דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תאי T רגולטוריים אנושיים מתאי T ראשוניים. ראשית, מבודדים תאים חד-גרעיניים של דם פריפרי (PBMC) מדגימות דם אנושיות. לאחר מכן, מטהרים תאי T חיוביים ל-CD4 מתערובת ה-PBMC ומגדלים אותם בתרבית.

לאחר שישה ימים, התאים ממוינים לתתי-אוכלוסיות של תאי T זיכרון נאיביים, אפקטורים ותאי T רגולטוריים מושריים באמצעות ציטומטר זרימה, ולאחר מכן מבוצעים מבחני דיכוי. באמצעות תאים אלו, ניתן להוכיח כי שיטה זו מייצרת תאי T רגולטוריים אנושיים בעלי פעילות דיכוי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות המשתמשות בתאי עכבר הם ששיטה זו, המבוססת על תאים אנושיים, בעלת רלוונטיות פיזיולוגית וקלינית גבוהה יותר, והיא מאפשרת השוואה של תאי Tregs לאוכלוסיות תאים אחרות מאותו תורם.

ביטול השונות הפנימית בין נבדקים. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בנוגע לשדה התאים הרגולטוריים, כגון מהם האירועים הרגולטוריים המודולטים את המעבר בין תאי T קונבנציונליים לתאים רגולטוריים, או מהם אירועי האיתות והשעתוק הספציפיים לתאים רגולטוריים? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפולים במחלות אוטואימוניות, מצבי דלקת וסרטן, וזאת בשל התפקיד החיוני שתאי regs ממלאים בהומאוסטזיס חיסוני.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בתחום זה מתקשים בביצוע הפרוטוקול בשל מגוון הטכניקות המשמשות ובשל החלון הצר לתנאי תרבית תאים אופטימליים בחלק מהשלבים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות Treg, ניתן להשתמש בה גם כדי לנטר את הפלסטיות של בידול שושלת תאי T או כדי לנתח את היכולת של תאי T להשרות או למנוע זאת. את ההליך להדגמת התפתחות Treg יבצעו אנדריאה מקול (Andrea McCool) והסטודנטים לתארים מתקדמים מארי קתרין רנייה (Marie Catherine Ranier), גאווין אליס (Gavin Ellis) וקטלינה ואלה אורטגה (Catalina Vale Ortega).

התחילו את הפרוצדורה על ידי בידוד תאי דם לבנים מונונוקלאיים מדם פריפריאלי אנושי מ-40 עד 60 ליטר של B Buffy coat. כדי לדלל את ה-buffy coat, העבירו אותו לבקבוק זכוכית של 500 milliliters המיועד לאוטוקלאב ומכיל 150 milliliters של PBS סטרילי. לאחר מכן, הוסיפו PBS סטרילי נוסף כדי להביא את הנפח הסופי ל-250 milliliters. בשלב הבא, מלאו 10 מבחנות קוניות של 50 milliliters, כל אחת ב-20 milliliters של תמיסת lympho prep.

לאחר מכן, העבירו בעדינות מעל תמיסת ה-Lympho prep 25 milliliters של ה-buffy coat המדולל, תוך הקפדה שלא להפריע לתמיסת ה-Lympho prep. סובבו את המבחנות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ב-500 ×g. ודאו כי הבלם של הצנטריפוגה כבוי כדי לא להפריע לשכבת הלימפוציטים.

לאחר הסבוב, ה-PBM CS יימצא בממשק שבין שכבת ה-lympho prep לשכבת תווך הפלסמה כדי לאסוף אותם. שאבו את תווך הפלסמה עד שיישאר נפח של כ-1 milliliter המכסה את שכבת ה-buffy coat המכילה את ה-pbmc. השתמשו בפיפטה של 10 milliliter כדי להעביר את ה-pbmc למבחנה חדשה של 50 milliliter.

לאחר שטיפת התאים פעמיים ב-PBS, השהה אותם מחדש ב-50 milliliters של RPMI קר וספור אותם באמצעות המוציטומטר. התשואה הטיפוסית היא 8×10⁸ עד 1×10⁹ p BMCs לאחר קביעת הריכוז. השהה מחדש את ה-PBM CS בריכוז סופי של 5×10⁷ למילליטר ב-PBS המכיל 2% FBS ו-1 millimolar EDTA והעבר את התאים למבחנה חדשה מפוליפרופילן עם תחתית עגולה בנפח 14 milliliters.

בשלב הבא, יעשה שימוש בערכת ה-EAs כדי לבצע ברירה שלילית של התאים המבוקשים. תערובות העשרה של תאי T המסופקות עם הערכה מכילות קומפלקס נוגדנים טטראמרי, הכולל נוגדן אנטי-דקסטרין בצד אחד ונוגדן נגד אנטיגנים לא רצויים על פני השטח של התא בצד השני. כאשר התערובת מתווספת לתאים, קומפלקס הנוגדנים הטטראמרי מחבר בין התאים הבלתי רצויים.

לאחר מכן מוסיפים חלקיקים מגנטיים מצופים בדקסטראן, הנקשרים לקומפלקס הנוגדנים הטטראמרי ומחברים את התא הבלתי רצוי לחלקיק המגנטי. לאחר מכן משתמשים במגנט כדי להפריד את התאים הבלתי רצויים מהתאים המבוקשים, אשר נאספים כדי לבודד תאי T חיוביים ל-CD4. העברו בעזרת פיפטה 1×10⁸ עד 4.25×10⁸ PBMC לתוך מבחנה קונית של 15 milliliters. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL מתערובת העשרה של נוגדנים לתאי T חיוביים ל-CD4 אנושי עבור כל milliliter של PBMC.

ערבב והדגר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ערבב את החלקיקים המגנטיים כדי לפזר אותם באופן שווה בכל התמיסה. הוסף 100 µL של חלקיקים מגנטיים לכל 1 mL של pbmc.

ערבב על ידי פיפוט עדין פעמיים עד שלוש, ולאחר מכן הדגר אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוסף PBS המכיל FBS ו-EDTA עד להגעה לנפח של 10 milliliters למבחנה, וערבב על ידי פיפוט עדין פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הנח את המבחנה ללא הפקק במגנט ה-cept למשך חמש דקות, כאשר המבחנה נשארת בתוך המגנט.

שפכו את הנוזל למבחנה חדשה של 50 milliliter כדי לבודד את התאים הרצויים לצורך שיפור ההשגה. חזרו על תהליך זה על ידי הוספת P-B-S-F-B-S-E-D-T-A נוסף למבחנה, ערבוב והחזרת הדגימה למגנט. לאחר בידוד התאים, ספרו אותם ולאחר מכן בצעו סרכוז ב-500 times G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

שחזר את משקע התאים בתוך תווך קיטוב כדי להגיע לריכוז של 2 × 10⁶ תאים למילילטר. לאחר מכן, המשך לתרבית כפי שמתואר בחלק הבא של הסרטון כדי להשרות תאי T רגולטוריים. חמם מראש פלטות תרבית רקמה של 6 בארות המצופות ב-anti-CD3 לטמפרטורה של 37 °C.

לאחר שהצלחות התחממו, שאבו את ה-PBS מהבארות. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של תרחיף תאים מועשר חיובי CD4 לכל בארה. מלאו כל בארה ריקה ב-PBS כדי להפחית את התאיידות המצע. הדגרימו למשך שלושה ימים לאחר ההדגמה.

סבבו את הפלטה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-500 ×g. לאחר מכן, מבלי להפריע לתאים ששקעו בתחתית הפלטה, הסירו מחצית מהמצע והחליפו אותו במצע טרי, ולאחר מכן הדגרירו למשך יומיים עד שלושה ימים נוספים. כעת ניתן למיין את התאים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) כפי שמתואר בסעיף הבא, או להשתמש בהם כתאי מטרה למבחן דיכוי (suppression assay) כפי שיתואר בהמשך; לאחר שעברו יומיים עד שלושה ימים, התאים ובקרי הפיצוי (compensation controls) המתאימים מוכנים למיון תאים מופעל פלואורסצנציה. לצורך מיון להפרדת תאי T רגולטוריים מושריים, נאיביים ותאי זיכרון, צבעו את התאים המיועדים למיון באמצעות anti CD 25 PE, anti CD 45 RA PE SCI five ו-anti CD 1 27 APC כפי שמתואר במסמך המצורף.

יש לוודא גם להוסיף נוגדנים לבקרות הפיצוי המתאימות לצורך אנליזת fax. לאחר הצביעה, השהו את התאים בריכוז של 10⁷ תאים למילליליטר של חוצץ שטיפה, לאחר מכן הוסיפו 1.5 µL של DNAs 2 למילליליטר של תאים וסננו את התאים דרך מסננת תאים מניילון של 40 micron. העבירו את התאים לשפופרות פוליפרופילן בעלות תחתית עגולה בנפח של 5 מיליליטר, כך שלא יעברו 3.5 מיליליטר לשפופרת.

שעלקו מחדש את תאי בקרת הפיצוי ב-300 µL של תמיסת שטיפה. הגדירו את הפיצוי בציטומטר הזרימה כדי למזער זיהוי צולב על ידי מסנני PE A PC ו-PE sci-fi. הגדירו שערים למיון תאי tregs, תאי T נאיביים ותאי T זיכרון אל תוך מבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה בנפח 5 mL המכילות 1 mL של סרום עגל רך, וזאת כדי להעריך האם תאי T הרגולטוריים שנוצרו במהלך המיון מסוגלים לדכא פרוליפרציה של תאי T.

כאן מבוצע מבחן דיכוי. תאים מועשרים ב-CD4 חיוביים שלא עברו מיון ישמשו כתאי המטרה. אלו לא אמורים להכיל תאי T רגולטוריים מושריים CD25 חיוביים.

התחל בסימון תאי המטרה באמצעות CFSE בעזרת ערכה למעקב אחר תאים (cell trace kit) לפי הוראות היצרן, תוך שימוש ב-1 µL של תמיסת מלאי בריכוז 5 M לכל מיליליטר של תאים במקום 2 µL. לאחר מכן, השקע מספר חרוזי בדיקה لديהוי דיכוי treg השווה למספר התאים הכולל באמצעות סבב קצר של צנטריפוגה בשפופרת מיקרו-צנטריפוגה. שטוף את החרוזים פעם אחת עם RPMI והשקע אותם שוב לאחר הסבב.

שאבו את ה-RPMI והשעיקו אותם לריכוז המתאים ב-8 µL של תווך למבחן דיכוי (suppression assay medium) לכל באער בלוח תרבית רקמות בעל 96 באערים עם תחתית עגולה. הוסיפו 8 µL של תאי מטרה שצבעו ב-CFSE. בדקו את החרו지를 ואת התאים המפולריים שעברו מיון לנפח סופי של תווך טרי למבחן דיכוי.

מדיום של 200 µL. כל התנאים נזרעים בשלוש חזרות. להכנת הביקרות, הוסיפו 100 µL של תאים צבועים ב-CFSE, שמונה µL של חרוזי ביקורת (inspector beads), ו-1×10⁵ תאים טריים לא צבועים ב-92 µL של suppressor assay.

תווך לכל באער לשתי באערות הביקורת הראשונות. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תאים צבועים ב-CFSE ו-1×10⁵ תאים טריים לא צבועים ב-92 µL מתווך לבדיקת דיכוי (suppressor assay). תווך לכל באער לשתי באערות הביקורת השניות.

כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והניחו אותה באינקובטור למשך חמישה ימים בחשיכה. אספו את התאים מכל באר באמצעות פיפטור והעבירו אותם לשפופרת פוליסטירן בעלת תחתית עגולה בנפח 5 mL. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

שאבו את המצע והשביו את התאים בסוסיפנסיה של 300 µL של בופר שטיפה קר של Fox. כדי לנטר את התקדמותה של דיפרנציאציה של תאי T רגולטוריים מושריים, תאי T ראשוניים אנושיים מבודדים חיוביים ל-CD4 ושליליים ל-CD25 תורבדו במצע IT reg; מנות שנלקחו בימים 0, 1, 3 ו-5 נבדקו באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך את הביטוי של הסמנים CD45 RA, FoxP3, CTLA4 ו-CD25. כפי שניתן לראות בתרשימי הנקודות בצבעי-פסאודו אלה, במהלך של חמישה ימים התאים שוכפלים ועוברים דיפרנציאציה in vitro בתגובה לקישור צולב (cross-linking) של CD3 בנוכחות TGF beta ו-IL2, מה שמוביל בסופו של דבר לפרופיל שלילי ל-CD45 RA, גבוה ל-FoxP3, גבוה ל-CTLA4 וגבוה ל-CD25. נתון זה מעיד על התפתחותם של tregs מושריים מתאי T מקדימים קונבנציונליים. כדי להעריך את יכולתם היחסית של ה-tregs שהופקו לדכא שכפול של תאי T.

תאים המסומנים ב-CFSE תורבדו עם חרוזי treg suppression inspector בנוכחות תאי naive memory ו-I treg מומינים, כפי שניתן לראות בהיסטוגרמה זו. תאים CD 25 high, CD 45 RA negative CD 1 27 negative. תאי T רגולטוריים מושריים (Low induced regulatory T cells) הם התת-אוכלוסייה היחידה מתרבית של חמישה ימים שרכשה יכולת דיכוי רגולטורית.

דבר זה מעיד על כך שהתאים שנוצרו במערכת זו הם תאי T רגולטוריים מדכאים הן מבחינה פנוטיפית והן מבחינה תפקודית, ולא תאי T קונבנציונליים מופעלים, שעשויים לבטא FOX P3 ו-CD 25 באופן זמני, אך אינם אימונוסוপ্রেסיביים. נוכחותם של תאי T רגולטוריים מושריים מבטלת לחלוטין את השגשוג של תאי T חיוביים ל-CD 4. המספרים מעידים על אחוז התאים המסומנים ב-CFSE שעברו חלוקה, כדי לקבוע כי הדבר נכון גם עבור תת-אוכלוסיות מטהרות של תאי T.

תאי T נאיביים ותאי T זיכרון ראשוניים של בני אדם נצבעו ב-CFSE ותורבדו במצע Treg. לאחר חמישה ימים, בוצע פנוטיפ לתאים ואומדו שיעורי חלוקת התאים כפי שמוצג. כאן, תאי Treg הושרו ממאגר תאי T נאיביים וממאגר תאי T זיכרון לאחר חמישה ימי תרבית.

במדיום IT reg סטנדרטי, צביעה ב-CFSE של תאים ראשוניים מראה שתאי T נאיביים או תאי T זיכרון מבדילים לתאי T רגולטוריים רק לאחר מספר סבבים של חלוקת תאים; פרופילי צביעה השוואתיים של CFSE מזהים את תאי T הרגולטוריים המושרים כתאים בעלי הפרוליפרציה הגבוהה ביותר במהלך תרבית של חמישה ימים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג תאי TX מושרים מאוכלוסייה של תאי T נאיביים, תאי זיכרון או תאי T כוללים שהושגו מתורם בודד בעת ביצוע הליך זה.

חשוב לשמור על טכניקה סטרילית לאורך כל התהליך ולמנוע את חשיפת ה-CFSE לאור בעקבות פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות תפקודיות (functional assays), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהם ההבדלים בקצבי חלוקת התאים, בסנתזה ספציפית של ציטוקינים ובשימוש בתעלות יונים בין תאי T רגולטוריים לתאי T קונבנציונליים לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור מחלות אוטואימוניות ופתולוגיות אחרות הקשורות ל-treg במטופלים אנושיים.

זכרו כי עבודה עם דם אנושי היא מסוכנת ביותר, ויש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי זהירות כגון בדיקות בנק דם נאותות וסילוק נכון של הפסולת בעת ביצוע הליך זה.