Name: ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למד שיטה לבידוד וניתוח פנוטיפי של תאי גזע hematopoietic ממח עצם עכברים באמצעות הפרדה מגנטית וציטומטריית זרימה. הטכניקה מאפשרת אפיון תאים טהורים לחקר תפקודי in vitro ו-in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים Nobuyuki Onai, היטושי Takizawa ומרקוס Manz לייעוץ יקר. עבודה זו מומנה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, השוויצרי סרטן הליגה Fondazione Ticinese לכל la RIcerca sul Cancro.

1. הכנת תרחיף תאים ממח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר ולמקם את בעל החיים בסיר נירוסטה ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל הגב. איסוף עצם הירך לבין עצם השוק מן הרגליים האחוריות, ואת עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את כל שאריות מדויק של רקמות רכות של עמוד השדרה עם מספריים קצה חד לבין מעצמות הרגליים עם גזה. חנות הכלים צינור 50 פלקון מ&quot;ל עם 30 מ&quot;ל של מדיום RPMI המכיל 10% מומת חום בסרום שור עוברית (FBS), השלימו עם 50 mercaptoethanol β-מיקרומטר, 100 מיקרומטר ממ לא חיוניות חומצות אמינו, 1 MEM mM פירובט נתרן, 2 mM L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את תחתית מרגמה מעוקר בעבר עם מסנני סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העצמות אל תוך המדוכה ומכסים אותם בשכבה של מסננים על מנת להרכיב שטח החיכוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל צינור פלקון מסופק עם מסנן פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסק את העצמותבעזרת העלי עד קבלת ההשעיה התא הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ל מרגמה 5 של המדיום RPMI טרי שלם לכבס למסוק את התאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שתי הנקודות האחרונות עד עצמות ומעורים נראה ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר ולסנן בצינור חדש ההשעיה התא כדי לחסל את פסולת ברקמות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע תא גלולה. </li></ol> 2. פנוטיפי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ולשטוף בתאים של עכברים בודדים 15 מ&quot;ל של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות גלולה של 5 מ&quot;ל PBS ו 2% FBS ותאי הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 × 10 6 תאים / גם בתחתית בארות 96 עגולצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צלחת בסל&quot;ד 1500 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם המצוין PBS ו - 2% FBS להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C-Kit מצומדות כדי APC 1:100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי ביוטין 1:50 Sca1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי FITC 1:50 CD34 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי PE 1:100 FcγR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-7R מצומדות ל PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ולהוסיף 50 μL תמהיל מבז היטב כל אחד מהם. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צלחת בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant ידי צלחת היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל streptavidin ב PBS ו - 2% FBS כמצוין להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin conjuמגודרת כדי APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL הפתרון היטב כל אחד מהם. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צלחת בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μL 100 של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות ב FACS. </li></ol> 3. העשרה המגנטי של C-Kit + תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מאגר המכיל PBS, pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), ו 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה של העצם הדלועים נגזר לפחות 10 עכברים 1 מ&quot;ל של תמיסת מאגר המכיל C-Kit MAB מצומדות כדי APC בדילול 1:50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים את התאים עם 40 מ&quot;ל של תמיסת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר tהוא supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ולהוסיף 50 μl של Anti-APC microbeads על העכבר בכל להרדים ישירות גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי הוספת 40 מ&quot;ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות בסל&quot;ד 1500 דקות 5. Aspirate supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב כפולה של 4 מ&quot;ל של הפתרון למאגר כל שלושה עכברים להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום MACS טורים LS בשדה המגנטי של מפריד MACS מתאים. 1 השתמש בעמודה אחת לשלושה עכברים להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו עמודות על ידי שטיפה עם 4 מ&quot;ל של תמיסת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ההשעיה התא על העמודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים שהוסרו מהן תוויות העוברים ולשטוף טור עם 4 מ&quot;ל של תמיסת המאגר. לבצע פעולות כביסה ידי הוספת 4 מ&quot;ל של תמיסת חיץ שלוש פעמים. הוסף חוצץ חדש כאשר המאגר טור מתרוקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של עמודות מ מפריד ו placה כל אחד על גבי 15 צינורות מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 4 מ&quot;ל של תמיסת חיץ על כל עמודה. מיד לשטוף את התאים המסומנים מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינורות בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה עם 1 מ&quot;ל של תמיסת חיץ כדורי קבוצתיות צינור יחיד פלקון 15 מ&quot;ל. </li></ol> 4. מיון של בתאי גזע hematopoietic ואת אבות מסורים השושלת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם כפי שעולה 500 PBS μL ו FBS 2% להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C-Kit מצומדות כדי APC 1:100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCA-1 מצומדות כדי ביוטין 1:50 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי FITC 1:50 CD34 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי PE 1:100 FcγR </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור מ לשנים הקודמותשל סעיף בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת מבז כדי גלולה. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים את התאים עם 14mL של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל streptavidin כמפורט 500 PBS μL ו 2% FBS להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin מצומדות כדי APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הפתרון הצינור. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים את התאים עם 14 מ&quot;ל של PBS ו - 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μL 500 של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר ולסנן את ההשעיה תא צינור חדש 5 מ&quot;ל כדי אליminate אגרגטים הסלולר זה יכול להפריע הליך המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL של 7-AAD (להשתמש בו בדילול 1:100) על השעיית התא על מנת להוציא 7-AAD + מתים תאים ממוינים האוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תאים עם FACSAria BD פי פנוטיפים את הבאים: <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LKS תאים: לין - C-Kit + SCA-1 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LT-HSCs: LKS CD34 - </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ST-HSCs: LKS CD34 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GMPs: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוכה גבוהה CD34 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברי הפרלמנט האירופי: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוך נמוך CD34 - </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CMPs: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוך נמוך CD34 + </li></ul></li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג ודוגמא הליך gating אלקטרונייםהנפוצים הציון אבות הלימפה (CLPs) כמו - לין / c-Kit וראה זה / אינטרלוקין (IL)-7R + תאים, לין - / c-Kit + / SCA-1 + (LKS) ולין - / c-Kit + / SCA וראה זה -1 (C-Kit +) תאים, מ C-Kit + שער, אבות מיאלואידית משותף (CMPs) מזוהים FcγR וראה זה CD34 + תאים, אבות granulocyte / מונוציטים (GMPs) כמו FcγR היי CD34 + תאים megakaryocyte / אבות כדורית אדומה (חברי הפרלמנט האירופי) כמו FcγR Lo CD34 - תאים, משער LKS, LT-HSC ו ST-HSC מזוהים CD34 - ו CD34 + תאים, בהתאמה. מח העצם זו ההשעיה התא יכול להיות מועשר על C-Kit + תאים עם חרוזים מגנטיים (איור 2): LT-HSC ו ST-HSC לאחר מכן ניתן למיין על פי ביטוי CD34, כמו גם אבות אחרים על פי הפנוטיפ המתואר לעיל. HSCs יכולה להיות אנה<html> lyzed במיקרוסקופ הדמיה חיה confocal כפי שמוצג באיור 4, שם CD34 - תאים הוכתמו מתחם נוקלאוטיד מחייב quinacrine 11 כמו גם הגרעין האדום (DRAQ5). ב HSCs, אבל לא GMPs, quinacrine חיובי שלפוחית ​​נראים 12 הציטופלסמה. יתר על כן, HSCs מיון יכול לשמש בניסויים פונקציונליים כמו הפגינו 5 דמות, אשר מציג את העלייה cytosolic Ca 2 + ב HSC-LT ידי הפעלת קולטנים-P2 purinergic בחשיפה טריפוספט-אדנוזין (ATP) ו ionomycin 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> באיור 1. נציג ניתוח נקודה העלילה של לין-BM תאים. הליך gating אלקטרונית על cytometer זרימת לזהות להבקיע אבות hematopoietic ו HSCs מן ההשעיה מח עצם התא מוכתם כמתואר בטקסט פרוטוקול. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. תוכנית להעשרת סלקטיבית של C-Kit + תאים ממח העצם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> איור 3 מחזור התא ניתוח אלקטרונית LKS סגורות CD34 -. HSCs ב בריאים ועכברים עם IBD מוכתמים נוגדנים-67 קי ו DAPI. התאים היו קבועים permeabilized עם Lyse / תקן ו פרם מאגרים ואחריו מכתים עם מצומדות FITC Ki-67 ו DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. תאים רכיבה הם בקושי אם בכלל לזיהוי LKS CD34 - תא HSCs של פקדים בריא 12. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . איור 4 לחיות מיקרוסקופיה הדמיה confocal של FACS מיון CD34 - HSCs ו GMPs מוכתמים quinacrine נוקלאוטיד מחייב את המתחם הגרעיני ואדום (DRAQ5). את הרביעים קטנים להראות quinacrine קופהשלפוחית ​​itive זוהה בציטופלסמה של HSCs אך לא GMPs. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> איור 5. Cytosolic Ca 2 + עליות HSCs מיון עמוסות פורעה-2 ו מגורה עם ה-ATP ו ionomycin. עקבות של תאים בודדים מוצגים. כל התאים היו מגיבים ATP תאי מראה עלייה בולטת cytosolic Ca 2 + אחרי תוספת של ATP.

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+units+of+development%2C+units+of+regeneration%2C+and+units+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
<li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2%2Fangiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li>
<li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li>
<li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li>
<li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+%28HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157(2007).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine%2Fparacrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts%3A+contribution+of+vesicular+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li>
<li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li>
<li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li>
<li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. איור 3 מציג ניתוח של פעילות רכיבה על התא LKS מגודרת באופן אלקטרוני CD34 - תאים בעכברים בריאים ועכברים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD) 13 על ידי מכתימה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100x </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> מסננת תא 40 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD מכתים פתרון </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / לתקן את המאגר </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> פרם חיץ III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6.7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> C-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> SCA-1 (D7) </td><td> eBioscience </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS עמודות </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

ניתוח בידוד פנוטיפי של murine בתאי גזע hematopoietic ו-lineage מחויבים אבות

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

מח העצם הוא האתר העיקרי שבו HSCs ובוגרת יותר כדוריות הדם אבות השושלת מתגוררים ולהבחין באורגניזם הבוגר. HSCs מהווים אוכלוסייה תא גזע pluripotent דקה של תאים המסוגלים לייצר את כל שושלות תאים דם בפעם חיים 1. דיסקציה המולקולרי של הומאוסטזיס HSCs במח העצם יש השלכות חשובות hematopoiesis, אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית. אנו מתארים את פרוטוקול סימון נוגדנים הניאון הליך gating אלקטרוני cytometry זרימת להבקיע תת אבות היווצרות הדם והפצה HSCs בעכברים בודדים (איור 1). בנוסף, אנו מתארים שיטה בהרחבה להעשיר אבות hematopoietic כמו גם לטווח ארוך (LT) ו לטווח קצר (ST) לשחזר HSCs מ אספו מח עצם השעיות התא על ידי העשרת המגנטי של תאים המבטאים C-Kit. הכנת התא וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי למיין תת שנבחרו במבחנהבמחקרים תפקודית ב vivo (איור 2). שני osteoblasts trabecular 2,3 ו -4 האנדותל סינוסי מהוות נישות תפקודית התומכים HSCs במח העצם. מספר מנגנונים בנישה osteoblastic, כולל משנה של N-cadherin + osteoblasts 3 ואינטראקציה של הקולטן טירוזין קינאז Tie2 לידי ביטוי HSCs עם angiopoietin-1 ליגנד שלה 5 מסכים בקביעת קפאון HSCs. &quot;מצב שינה&quot; במח העצם הוא חיוני כדי להגן על HSCs מ שכפול תשישות בסופו של דבר על פעילות רכיבה על אופניים יתר 6. גירויים חיצוניים הפועלים על תאים של מערכת החיסון המולדת כגון חיוג כמו ligands הקולטן 7 ו אינטרפרון אלפא-6 יכול גם לגרום ריבוי והתמיינות של HSCs לתוך אבות מסורים השושלת. לאחרונה, אוכלוסיית HSCs עכבר רדומים בתוך לין - C-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 - CD34 - האוכלוסייה תוארה 8. מיון של התאים על ביטוי CD34 מן ההשעיה אבות מועשר hematopoietic התא כמתואר כאן מאפשר בידוד של שניהם שוקט עצמית חידוש LT-HSCs ו ST-HSCs 9. הליך דומה על דלדול של תאים החיוביים השושלת ומיון של LT-HSC עם CD48 ו Flk2 נוגדנים תוארה קודם לכן 10. בדו&quot;ח הנוכחי אנו מספקים פרוטוקול אפיון פנוטיפי ו vivo לשעבר לתא מחזור ניתוח של אבות היווצרות הדם, אשר יכול להיות שימושי עבור ניטור hematopoiesis בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. יתר על כן, אנו מתארים FACS מיון הליך HSCs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להגדיר את גורמי ומנגנוני ויסות עצמי חידוש שלהם, הרחבת והבחנה בביולוגיה של התא התמרה מבחני אות כמו גם להשתלה.

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

מחולקת העצם היא האתר העיקרי שבו שוהים ומבדילים עצמם תאי גזע המטוכים (HSCs) ופרוגניטורים בשלבים בוגרים יותר של שורות תאי דם באורגניזם בוגר. HSCs...

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאי אב המטופואטיים באמצעות הפרדה מבוססת חרוזי מגנט ומיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). ראשית, הרגל האחורית, הפמור, הטיביה וחוט השדרה מופרשים מעכבר ועוברים הומוגניזציה כדי להפיק ת сусפנזיה של תאי מח עצם. לאחר מכן, האוכלוסייה מועשירה בתאים המבטאים C kit באמצעות זרימה של מיקרו-חרוזי מגנט.ניתוח ציטומטרי של האוכלוסייה המועשרת מדגים כי שיטה זו מניבה שושלת המטופואטית, תאי מקור ותאי גזע המטופואטיים בדרגת טהרה גבוהה, אשר ניתן להשתמש בהם בהמשך למחקרים פונקציונליים in vitro ו-in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שטיפת עצם (bone flushing), הוא שהיא מאפשרת התאוששות יעילה ומהירה יותר של תאי מחית העצם. ההשלכות של טכניקה זו חולות על טיפול או אבחון של דלקות, אוטואימוניות, חסרים חיסוניים, מחלות דגנרטיביות, הפרעות מטבוליות ומודלים חיסוניים של סרטן, מכיוון שהיא מאפשרת אפיון פנוטיפי וניתוח פונקציונלי ex vivo של תאי מקור המטופואטיים.שיטה זו יכולה לספק תובנות לניטור המטופואזיס (hematopoiesis) במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור העברה של אותות ביולוגיים בתאים וביטוי גנים המורגולל התפתחותית בתתי-אוכלוסיות נפרדות של תאי מוצא. התחילו בהנחת עכבר שהורג בשיטת eutectic במגש פלדת אל-חלד.רססו את הבטן והגב ב-70%

phenotypic-analysis-isolation-murine-hematopoietic-stem-cells-lineage

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

שיטה זרימה cytometric לזיהוי וניתוח מולקולרית של התמיינות בשלב ספציפי אבות Murine erythroid ומבשרי, ישירות במח שאך שנקטפו עכבר העצם, בטחול או בכבד העובר. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, וגודל התא.

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תאי גזע המטופויטיים ארוכי טווח (LT-HSCs) ותאי HSC לטווח קצר (ST-HSCs) באמצעות מערכת הדיווח Hoxb5.

שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר

מוצגת כאן טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה המאפשרת למדוד בו זמנית את מספר חלוקות התא, פנוטיפ תאי פני השטח וקרבה תאית. ניתן לבדוק תכונות אלה באופן סטטיסטי באמצעות מסגרת מבוססת תמורות.

הערכה סימולטנית של קרבה, מספר חלוקה ופנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה עבור תאי גזע המטופויטיים ותאי אב

למד שיטה לבידוד וניתוח פנוטיפי של תאי גזע hematopoietic ממח עצם עכברים באמצעות הפרדה מגנטית וציטומטריית זרימה. הטכניקה מאפשרת אפיון תאים טהורים לחקר תפקודי in vitro ו-in vivo.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

גלה סרטונים נוספים