טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים כיצד לזהות במדויק ובאופן ספציפי מטבוליטים של תחמוצת החנקן בדגימות ביולוגיות. זה מושג על ידי עיבוד דגימות דם מיד לאחר האיסוף כדי למנוע אובדן מטבוליטים או היווצרות חפצים. במקביל, מבוצע קצירת רקמות מהירה ויעילה כדי למזער את ההשפעות של סביבה היפוקסית על מטבוליטים של תחמוצת החנקן.

טבעות אבי העורקים נאספות ותלויות באמבט איברים כדי להעריך את תפקוד האנדותל שלהן. יתר על כן, בדיקות ביוכימיות משמשות לכימות רמות החנקה, רמות הניטריט והרמות היחסיות של ניטרו תיול ומוצרים אחרים רוויי ניטרו ברקמה. באמצעות מבחנים אלה, השוואה נכונה של חיות ניסוי וביקורת יכולה לייצר מידע רב ערך על ייצור וחילוף חומרים של תחמוצת החנקן.

היתרון העיקרי בשימוש בגישה רב-מערכתית זו על פני שיטות או בדיקות בודדות הוא שהדבר יאפשר תמונה רחבה יותר של ביוכימיה של תחמוצת החנקן במערכות איברים מרובות. אז נוכל להתחיל להבין לאילו מהמטבוליטים הללו עשויה להיות תועלת פרוגנוסטית או אבחנתית, וכיצד הרפרטואר של מטבוליטים של תחמוצת החנקן משקף את היווצרות וזמינות תחמוצת החנקן האנדותלית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית שכן כל שלב בתהליך הוא קריטי לשמירה על שלמות הדגימה.

חלק מהשלבים הללו אינם ניכרים במדור שיטות קריאה בכתב עת טיפוסי בגלל הפרטים הקטנים של איסוף דגימות וחילוץ רקמות. מדגים הליך זה יהיה ד"ר הונג ג'ינג. מדען מחקר בכיר במעבדה שלי לפרוטוקול זה זמין אדם או חיית ניסוי לאיסוף דם עבור חיות ניסוי שגם רקמותיהן ייבדקו.

ראשית, אסוף דם מלא על ידי החדרת מחט בגודל 25 לתוך הווריד הנבוב התחתון. לאחר שנאספו 500 עד 1000 מיקרוליטר, יש להחדיר את החיה ללא שאריות דם על ידי החדרת חיץ פיזיולוגי דרך קודקוד החדר השמאלי ולאפשר החלפת דם מלאה כאשר הדם והחיץ יוצאים דרך ה-CVA של הווריד התחתון. יש לאסוף דם ורידי בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר המכילים NEM ו-EDTA מיד לאחר האיסוף.

סובב את הדם ב-14, 300 RCF למשך שבע דקות לאחר הצנטריפוגה. שאפו את הפלזמה מכדור ה-RBC בעזרת פיפטה והעבירו אותה לצינור נפרד. הכן את דגימות הפלזמה המבודדות עבור HPLC על ידי הוספת נפח אחד לאחד של מתנול קר ל-50 מיקרוליטר מאוסף הפלזמה.

מערבולת, התערובת נמרצת במשך שלוש עד חמש שניות עד שהיא עכורה. לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת בחום של 14, 300 RCF למשך שבע דקות. כדי לזרז את חלבוני הפלזמה, אספו את הסופרנט לתוך שפופרת נפרדת של 1.5 מיליליטר ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לנתח אותו.

כדי להכין את הפלזמה לניתוח כימילומינסנציה, קח את נפח הפלזמה הנותר, שאמור להיות בסביבות 200 עד 400 מיקרוליטר ופצל אותו לשני נפחים. הכן מחצית מהפלזמה על ידי הוספת נפח של 10% של 5% סולפיד מחומצן, והמתנה של 10 דקות. דגימה זו מוכנה כעת לניתוח CLD.

הכן מחצית נוספת של הפלזמה על ידי הוספת 10% נפח של 2% כלוריד כספי לאחר חמש דקות. בטמפרטורת החדר מוסיפים נפח של 10% של סולפונמיד מחומצן. המתן עוד 10 דקות והזריק את הדגימה הזו לתוך ה-CLD כמו הפלזמה.

ניתן להכין את גלולת ה-RBC עבור HPLC ו-CLD עבור כל אחד מהניתוחים. התחל בערבוב חלק אחד של כדור תא לארבעה חלקים תמיסת ליזה היפוטונית. מערבולת את התערובת ביסודיות לניתוח CLD.

ההכנה לתאים זהה לזו שבוצעה לפלזמה. התחל בהוספת נפח שווה של מתנול. לאחר מכן מערבלים את התערובת במרץ במשך שלוש עד חמש שניות, ולאחר מכן מסובבים אותה במשך שבע דקות ב-14, 300 RCF.

כעת יש להסיר את הסופרנטנט ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לנתח אותו על ידי HPLC כדי לקבוע את רמות הרקמה של מטבוליטים של תחמוצת החנקן. ברקמות מעניינות מחיות ניסוי, תחילה יש לקצור ולהכין את הדם כמתואר בסעיף הקודם, קציר הרקמות צריך להיעשות כרגיל תוך תשומת לב מיוחדת למהירות ויעילות כדי שהרקמות לא יהפכו להיפוקסיות. לאחר האיסוף, דגימות הרקמה הומוגניות ביחס של אחד לחמש של N-E-M-E-D-T-A המכיל PBS.

לאחר מכן הכינו את הרקמות ההומוגניות לניתוח HPLC ו-CLD כמתואר בסעיפים הקודמים עבור RBCs. לאחר הרדמת עכבר בוגר עם אתר דתיל ווידוא שהוא אינו מגיב לצביטה בבוהן, בצע כריתת בית החזה. חתך בקו האמצע נעשה מעצם החזה עד לאזור הערווה כדי לחשוף את חללי בית החזה והבטן.

לאחר מכן, החדרו את החיה עם חיץ קרבס אליט מחומצן. השתמש במזרק בגודל 25 כדי להזריק את המאגר לקודקוד החדר השמאלי. עם האטריום הימני נחתך כדי לספק יציאה לדם.

לאחר הזלוף, בודדו את אבי העורקים הבטני על ידי חיתוך והסרה של הכבד, הריאות ורקמות אחרות שעלולות לכסות את אבי העורקים. לאחר מכן, החזיקו את הלב בזוג מלקחיים וחתכו את אבי העורקים מהדופן האחורית של החיה בצורה עדינה. מניחים את הלב ואבי העורקים בצלחת פטרי מלאה בקרח.

מאגר קרבס קר במנה. חותכים בזהירות ומנקים את השומן והאדוונטיציה מאבי העורקים. הימנע מפגיעה באנדותל בתוך הכלי בזמן הניקוי.

שמור על חילוף החומרים של אבי העורקים איטי כדי למנוע היפוקסיה על ידי העברתו למאגר מחומצן קר כקרח טרי כל חמש דקות. כעת השתמש באזמל כדי לחתוך את אבי העורקים למקטעים בצורת טבעת באורך שלושה מילימטרים. העבירו את הקטעים לאמבטיית איברי רקמה של ארבעה ערוצים בנפח 10 מיליליטר עמוסה במאגר קרבס מחומצן.

בעזרת כפתור המתמר יש למרוח 1.5 גרם יומרה על כל טבעת אבי העורקים. על פי ממצא אמפירי. 1.5 גרם הוא מתח ההתחלה המתאים לתפקוד כלי דם אופטימלי.

בצג העכבר והקלט את מדידת הכוח באמצעות גשר אוקטלי שמונה ערוצים ותוכנת רכישת נתונים, אפשר לטבעות להתאזן למשך 80 דקות, להחליף את המאגר כל 20 דקות, ולאחר מכן להמשיך בניסוי. לאחר שמתח הרקמות התייצב, הוסף 100 ננו-מולרי שומר לכל טבעת להתכווצות תת-מקסימלית. לאחר שמתח הטבעת התייצב ויש רמת טונוס קבועה, בצע ניתוח תגובת מינון לאגוניסט אנדותל כגון אצטילכולין.

זה יקבע את ייצור תחמוצת החנקן ואת מידת הרפיית כלי הדם. לאחר תגובת המינון לאצטילכולין, שטפו את האמבטיות עם בופר קרבס והוסיפו 100 ננו-מולרי שומר לכל אמבט איברים כדי לכווץ את הכלים. שוב, לאחר מכן קבע את ההיענות של טבעות השריר החלק למקור אקסוגני של תחמוצת החנקן כגון צד נתרן ניטרופרס עם ובלי ODQ, מעכב של ציקלאז מסיס.

גישה מסוג זה תקבע ערך הרפיה של 100% לכלי הדם וגם תדגים את האופי החיוני של גייל ציקלאז מסיס בתיווך תגובת תחמוצת החנקן להרפיית כלי הדם. מכיוון ש-ODQ ימנע את ההרפיה לנתרן ניטרו IDE בתגובה לאצטילכולין, טבעות אבי העורקים משליטה בריאה, עכברים נרגעו בעוד שטבעות אבי העורקים מעכברים עם תפקוד לקוי של האנדותל הראו הרפיה מופחתת עקב ירידה בייצור תחמוצת החנקן. בדיקות דה ניטרו ספציפיות לקבוצה נערכו גם על חיות הביקורת כימילומינסנציה של ניטריט.

RSNO ו-RNNO זוהו באמצעות בדיקת דה ניטרוס רדוקטיבית. על ידי הפחתת אזורי שיא, נמדדו רמות ניטריט ו-r sno. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תחמוצת החנקן וביולוגיה של כלי הדם, כגון כיצד רמות המחזור של מטבוליטים אלה של תחמוצת החנקן משקפות את רמות הרקמות וכיצד מטבוליטים של מחלה משתנים במצבי מחלה שונים?

קביעת ריכוזי מצב יציב ומחצית חיים של מטבוליטים רלוונטיים אלה של תחמוצת החנקן במערכות איברים מרובות ולאורך מחזור הדם של בעל חיים בודד תאפשר זיהוי של חתימות מולקולריות ספציפיות של תהליכי מחלה ותעזור לנו להגדיר שיטות טיפול חדשות המבוססות על תחמוצת החנקן, שיאפשרו לרופא להיות חמוש בסמנים ביולוגיים טובים יותר לחומרת המחלה או להתקדמותה. בדרך כלל, אנשים חדשים בתחום החומצה החנקתית יתקשו מכיוון שרבים ממזערים את הרגישות מספיק כדי לזהות ולכמת את הרמות הנמוכות הללו של חילוף חומרים של חומצה טרית הנמצאות בדגימות ביולוגיות. קודם כל, סביר להניח שאדם אחד שאינו מיומן באמנות ייצור חפצים במהלך עיבוד הדגימה שצריכים נתונים שגויים ופרשנות שגויה של הנתונים.