת. לאחר מכן, האתנול מוסר והדגים מורשים להתפתח עד לנקודת הזמן הרצויה.לאחר מכן, נבדקים הן שינויים פיזיים גסים והן שינויים בביטוי גנים בעוברים שעברו טיפול בהשוואה לעוברי ביקורת. לבסוף, העוברים מטופלים באמצעות mRNA, מורפולינואים או תרופות כדי לקבוע אם ניתן לשנות את הפגמים ההתפתחותיים שהושרה על ידי אתנול. בסופו של דבר, שילוב של qPCR והibrדיזציה in situ מעיד כי השפעות האתנול על עוברי דג הזברה המתפתחים קשורות לשינוי בביטוי גנים.מניפולציה מאוחרת של רמות ביטוי הגנים עשויה לשפר או למנוע פגמים התפתחותיים המושרים על ידי אתנול. הטכניקות שאנו מדגימים היום מרחיבות את הידע שלנו על טבעה של תסמונת אלכוהול עוברית, וכן משמרות תהליכי התפתחות בחולייתנים. סטף ארהרדט, טכנאית במעבדה שלי, תדגים היום כיצד לטפל בעובריים באמצעות אתנול.גדלו אותם מהשבחות של סוג בר (wild type) עד לשלב הכיפה (dome stage) בטמפרטורה של 28 degrees Celsius במי עוברים. חלקו את העוברים מתוך תפריקה למספר המנות המבוקש של צלחניות, כאשר בכל צלחנית יהיו בין 10 ל-50 עוברים. הוסיפו לעוברים תמיסת אתנול בריכוז של 0.2 עד 2.5% volume to volume במי דגים, והחזירו למדגרה למשך עד 24 שעות לאחר משך החשיפה הרצוי.החליפו את האתנול המכיל מים במי עוברים טריים למשך תקופה מוגדרת של התפתחות, כדי לאסוף mRNA עבור qPCR כמותי. העבירו עוברים תואמים של H למבחנות אפלורון. הסירו את מי הדגים והוסיפו תמיסת ליזיס עם TCEP.באמצעות דחליף (pulverizer) ממונע, הפרד פיזית את העוברים ולאחר מכן העבר אותם לצנטריפוגה לסבב איטי. העבר את התמיסה לעמודת ניקוי מקדימה (pre-clear column), ואז צנטריפוג את העמודה, כדי להסיר חלקי רקמה גדולים שהופרדו.השתמשו בערכה לבידוד RNA כדי להפיק את ה-RNA. לאחר מכן, סנתזו cDNA בשיטות סטנדרטיות עבור ניתוח QPCR או microarray כדי להכין את העוברים עבור היברידיזציה במקום (in situ hybridization) וסימון נוגדנים. קבעו עוברים שגילם שש עד 24 שעות לאחר ההפריה ב-4% paraformaldehyde למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, לאחר שלושה שטיפות ב-PBS פלוס 0.1% tween.הסיר את ה-choon באמצעות שתי פינצטות חדות תחת המיקרוסקופ. לאחר מכן, העבר את העובריים למתנול באמצעות סדרת החלפות נוזלים עם ריכוז מתנול עולה וריכוז PBT יורד. לאחר העברת העובריים ל-100% methanol, אחסן אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצביעת הסחוס.גדלו את העוברים עד לחמישה או שישה ימים לאחר ההפריה. קבעו אותם למשך הלילה ב-4% paraformaldehyde בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב-PBT כדי לקבוע אילו רמות ביטוי של גנים השתנו כתוצאה מחשיפה לאתנול.בצעו QPCR על ידי תכנון ראשוני של פריימרים ולאחר מכן תיקוף שלהם. בחנו אותם על שלוש דגימות ביולוגיות. דגימות ביקורת ביולוגיות אלו יכולות להיות מכל גיל, כל עוד הגן הרלוונטי מובע בגיל ספציפי זה.לאחר אימות הפריימרים, השתמש ב-CDNA שהוכן מראש כדי לבצע QPCR, כאשר הדגימות מורצות בשלוש חזרות וכוללות דגימת בקרה עבור בקרה של zebrafish; אנו משתמשים בפריימרים כדי למדוד gap dh. נרמל את התוצאות לרמות של gap DH. לאחר מכן, חשב את רמת הביטוי הגנית היחסית באמצעות שיטת ה-powerful method.וריאציה של שני delta delta CT המציגה את ההבדל בין הניסוי לסוג הברא (wild type). עבור C, שני מבני היברידיזציה. גש probes של ribo המסומנים לגן המדובר.לאחר מכן, דגרו אותם עם עוברים בעלי גיל תואם בתנאים סטנדרטיים וזהו את דפוס ההכלאה (hybridization) באמצעות פוספטאזה עיקורית (alkine phosphatase); צלמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה כדי להעריך את ההתפתחות המורפוגנית, כגון צורה של עיניים. צלמו עוברים חיים כדי להעריך את המרחק הבין-עיני ואת אורך הגוף. ראשית, קבעו את העוברים בפרה-פורמאלדהיד. לאחר מכן, אספו תמונות כדי לבחון את השפעות הטיפול באלכוהול על מבני הסחוס המתפתחים בזחלים שנסמנו.קבעו את דגי הזבראפיש באמצעות lc וכחול למשך מספר שעות עד ללילה כדי להקשיר ולהבהיר את העוברים לפני הדמיה. נתחו מוות תאי בעוברים חיים על ידי דגירה שלהם ב-5 mg/mL של aine orange ב-PBS למשך שעה אחת. שטפו את העוברים שלוש פעמים ב-PBS, לאחר מכן קיבעו את העוברים על למסות, הדמיעו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי והשתמשו ב-Z series ליצירת תמונות מורכבות (composites).לאחר זיהוי גנים שביטוים פחת כתוצאה מחשיפה לאתנול, מזריקים 25 עד 200 picograms per nanoliters של mRNA חסום (capped) עבור הגן הנבחר לשלב של תא אחד עד שניים. מאפשרים לביציות להתאושש באינקובטור המחומם ל-28 °C עד להגעתן לשלב הכיפה (dome stage), ולאחר מכן מטפלים בהן באתנול כפי שנעשה קודם לכן. עבור גנים שביטוים עלה כתוצאה מחשיפה לאתנול, מבצעים השתקה (knock down) על ידי הזרקת כמויות של picogram עד nanogram של antisense morphos לעוברי שלב של תא אחד עד שניים.פרוטוקול זה דומה לזה של mRNA בעל כיסוי (capped mRNA). אם מזריקים mRNA או morpholino שגורם לשחלוף (splicing morpho), יש למדוד את היעילות באמצעות R-T-P-C-R כדי להשוות את כמויות התמלילים שעברו שחלוף ואלו שלא, זאת במטרה לנתח את פעילות הגן התלויה במינון. יש לבצע טיטרציה של ה-morpholino המוזרק ולאפשר לעוברים להתפתח לשלב הרצוי לפני הטיפול בהם באתנול. חשיפת עוברי דגי זהב לאתנול מובילה למספר פגמים התפתחותיים וגנטיים הקשורים לפנוטיפים הנמצאים בחולייתנים אחרים.התפתחות לא תקינה של רקמות ציר, כולל Noor, מובילה ל-noord מקוצר ולעיתים קטוע, מה שמוביל בחלקו לליקויים מאוחרים יותר בסומייטים כפי שמוצג כאן. בעוד שבביקורות שלא טופלו נראה מבנה חזק בצורת V (chevron), הסומייטים שטופלו באתנול מקבלים מראה בצורת U, הנראה כאשר ישנה סיגנליזציה מופחתת של sonic hedgehog. כפי שניתן לראות כאן.השלכה נוספת של חשיפה לאתנול, שייתכן שהיא תוצאה של עיכוב התפתחותי מוקדם ופגמים עוקבים ב-Noor, היא קיצור של אורך העובר. ממצא זה דומה להתמדת מצב של טרום-בגירות וקומה נמוכה הנמצאים בילדים שנחשפו לאתנול במהלך ההתפתחות, דבר המצביע על כך שדגם דג הזברה רלוונטי להבנת מום מולד זה בבני אדם. הוכח במודלים של בעלי חיים כי חשיפה חמורה לאתנול מובילה לפנוטיפים בולטים של תסמונת אלכוהול עוברית, כולל synthia ו-opia.בדגי zebrafish, המרחק הבין-עיני (intraocular distance או IOD) קטן באופן התלוי במינון האתנול, באופן העולה בקנה אחד עם טבעו של הפגם המולדי באדם. אופיה (Opia) נמצאת רק במינונים גבוהים מאוד, אך מינונים נמוכים יותר גורמים להפחתה משמעותית ב-IOD, מה שמעיד על כך שדגם חיה זה סובל מפגם דומה בהתפתחות קו האמצע של הפנים. באיור זה, רמות הביטוי הגני המוקדמות של six three B ו-glee one מושוות בעוברים שלא טופלו ובמול עוברים שטופלו באתנול.שני הגנים הראו רמות ביטוי מופחתות בדגימות שטופלו באתנול. באמצעות כריזליזציה כפולה של NC, נותחו דפוסי הביטוי עבור six3B ו-gooID כפי שניתן לראות. כאן, שני הגנים הראו ירידה בביטוי המרחבי בעוברים שטופלו באתנול בהשוואה לבי controls לא מטופלים.מכיוון ששני הגנים מובעים ברקמות שנועדו להפוך לרקמות קו האמצע הקרניו-פציאליות, הפחתתם שמונה שעות לאחר ההפריה עולה בקנה אחד עם הפחתתו של IOD בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות. לאחר זיהוי הגנים המושפעים מאתנול, קיימים מנגנוים שבאמצעותם ניתן להגביר או להפחית את ביטויים. בדוגמה זו, הוזרק mRNA עבור sonic hedgehog, ליגנד המגביר את רמות ה-glee one, ובכך הוא הציל מהפגמים הגסים שנבעו מהפחתה ב-glee one ומהטיפול באתנול בעוברים.עם זאת, הזרקה של six three B לא הצליחה להציל את הפנוטיפ שנחשף לאתנול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את הפגמים הגנטיים וההתפתחותיים שנגרמו על ידי אתנול בעובר דג זברה בתהליך התפתחות. ניתן ליישם את הטכניקות שנעשה בהן שימוש כאן גם על אלו המעוניינים לחקור את הרעילות של תרכובות מסיסות במים אחרות בעובר חולייתים בתהליך התפתחות.

assessing-teratogenic-changes-zebrafish-model-fetal-alcohol

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

במאמר זה, עוברים של דגי זברה משמשים לבדיקת רעילות כימית. רעילות כימית מתואמת עם קריאות פנוטיפ. פרוטוקול הדגימה מציג גישה מתודולוגית לביצוע בדיקת רעילות כימית.

מסך רעילות כימית מבוסס עוברים: הערכת השפעות על התפתחות עוברים של דגי זברה

אנו מדגימים את בניית תאי אדי אלכוהול תוך שימוש בחומרים זמינים שבו זמנית בבית 6 כלובי עכבר. בנוסף, אנו מתארים את השימוש בם במודל של עכברים של חשיפת אלכוהול עוברית שווה ערך לכל 3 הטרימסטר של הריון אנושי. פרדיגמה זו חושפת את בעלי החיים במהלך הריון ולאחר לידה בימים 1-12.

בניית לשכות החמקן לחשיפת עכברים לאלכוהול במהלך המקביל של כל שלושת הטרימסטר של התפתחות אדם

מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לתאר הליכים לחשיפת חולדות לרמות מתונות של אלכוהול במהלך התפתחות המוח לפני הלידה ולכמת את השינויים הנובעים מכך בהתנהגות החברתית במהלך הבגרות.

חשיפה לפני הלידה אלכוהול מתונה וכימות של התנהגות חברתית בחולדות מבוגרות

חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ליקויים התפתחותיים חמורים.

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להתוות את הצעדים הדרושים כדי לבסס ולהשתמש במבחן העדפה חברתית עבור דג זברה בוגר ולהוכיח שניתן להשתמש בו כדי לאפיין פגמים חברתיים הנגרמים על ידי אתנול.

מידול הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי בדגי הזברה כדי לאפיין את ההשפעה של סביבה עוברית שלילית על התנהגות חברתית של מבוגרים

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות צורת הסחוס הקרניופציאלי באמצעות תוכנה חופשית (tpsDigs2, MorphoJ ו-PAST) למדידת שינויים במבנה הפנים של זחלי דגי זברה.

ניתוחים מורפומטריים של צורה: ארגז כלים לתוכנת ניתוח לכימות צורת קרניופנים בדגי זברה

למדו להעריך שינויים טרטוגניים ב-Danio rerio לאחר חשיפה לאתנול עוברית. השיטה משלבת PCR כמותי והכלאה in situ לניתוח שינויי ביטוי גנים ופגמים פיזיים בפגיות.

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

גלה סרטונים נוספים