Name: דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: למדו כיצד לבצע דיסקציה של utricle מעכבר מבוגר ולהדביק תאי תמיכה באמצעות adenovirus. שיטה זו מאפשרת חקר ביולוגיה של תאי שיער ותהליכי התחדשות במודל in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למחקר המיפוי של המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות. תמיכה נוספת ניתן על ידי NIDCD 5R01 DC007613.

1. Utricle Dissection והתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים הבוגרת (4 שבועות ומעלה) העכבר באמצעות פרוטוקול מאושר לערוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזוז את תעלת השמע החיצונית משני צידי הראש, ומושכים את העור קדימה לכיוון האף. לחצות את ראש מהסוף להתחלה ולהסיר את המוח משני הצדדים לגלות את המבוך הגרמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הגולגולת מן שבלול גרמי ולהעביר את המבוך הגרמי (כולל בולה) על מכסה המנוע רקמת התרבות מצויד המיקרוסקופ לנתח (הערה: עבודה adenovirus יש לבצע בארון דרגת הגנה II ביולוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מכסה המנוע, כדי להעביר את כל שבלול מאכל תרבות 35mm רקמה המכילה כלי התקשורת המבתרים סטריליים (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בולה השמיעה הוא עדיין שלם (אפשר להסיר את בולה במהלך דיסקציה ברוטו ידי הוספת התמונות שלך בין בולה ואת שיאשבלול), להשתמש בשני מלקחיים (1 מס &#39;3 ו - 1 # 5) לשבור את הבולה (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את ציוני הדרך של הכנת שבלול גרמי: איפקס, בסיס, ossicles, חלונות סגלגלים בסיבוב השמיני, שורש העצב, תעלות בצורת חצי עיגול (איור 1 ג&#39;, ד &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האוזן הפנימית בצלחת עם הצד המדיאלי כלפי מעלה, כך חלונות סגלגלים עגול איפקס הם בתחתית המנה, שורש העצב השמיני הוא פונה כלפי מעלה. החזק את ההכנה באמצעות מספר # 3 מלקחיים באזור של תעלות בצורת חצי עיגול (איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל מצויד בלהב # 11, לנתק את שיאו של שבלול הפסגה רק כדי שורש העצב (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ההכנה כך הוא חתך את החלק פונה כלפי מעלה. השתמש תעלה חצי עגול ידית קדמית כמו לייצב את ההכנה (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספר 5 מלקחיים, להסיר את השבלול על כישור את מטהלבסיס. בנקודה שבה האזור וו של שבלול פונה כלפי מטה, השתמש בדיקה בסדר (מחצית מספר # 55 מלקחיים שבורים) להרים את המדף הגרמי האחרון של lamina ספירלה גרמית (איור 1F), חושפת את שקיק. מתחת שקיק היא מדרגת משורת, שהוא ציון דרך חשוב. Utricle צמוד מיד מדרגת משורת (איור 1G), והוא מוקף העצם. השתמש בדיקה לשבב העצם במרחק מספיק כדי לחשוף כ 1/3 של utricle. מוציאים בזהירות את utricle באמצעות מס &#39;55 מלקחיים (איור 1H). הליך זה יהיה בדרך כלל תוצאה של הסרת האפיתל גג פיגמנט כמו utricle נמשך מן הכנת גרמי. עם זאת, אם utricle מוסר האפיתל עם גג שלם, הגג ניתן להסיר באמצעות מס &#39;55 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles עבור זיהום adenovirus (או ניסויים הדמיה חי) חייב להיות מוסר במהלך otoconia לנתיחה (לפני ההדבקה).במקרה זה, להשתמש במזרק luer נעילת כי הוא מלא עם התקשורת הניתוח, מצויד במחט קטנה בקוטר (בדרך כלל 26-28 מד). החזק utricle בקצה באמצעות מס &#39;55 (איור 1i מלקחיים). להביא את קצה המחט קרוב utricle עם שיפוע של המחט כלפי מטה. השתמש זרם של התקשורת לנתח לפוצץ את otoconia (איור 1J). לחלופין, otoconia ניתן להסיר על ידי צחצוח אותם באמצעות כלי עפעף (טד פלה, Inc # 113). Utricles שלא הולכים לעבור זיהום adenoviral הם בדרך כלל תרבותי חופשי צף 24 גם צלחות עם תרביות רקמה otoconia שלמים (ראה להלן להסרת otoconia שלאחר התיקון, שהוא קל יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל utricles הם גזור, לשנות את התקשורת המבתרים לתרבות התקשורת סטרילית: DMEM F12 (Gibco # 11320) בתוספת 5% FBS ו 50 יח&#39; / מ&quot;ל ​​פניצילין G (Sigma). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles מתורבתים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אם הם תרבויות להיות maintaעומד לבחינה במשך יותר מ 48 שעות, 1/2 של התקשורת תרבות יש לשנות כל שני וחמישי. תרבויות יכול להישמר במשך שבוע או יותר. </li></ol> 2. Adenovirus זיהום של תאים תומכים חשוב: עבודה עם adenovirus דורש רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) נהלים הסמכה. בדוק עם מנהל מוסדי biosafety שלך כדי לקבל הדרכה והכשרה על BSL2 ההליכים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח utricles לעיל בתקשורת דיסקציה (אין סרום). הסר otoconia לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להדביק, להעביר 1 utricle (תאים שיער למעלה) לבאר כל אחד Nunc מיני מגש (פישר # 12-565-68) המכיל 15 μL סרום ללא DMEM F12 (זה חשוב כי בסרום יכול להשבית את הנגיף) . העברה זו קל יותר עם 1.5 מ&quot;מ microcurette (# 10082-15 מ כלי מדעי בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלנו Ad-GFP הוא סרוטיפ 5 עם הגנים E1 ו-E3 ויראלי שנמחקו מקדם האדם CMV נהיגה transgמז (GFP). וירוס זה התקבל וקטור Biolabs (פילדלפיה, פנסילבניה <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). וירוסים המניות ניתנים titers של 1.0-4.0 × 10 10 PFU / מ&quot;ל. הוסף 0.5-2 μl של וירוס המניות זה טוב המכילים utricle (איור 1 ליטר). הסכום בפועל משמש משתנה בהתאם כייל הנגיף ומלאי. אנחנו בדרך כלל להדביק כל utricle עם 1.0-4.0 × 10 7 PFU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות utricles של הנגיף, המכיל התקשורת ב 37 ° C / 5% CO 2 למשך 2 שעות. לאחר 2 שעות, להעביר את utricles חזרה צלחת 24 גם רקמת התרבות המכיל התקשורת והתרבות עם סרום. התרבות utricles לילה ב 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles ניתן להשתמש למחרת לניסויים הדמיה חיים, או שהם יכולים להיות קבוע עבור immunochemistry תא השיער (ראו להלן). נגיפי ביטוי transgene עליות לאורך זמן, כך שאם ביטוי transgene נמוך ב 24 שעות שלאחר זיהום או כךמועיל תאים תרבות נוספים 24 שעות סרום המכיל התקשורת. אם אתה רואה תא רעילות שיער, להפחית את כמות הנגיף בשימוש. </li></ol> 3. קיבוע Utricle, הסרת Otoconia, ו Immunochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף התקופה תרבות, לתקן utricles ב paraformaldehyde 4% גם עבור 3 שעות בחדר זמני (על פלטפורמת נדנדה) או לילה ב 4 ° C. שטפי utricles (3 פעמים, 15 דקות כל אחת) ב 0.1 מ &#39;(1X) pH של Sorensen חיץ פוספט 7.4. פעולות אלה מבוצעות צלחת 24 גם בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת Otoconia: הערה: Otoconia יש להסיר לפני ההדבקה adenovirus (ראה שלב 1.11 לעיל). עם זאת, utricles שאינם להידבק יכול להיות מתורבת וקבוע עם otoconia עדיין שלם. במקרה כזה, בצע את הפעולות המתוארות כאן כדי להסיר את otoconia לאחר קיבוע. בדוק utricles על אפיתל הגג הנותר כל פיגמנט. מוציאים בזהירות את כל האפיתל הגג הנותר באמצעות 2 # 55 וorceps. כדי להסיר את otoconia, להחליף את מאגר פוספט של Sorensen עם 750-1000 μl Cal-Ex במסיר אבנית (פישר # CS510-1D). השאירו Cal-Ex על utricles דקה 1 ו 40 שניות (לא יעלה על 2 דקות). החלף Cal-Ex עם חיץ פוספט 0.1 M של Sorensen ו לשטוף (5 פעמים, 5 דקות כל אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה utricles ב borohydride נתרן (Sigma # 452882, 1% במים deionized) במשך 10 דקות. לשטוף utricles במאגר פוספט 0.1 M של סורנסן (5 פעמים, 5 דקות כל אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles מקום לבלום פתרון (PBS + 2% שור סרום אלבומין + 0.8% עיזים סרום רגיל + 0.4% טריטון X-100) במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים ראשוניים דגירה לילה ב 4 ° C. נגד שרירן 7 א (או פרוטאוס Biosciences # # 25-6790 או MYO7A 138-1 מ התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק) בשעה 1:100 בחסימת תוויות פתרון כל התאים שיער. כדי לתייג בנפרד תאים שיער striolar ולא striolar, השתמשנו פעמיים תווית protocoאני עם חד שבטי נגד calmodulin (Sigma C # 3545, 1:150) ו polyclonal נגד calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, קליפורניה, ארה&quot;ב, 1:200). נוגדנים משני (בדרך כלל Alexa נוגדנים פלואוריד משניים מצומדות של Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה, ארה&quot;ב) הם מדולל 1:500 לבלום פתרון מודגרות במשך 4 שעות בחושך בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר utricles על שקופיות הזכוכית באמצעות Fluoromount-G (דרום ביוטק, בירמינגהם, אל על, ארה&quot;ב). </li></ol> 4. נציג תוצאות Utricles תרבותי באמצעות שיטה זו שומרים מלא משלים של שני תאים שיער ותאים תומכים (איור 2). תאים שיער בתרבויות בריאים הצגת פרופילים גרעיני עגולים מוקפים אזורים cytoplasmic דקים כי הם שרירן 7 א חיובי (איור 2, לוח למעלה). התאים התומכים (תווית עם אנטי Sox2) הם קטנים יותר וצפופות יותר מאשר תאי שיער (איור 2, לוח נמוך יותר). ADEnovirus מדביק 25-50% מהתאים התומכים ב utricle, ולא בתאי השיער נגועים (איור 2, Ad-GFP לוחות). יש לציין כי titer עבודה אופטימלית של כל adenovirus צריכה להיקבע באופן אמפירי, שכן התא למוות שיער אפשרי אם כייל הנגיף הוא גבוה מדי. בנוסף, אזורים של נזק מכני (שנגרם במהלך דיסקציה) ייקח את כמויות גדולות של הנגיף. אלו אזורים של נזק מכני הם להבחין בקלות בקו רציף של תאים עם רמות גבוהות מאוד של ביטוי ה-GFP ותאי שיער חסר. זאת בניגוד לביטוי GFP מפוזר בתמיכה של התרבות תאים פגומים (תרשים 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Utricle Dissection. :. שמיעתית בולה (AB) ב &#39;:. בולה שבור באמצעות שתי מלקחיים חסון C: שבלול בוני (RW = חלון עגול, S =. העורק stapedial, C = שבלול, St = משורת) D: להב סכין המנתחים (SB) משמש כדי לנתק את שיאו של שבלול הפסגה לעצב הגולגולת השמיני (8 ה N) ASC = תעלה חצי עגול הקדמי E..: ההכנה נערכת היטב באמצעות מספר # 3 מלקחיים במזלג 1 מוכנס לתוך התעלה חצי עגול הקדמי (ASC) והשני על העצם החיצונית (החצים). מבוך קרומי מוסר באמצעות מלקחיים F:. עם מבוך קרומי הוסר, בתורו הבסיסי של lamina ספירלה גרמית גלוי ליד האזור וו. בדיקה בסדר מוכנס מתחת למדף הזה גרמי להרים את המדף למעלה להסיר אותו (חץ) G:. לאחר הסרת שקיק, utricle (U) גלוי צמוד מיד מדרגת משורת (SF) H:. Utricle (U ) מוסר באמצעות מספר # 55 מלקחיים (חץ) SF = המדרגה משורת אני:.. Utricle עם otoconia (O) הוסר חלקיתד חושיות (SE) אפיתל מתחת לעין J:. Otoconia (O) יוסרו utricle באמצעות זרם של התקשורת מועברים על ידי מזרק מצויד במחט 26-מד. צל של מחט (S) נראה בתחתית התמונה K:. Utricle עם otoconia להסיר אפיתל סנסורי (SE) L גלוי:. זיהום adenoviral: כל utricle (U) ממוקם הפרט היטב מיני מגש. תאים התומכים נגועים adenovirus ידי pipetting וירוס טוב (P = עצה Pipet). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Adenovirus בתיווך זיהום של תאים תומכים. Utricles נדבקו ביטוי adenovirus המניע של חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ad-GFP). המוצגים הם תמונות confocal של שכבת שיער התא שכבת תאים תומכים באותו אזור של utricle 1. תאים שיער מסומנים עם נוגדנים נגד 7 א שרירן(מג&#39;נטה). תאים התומכים מסומנים עם נוגדנים נגד Sox2 (אדום). סכמטי מראה את המבנה של האפיתל חושית utricle ואת המיקומים של תאים שיער (HC) ותאים תומכים (SC). מיקומם של (אופטי) סעיפים confocal המוצגים העליון (U) ונמוך (L) לוחות מסומנים על ידי קווים מקווקווים ב סכמטית. לוחות בפסגה: בתמונות שצולמו confocal ברמה של גרעין התא שיער, Ad-GFP האות מופיע הרווחים בין התאים שיער אינו חופף עם 7 א תא שיער סמן שרירן. לוחות תחתון: בקטעים confocal ברמה של גרעין התא תמיכה, Ad-GFP האות colocalizes עם סמן את התא תמיכה סוקס-2. Ad-GFP תוצאות זיהום בביטוי GFP בתמיכה תאים בלבד, ולא בתאי השיער נגועים. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. זיהום adenoviral לא לגרום למוות של תאים שיער או תאים תומכים. אוטricles נדבקו GFP-Ad ב 4 × 10 8 PFU / מ&quot;ל. Utricles תויגו עם נוגדנים כנגד 7 א שרירן (תא סמן שיער) ו Sox2 (תמיכה סמן התא). תא שיער ספירת תאים התומכים היו שווים עבור utricles בקרה Ad-GFP utricles נגועים.

<ol><li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li>
<li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li>
<li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+lateral+line+and+mouse+%28Mus+musculus%29+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li>
<li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li>
<li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li>
<li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+death+and+regeneration%3A+two+halves+of+the+same+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li>
<li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li>
<li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li>
<li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+activation+of+ERK1%2F2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li>
<li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li>
<li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li>
<li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li>
<li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li>
<li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+%28HSP32%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors%2C+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment%2C+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li>
<li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li>
<li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תאים שיער חושי רגישים המוות שנגרמו על ידי מגוון רחב של לחצים, כולל הזדקנות, טראומה רעש, חשיפה לתרופות ototoxic, כולל אנטיביוטיקה aminoglycoside ו ציספלטין סוכן antineoplastic. אצל יונקים תאים שיער תוצאות המוות אובדן שמיעה קבוע ו / או הפרעות שיווי משקל. במערכות מודל במבחנה הם כלים קריטיים עבור מחקרים שמטרתם לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסלולר הנייד המוות שיער, כמו גם אלה נועדה למנוע או היפוך התא למוות שיער . שלא כמו תאים שיער שבלול של יונקים בוגרים, תאים ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בינונים 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טוב מלקחיים (# 55)</td&gt;<td&gt; מדע הגדרות יפות</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טוב מלקחיים (# 5)</td&gt;<td&gt; מדע הגדרות יפות</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מלקחיים (# 3)</td&gt;<td&gt; מדע הגדרות יפות</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פניצילין G</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בסרום שור עוברית</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc מיני מגש</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; וקטור Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex במסיר אבנית</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נתרן borohydride</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד שרירן 7 א (polyclonal)</td&gt;<td&gt; פרוטאוס Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד שרירן 7 א (חד שבטי)</td&gt;<td&gt; התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד calmodulin</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; דרום ביוטכנולוגיה Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; טבלה 1</strong&gt;. ריאגנטים וכלים המשמשים בתרבות utricle וזיהום adenovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * הערה: Ad-GFP מסופק בדרך כלל על כייל המניות של 1x10 ידי Biolabs וקטור<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / מ&quot;ל. ביקשנו הגברה אישית על מנת לספק את הנגיף המניה ב כייל של 1.2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / מ&quot;ל.</p&gt;

דיסקציה של utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

אובדן שמיעה והפרעות מאזן נגרמות בדרך כלל עקב מותם של תאים שיער mechanosensory, שהם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. מכיוון שאין קו התא באופן משביע רצון מייצג תאים שיער יונקים, מחקר על תאים שיער מסתמך על תרבויות איברים ראשוניים. ביותר המאופיין במערכת מודל במבחנה של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים (איור 1) 1-6. Utricle הוא איבר שיווי המשקל, ואת בתאי השיער של utricle דומים במבנה והן בתפקוד לתאי שיער באיבר השמיעה, האיבר של קורטי. עכבר מבוגר הכנה utricle מהווה האפיתל חושית בוגרת לימודי של אותות מולקולריים המווסתים את הישרדות, הומאוסטזיס, ומוות של תאים אלה. יונקים תאים שיער שבלול הם מובחנים סופני ואינם מחדש כאשר הם הולכים לאיבוד. שאינם לאמאחוליות malian, שמיעה או מוות שיווי המשקל תא השיער מלווה התחדשות חזקים אשר משחזר השמיעה ושיווי המשקל פונקציות 7, 8. התא התחדשות שיער מתווך על ידי גליה דמויי תאים תומכים, אשר קשר עם משטחים basolateral של תאים שיער ב האפיתל חושי 9, 10. תאים תומכים גם הם מתווכים חשובים של הישרדות שיער התא ומוות 11. פיתחנו לאחרונה טכניקה זיהום לתמוך תאים בתרבית באמצעות utricles adenovirus. באמצעות סוג adenovirus 5 (dE1/E3) כדי לספק transgene המכיל GFP בשליטת היזם CMV, אנו מוצאים כי adenovirus במיוחד וביעילות מדביק תאים תומכים. תמיכה דלקת יעילות התא הוא כ 25-50%, ותאי השיער לא נגועים (איור 2). חשוב לציין, אנו מוצאים כי זיהום adenoviral לתמוך תאים לא לגרום רעילות לתאי השיער או תאים תומכים, כמו ספירת תאים ב Ad-GFP infutricles ected שקולים לאלה שאינם נגועים utricles (איור 3). כך adenovirus בתיווך ביטוי גנים בתמיכה של תאים בתרבית utricles מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את התפקידים של תאים תומכים כמתווכים של הישרדות שיער התא, מוות והתחדשות.

תאים שיער Mechanosensory הם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. ביותר המאופיין<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת מודל של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים. אנו מציגים דיסקציה של utricle עכבר מבוגר, ואנחנו מראים adenovirus בתיווך זיהום לתמוך תאים בתרבית utricles.

דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים

אובדן שמיעה והפרעות בשיווי המשקל נגרמים לעיתים קרובות כתוצאה ממוות של תאי שערה מכנו-סנסוריים (mechanosensory hair cells), שהם תאי הקולטן של האוזן הפנימית. מכיוון ש...

מצגת זו היא הדגמה של הפרוצדורות לתרביות של איברים שלמים של ה-utricle מעכברים בוגרים. כמו כן, תוצג השימוש באדנו-וירוס להדבקה של תאי תמיכה ב-utricle בתרבית. הדבר משיג תחילה על ידי דיסקציה קפדנית של ה-utricle מהאוזן הפנימית.השלב השני הוא הסרת אפיתל התקרה. לאחר מכן, מסירים את האוטוקוניות (otoconia), תוך השארת האפיתל החושי שלם. השלב האחרון הוא הדבקה של התאים התומכים של העטריקולה (utricle) באמצעות אדנו-וירוס.ניתן להשתמש בטכניקות אלו במגוון רחב של ניסויים שנועדו לבחון תאי שיער ותאי תמיכה בוגרים של יונקים. In vitro. תאי הקולטנים החושיים באוזן הפנימית נקראים תאי שיער, ותאים אלו אחראים להמרת אנרגיית קול או תנועת ראש לקלט עצבי המועבר למוח.אובדן שמיעה נגרם לעיתים קרובות כתוצאה ממותם של תאי השערה החושיים הללו. על מנת לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס מות תאי השערה חושיים, שימוש במערכת מודל in vitro הוא מועיל מאוד. השיטה שנגלה כאן משתמשת בתרביות של איברים שלמים של utricle מעכברים בוגרים.ה-utricle הוא איבר וסטיבולרי באוזן הפנימית, ותאי השערה של ה-utricle דומים לתאי השערה באיבר השמיעה, הנקרא organ of Corti. תכשיר ה-utricle הוא מערכת המודל המאופיינת ביותר למחקר של תאי שערה ותאי תמיכה מיונקים בוגרים. בנוסף, נדגים שיטה שמעבדתנו פיתחה לאחרונה לשימוש באדנווירוס להדבקת תאי התמיכה של ה-utricle.טכניקת האדנווירוס מאפשרת לנו לבחון את תפקידם של תאי התמיכה כמתווכים של הישרדות, מוות והתחדשות של תאי שיער. אנו משתמשים בטכניקות אלו במעבדתנו כדי לענות על שתי שאלות מרכזיות. ראשית, מהם האותים התאיים והמולקולריים הקובעים האם תא שיער תחת עקה יחיה או ימות בסופו של דבר?ושנית, כיצד נוכל להשתמש במידע זה כדי לפתח טיפולים, טיפולים קליניים למניעה או להפיכה של אובדן שמיעה? לינדסיי מיי (Lindsey Maye), ביולוגית במעבדה שלי, תדגים את הטכניקות הללו. הדגמה חזותית של דיסקציית ה-utricle היא חשובה מכיוון שהרקמה קטנה ושבירה, והיא רגישה מאוד לנזק מכני, במיוחד במהלך השלבים של הסרת ה-otoconia ואפיתלליום התקרה.לאחר הרדמה וה decapitation של עכבר בוגר, בהתאם לפרוטוקול לטיפול ושימוש בבעלי חיים שאושר על ידי המוסד, חלקו את הגולגולת מה-occiput לכיוון הרוסטרלי והוציאו את המוח משני החצאים כדי לחשוף את המבוך העצמי. לאחר מכן, גזרו את הגולגולת מהשבלול העצמי והעבירו את המבוך העצמי לכלי תרבית רקמות בנפח 35 מילימטר המכיל מצע סטרילי, 1 99. אם ה-auditory bulla עדיין שלמה, השתמשו בשתי פינצטות חזקות כדי לשבור אותה.הקדישו רגע לזיהוי נקודות האסון של ההכנה הגרמית, כולל בסיס השיא (apex base), החלון הביצתי (oval window), החלון העגול (round window), שורש העצב השמיני והתעלים חציוי-מעגליים כפי שניתן לראות בתמונות אלו המופיעות בפרוטוקול הכתוב; כווןו את ההכנה בתוך הצלחת כך שהעצמיקיות יהיו בתחתית הצלחת ושורש העצב השמיני יפנה כלפי מעלה. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק את ההכנה באזור התעלים חציוי-מעגליים, ובאמצעות סכין מנתחים עם להב מספר 11, חתכו את שיא השבלול (apex of the cochlea) ממש מעל שורש העצב. השתמשו בתעל חציוי-מעגלי קדמי כתושבת לייצוב ההכנה, וסובבו אותה כך שהחלק החתוך יפנה כלפי מעלה.כעת, בעזרת פינצטה מספר 5, הסר את השבלול (cochlea) מגובה המודיוס (modiolus) ומטה עד לבסיס. לאחר מכן, השתמש בגשש עדין העשוי מחצי זוג פינצטות מספר 55 כדי להרים את המדף הגרמי האחרון של הלמינה הספירלית הגרמית (osseous spiral lamina). כדי לחשוף את ה-S, מתחת ל-S נמצאת פלטת הרגל (footplate) של הסטפס (stapes).תמונה זו מציגה את פלטת הרגל של השטרפס (stapes footplate) המסומנת כ-sf, המהווה נקודת ייחוס חשובה לזיהוי מיקומו של העוטריקול (utricle) המסומן כ-U, הנמצא סמוך לה מיד. השתמשו במ probes עדין כדי לשבב מספיק עצם כך שכשליש מהעוטריקול ייחשף. לאחר מכן, באמצעות פינצטה מספר 55, הסירו בזהירות את העוטריקול על ידי תפיסתו קרוב מאוד לקצה או בשורש העצב.אם אפיתל הגג הפיגמנטרי עדיין צמוד לאוטריקולה (utricle), יש להסירו באמצעות פינצטה עדינה. אם האוטריקולות מיועדות להדבקה באדנו-וירוס, יש להסיר את האוטוקוניה (otoconia) כדי לבצע זאת. מלאו מזרק בנוזל דיסקציה והרכיבו מחט בכילוי (gauge) 26 או 28.החזיקו את ה-utricle בקצה באמצעות פינצטה מספר 55 ואת ה-otoconia באמצעות זרם של מדיום. לחלופין, ניתן להסיר את ה-otoconia באמצעות כלי ריסון. לאחר שכל ה-utricles נשלפו, החליפו את מדיום הדיסקציה במדיום תרבית סטרילי והניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.כל הנהלים העוסקים באדנווירוס מבוצעים בהתאם לאמצעי זהירות של רמת בטיחות ביולוגית 2. בעת ההכנה להדבקה, השתמש במיקרו-קיורט כדי להעביר תאי שערה של utricle לבאר אחת במגש מיני המכיל 15 µL של serum free D-M-E-M-F 12. הוסף 1 עד 4 כפול 10⁷ plaque forming units של אדנווירוס לבאר המכילה את תרבית ה-utricle.מדביקים את ה-u trickles במדיום המכיל נגיפים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%carbon dioxide בתא לח, למשך שעתיים. לאחר שעתיים, מעבירים את ה-u trickles לפלטת תרבית רקמה של 24 בארות המכילה מדיום תרבית עם סרום. לאחר ההעברה, מתרבים את ה-U trickles שוב למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%carbon dioxide.ניתן להשתמש באוטריקולות (Utricles) למחרת לניסויי דימוי חי, או שניתן לקבע אותן לצורך אימונוכימיה. מקבעים את האוטריקולות ב-4%Para aldehyde על פלטפורמת נדנדה למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C. לאחר מכן, שוטפים את האוטריקול שלוש פעמים, למשך 15 דקות בכל פעם, בבופר פוספט של Sorensen בריכוז 0.1 molar.אם האוטוקוניות (otoconia) לא הוסרו לצורך זיהום באדנווירוס, הסרו אותן בשלב זה על ידי טבילת העטריקל (utricle) ב-calx decalcify למשך אחת עד שתיים דקות, ולאחר מכן שטפו עם בופר סורנס ופוספט 0.1 molar. טבלו את העטריקל בתמיסת חסימה (blocking solution) למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב החסימה, דללו את הנוגדן הראשוני בתמיסת החסימה. הוסיפו לצלחת המכילה את העטריקלים והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.למחרת, שטפו את ה-U trickles וה-sorens ובופר פוספט. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני המדולל בתמיסת חסימה והדגירו למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר על פלטפורמת ניעור, תוך הגנה מאור. לבסוף, קבעו את ה-utricle על למסלחות זכוכית באמצעות flora Mount G. תמונות קונפוקליות אלו מציגות את שכבת תאי השערה ואת שכבת התאים התומכים באותו אזור של utricle אחד שהודבק ב-adenovirus המניע ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק.תאי שיער מסומנים עם נוגדן נגד myosin seven A, המופיע בצבע מגנטה. תאי תמיכה מסומנים עם נוגדן נגד socks two, המופיע כאן בצבע אדום. ניתן לראות כי adenovirus GFP ממוקם בתאי תמיכה ולא בתאי שיער.גרף זה מדגים כי זיהום אדנו-ויראלי באמצעות adenovirus GFP בריכוז של 4×10⁸ plaque forming units per milliliter אינו גורם למותם של תאי השערה או תאי התמיכה. ברגע שהנתיחה נלמדת היטב, ניתן להעביר שתי שבלולות מבעל חיים אחד לתרבית תוך 10 עד 15 דקות.עם זאת, חשוב לזכור בעת פיתוח פרוצדורה זו להקדיש את הזמן הדרוש ולנהוג בזהירות בטיפול ברקמה לאחר ביצוע הפעולה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימוי קונפוקאלי של תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה, R-T-P-C-R ו-Western blotting, כדי לבחון שאלות הנוגעות למות, הישרדות והתחדשות של תאי תמיכה ותאי שיער. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן ביצוע הדיסקציה של ה-utricle והדבקת תאי תמיכה באמצעות adenovirus.זכרו כי עבודה עם נגיפים עלולה להיות מסוכנת, ויש להקפיד תמיד על אמצעי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (biosafety level two) בעת ביצוע נהלים אלו.

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

הגישה הכירורגית הפוסט-אפרכסת המתוארת מאפשרת אספקה מהירה וישירה לשבלול העכבר scala tympani תוך מזעור אובדן דם ותמותת בעלי חיים. ניתן להשתמש בשיטה זו לטיפול בשבלול באמצעות העברה מולקולרית, פרמקולוגית וויראלית לעכברים לאחר לידה דרך קרום החלון העגול.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.

Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

כאן נתאר canalostomy הליך המאפשר משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו neonatal דרך תעלת semicircular במינימום נזקים לפונקציה שמיעה ואת שיווי המשקל. בשיטה זו ניתן לחסן וקטורים ויראלי, פרמצבטיקה, מולקולות קטנות לתוך האוזן הפנימית העכבר.

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

Organotypic תלת מימדי התרבויות של מאתר utricle, שבלול ב שטיחות נקה קולגן אני ג ' לים שימור רקמות מולדת מורפולוגיה לאפשר גירוי מכני באמצעות התאמה של מטריקס נוקשות, אישור המסירה הגן וירוס בתיווך.

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייצור והאפיון של אורגנואידים אורותליאליים של עכברים, תוך מחיקות בגנים בעלי עניין. השיטות כוללות קצירת תאי אורותל של עכבר, התמרת ex vivo עם אדנו-וירוס המניע את ביטוי Cre עם מקדם CMV, ואפיון in vitro כמו גם in vivo .

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

למדו כיצד לבצע דיסקציה של utricle מעכבר מבוגר ולהדביק תאי תמיכה באמצעות adenovirus. שיטה זו מאפשרת חקר ביולוגיה של תאי שיער ותהליכי התחדשות במודל in vitro.

דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים

גלה סרטונים נוספים