ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאי אב המטופואטיים באמצעות הפרדה מבוססת חרוזי מגנט ומיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). ראשית, הרגל האחורית, הפמור, הטיביה וחוט השדרה מופרשים מעכבר ועוברים הומוגניזציה כדי להפיק ת сусפנזיה של תאי מח עצם. לאחר מכן, האוכלוסייה מועשירה בתאים המבטאים C kit באמצעות זרימה של מיקרו-חרוזי מגנט.

ניתוח ציטומטרי של האוכלוסייה המועשרת מדגים כי שיטה זו מניבה שושלת המטופואטית, תאי מקור ותאי גזע המטופואטיים בדרגת טהרה גבוהה, אשר ניתן להשתמש בהם בהמשך למחקרים פונקציונליים in vitro ו-in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שטיפת עצם (bone flushing), הוא שהיא מאפשרת התאוששות יעילה ומהירה יותר של תאי מחית העצם. ההשלכות של טכניקה זו חולות על טיפול או אבחון של דלקות, אוטואימוניות, חסרים חיסוניים, מחלות דגנרטיביות, הפרעות מטבוליות ומודלים חיסוניים של סרטן, מכיוון שהיא מאפשרת אפיון פנוטיפי וניתוח פונקציונלי ex vivo של תאי מקור המטופואטיים.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לניטור המטופואזיס (hematopoiesis) במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור העברה של אותות ביולוגיים בתאים וביטוי גנים המורגולל התפתחותית בתתי-אוכלוסיות נפרדות של תאי מוצא. התחילו בהנחת עכבר שהורג בשיטת eutectic במגש פלדת אל-חלד.

רססו את הבטן והגב ב-70% ethanol כדי לאסוף את העצמות שישמשו כמקור לתאים. השתמשו במספריים כדי ליצור שני פתחים קטנים בעור באזור הרגליים האחוריות; בעזרת פינצטה פתלו את ה-femur, לאחר מכן הפכו את העכבר וחתכו את העור לאורכו. כדי לחשוף את עמוד השדרה, הסירו את עמוד השדרה.

לאחר מכן, בעזרת מספריים בעלי קצה חד, הסירו בזהירות את כל שאריות הרקמה הרכה מעמוד השדרה. השתמשו בגזה כדי להסיר שאריות רקמה רכה מהפמור (femur) ומהטיביה (tibia).

לאחר מכן, העבירו את העצמות לפרועת קונוס בנפח 50 milliliter המכילה 30 milliliter של RPMI.Medium מועשר. הניחו מספר מסננים סטריליים בנפח ארבע חמישיים בתוך מכתש סטרילי. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את העצמות למכתש וכסו אותן בשכבה נוספת של מסננים כדי ליצור משטח חיכוך.

בשלב הבא, מקמו מסנן תאים בעובי 40 מיקרון בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת פסטל (pestle), רסקו את העצמות עד לקבלת סספנסיית תאים הומוגנית. ובאמצעות פיפטה, העבירו את הסספנסיה אל תוך מסנן התאים.

בשלב הבא, הוסיפו חמישה מיליליטר של RPMI טרי עם תוספות למכתש כדי לשטוף ולאסוף את התאים שנותרו באמצעות פיפטור מעלה ומטה. לאחר מכן, העבירו את ה-RPMI למבחנה עם המסנן. חזרו על שני השלבים האחרונים עד שהעצמות ההומוגניזיות ייראו צלולות.

לאחר שהתמיסה עברה דרך המסנן, העבירו אותה למבחנה חדשה בנפח 50 מיליליטר, סננו וחזרו על התהליך כדי להסיר את שאריות הרקמה שנותרו. ביצעו סנטריפוגה למבחנה ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והסִירו בזהירות את העילאי באמצעות שאיבה. ודאו כי משקע התאים אינו מופרע.

השלב הבא של הפרוצדורה הוא אפיון הפנוטיפים של תאי progenitor המטופוייטיים. התחל על ידי ריסוף של משקע התאים מכל עכבר ב-15 milliliters של PBS ו-2%FBS. לאחר מכן, סבב את המבחנה בצנטריפוגה ב-500 times G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius והסר בזהירות את העליון על ידי שאיבה.

אין להפריע למשקע. יש לסuspended את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS ו-2%FBS ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). לאחר קביעת ריכוז התאים, יש להעביר מיליליטר אחד של התאים לכל באר בלוח 96 באערים בעלי תחתית עגולה.

לאחר מכן, סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך חמש דקות. במהלך הסבב, הכן תערובת של נוגדנים מונוקלונליים המכוונים נגד סמני השטח המפורטים כאן ב-PBS ו-2% FBS לצביעת התאים. עם סיום הסבב, השתחל את הנוזל העליון על ידי היפוך הפלטה והוסף 50 µL מתערובת הנוגדנים לכל באר.

לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי לביצוע פעולות שאיבה ושחרור (pipette up and down) כדי להשיג סספנסיות של תאים בודדים. דגרו את התאים למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורה של 4°C. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם 150 µL של PBS ו-2% FBS. לאחר מכן, סבבו את הפלטה בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g למשך חמש דקות.

לאחר מכן, השליכו את הסנה על ידי הפיכת הפלטה. כעת, הוסיפו לכל באר 50 µL של תמיסת AP three size seven strept adin מהולה (1:300) ב-PBS עם 2% FBS, והפרידו לתמיחת תאים בודדים באמצעות פיפוט. דגרו את התאים במשך 10 דקות בחשכה בטמפרטורה של 4 °C לאחר הדגירה.

שטפו את התאים פעמיים עם 150 µL של PBS ו-2%FBS. לאחר צנטריפוגציה של הפלטה כדי להשקיע את התאים, השליכו את העילוי (supernatant) ושחזרו את התאים ב-100 µL של PBS ו-2%FBS; נתחו את הדגימות באמצעות ציטומטריה. כדי למיין תתי-אוכלוסיות נבחרות של תאי המטופואזה, בוצע העשרה מגנטית של מוח העצם כדי להעשיר תאים חיוביים לסממן. השעו את תאי מוח העצם שגודלו מלפחות 10 עכברים ב-1 mL של תמיסת בופר המכילה נוגדן מונוקלונאלי מקיט C המשורשר ל-PC בדילול של 1 ל-50.

דגרו את התאים למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. שטפו את התאים פעמיים עם 40 מיליליטר של תמיסת בופר. לאחר סבוב בצנטריפוגה, הסירו בזהירות את supernatant באמצעות שאיבה.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של חרוזי מיקרו anti A PC ישירות למשקע עבור כל עכבר. ערבבו היטב והדגירו למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 °C. לאחר ההדגרה, שטפו וסובבו את התאים כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, השעיו שוב את משקע התאים ב-4 mL של תמיסת בופר. עבור כל שלושה עכברים, הניחו עמודי max LS בשדה המגנטי של max separator מתאים.

הכינו את העמודות על ידי שטיפה עם ארבעה ליטרים של תמיסת בופר. לאחר מכן, יישמו את תרחיף התאים ואספו את התאים שאינם מסומנים העוברים דרך העמודה אל תוך מבחנה לאיסוף. שטפו את העמודה עם ארבעה ליטרים של תמיסת בופר שלוש פעמים.

יש להוסיף בופר חדש כאשר מאגר העמודה מתרוקן. לאחר שכל התמיסה זרמה דרך העמודה, יש להשליך את הנוזל שזרם החוצה, להוציא את העמודות מהמפריד ולהניח כל אחת מהן מעל מבחנה קונית של 15 מיליליטר. יש להטפטף ארבעה מיליליטר של תמיסת בופר לכל עמודה, ולאחר מכן לשטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפת הבוכנה לתוך העמודה.

סובב את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g למשך חמש דקות. הסר בזהירות את ה-SUP natum באמצעות שאיבה. השהה מחדש כל משקע במיליליטר אחד של תמיסת בופר וקבץ את המשקעים למבחנה קונית אחת של 15 מיליליטר.

לאחר העשרת אוכלוסיית התאים החיוביים ל-sea kit, צבעו ומיינו את התאים באמצעות FACS. פרוגניטורים המטופואטיים ותאי גזע המטופואטיים מתליה של מחצית מחוללת עצם, שהועשרו לתאים חיוביים ל-sea kit באמצעות חרוזי מגנט, ו-LT HSC ו-THSC מוינו בהתאם לביטוי של מולקולות שטח כפי שמתואר בסרטון זה. איור זה מציג דוגמה להליך השערה אלקטרונית (electronic gating) לציוני פרוגניטורים לימפואידיים נפוצים כ-linin.

ראה תאים עם ביטוי נמוך של interleukin seven R. תאים שהם Lin minus, see it positive, scar one positive ו-linin see kit positive scar one. תאים עם ביטוי נמוך מהשער (gate) של SEE kit positive.

פרוגניטורים מיאלואידיים נפוצים מזוהים כתאים CD 34 חיוביים עם ביטוי נמוך של FC gamma R. כמו כן, מתוך שער (gate) של תאי C kit חיוביים, פרוגניטורים של גרנולוציטים ומונוציטים מזוהים כתאים CD 34 חיוביים עם ביטוי גבוה של FC gamma, ופרוגניטורים של מגקריוציטים ואריתרוציטים מזוהים כתאים CD 34 שליליים עם ביטוי נמוך של FC gamma. מתוך אוכלוסיית LKS, תאי L-T-H-S-C ותאי S-T-H-S-C מזוהים כתאים CD 34 שליליים ו-CD 34 חיוביים, בהתאמה. כך מתקבלות שתי אוכלוסיות מועשרות ומטוהרות מאוד, אשר קיימות באופן פיזיולוגי במספר נמוך, כדי לבחון את השפעת autoimmune על ההמטופואזה של HSCs מעכברים של ביקורת ומעכברים עם מחלה דלקתית של המעי.

צבעו עם נוגדן KI 67 ו-DPI כפי שניתן לראות כאן. תאים במצב של חלוקה בקושי ניתנים לזיהוי, אם בכלל, במדגם של תאי גזע המטופואטיים LKS CD 34 שליליים בקבוצות ביקורת בריאות. לעומת זאת, תתי-אוכלוסיות תאים אלו מוגברות משמעותית במהלך IBD, ומספר ניכר של HSCs מזוהה בשלבי G2 ו-M של מחזור התא.

ממצאים אלה מרמזים כי דלקת כרונית המתווכת על ידי תאי T קובעת את כניסתן של תאי HSC למחזור התא. כדי להעריך את נוכחותו של ATP המאוחסן בשקיקים, נצבעו תאים שליליים ל-CD 34 מעכברים בריאים באמצעות התרכובת quinine הנקשרת לנוקלאוטידים; ניתוח של צבע nuclear red באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים הראה כי ב-HSCs, אך לא ב-GMPs, נראים שקיקים חיוביים ל-quinine בציטופלזמה. כדי לקבוע האם HSCs מגיבים ל-ATP חוץ-תאי, נותחה התגובה הסידלית של תאי גזע המטופויים ממוינים שנטענו עם 4 0 2 ועוברו גירוי באמצעות ATP ו-ionomycin, כפי שנראה כאן. עקומות עליית סידן בתאים בודדים מעידות על עלייה בסידן הציטוסולי ב-LT HSC על ידי הפעלה של קולטני P2 אנרגיים טהורים.

בעקבות חשיפה ל-TP, מכיוון שעליות בריכוז הסידן הציטוזולי משרות שחרור של A TP וסיקולרי. ניסוי זה מרמז כי TP עשוי לווסת את השחרור העצמי שלו מתאי HSCs ומדגים כי ניתן להשתמש בהליך זה למחקרים תפקודיים של HSCs. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן בידודם של תאי גזע של neurone topo ותאי פרוגניטורים בעלי מחויבות לשושרה עבור בדיקות תפקודיות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון השחזה של עכברים מקבלים שאינם מקרינים, כדי לענות על שאלות נוספות כמו פוטנציאל השחזה של תאי גזע המטופויטיים שנוקו מ-C State או מסביבה דלקתית.