Name: תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למד פרוטוקול רב-שלבי להבשלת תאי גזע עובריים אנושיים לתאים מייצרי אינסולין באמצעות שיתוף תרבות עם תאי אנדותל. שיטה זו מגבירה את התפוקה ואת הבשלת התאים לטיפול בסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים תמיכה פרס חדש ממציא NIH DP2 116520 ו ORAU ראלף powe שיפור Junior פרס הפקולטה.

1. תא תחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HESC H1 (WiCell) נשמרו על בארות hESC מוסמכים מצופה matrigel mTeSR1 עם התקשורת, עם התקשורת לשנות כל יום. וולס היו מכוסות על ידי הפתרון matrigel לדלל, שהוכן על ידי הוספת 300 μl של matrigel hESC ב 25 מ&quot;ל של DMEM: F12. 1 מ&quot;ל של פתרון זה matrigel נוספה גם כל צלחת גם 6, או 400 μl להוסיף גם כל צלחת 12 באר מותר המעיל 1 שעה בטמפרטורת החדר. התאים היו passaged מכנית על ידי גירוד מושבות כשהגיעו בין 1 ל 1.5mm בקוטר ביחס פיצול של 1:04. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RHMVEC (VEC טכנולוגיות) נשמר ב-MCDB 131 התקשורת עם התקשורת לשנות כל שני וחמישי. תאים חולקו על ידי trypsinization פעם מפגש 80% הושג ביחס פיצול של 1:03. לתאי אנדותל בין קטעים 3 ו -7 שימשו במחקר זה. </li></ol> 2. הכנת מאגר פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Activin היה מחדש ב 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​P סטריליתBS המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור. הפתרון היה aliquoted ומאוחסנים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EGF היה מחדש על 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​חומצה אצטית 10 סטרילית מ&quot;מ. הפתרון היה aliquoted ומאוחסנים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינסולין היה מחדש ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל על ידי הוספת acidified H 2 O (pH ≤ 2), שהוכן על ידי תוספת של חומצה אצטית קרחונית 0.1 מ&quot;ל ל 10 מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAPT היה מחדש ב DMSO ב 18 מ&quot;ג / מ&quot;ל. זה היה עוד יותר מדולל לריכוז 300 מיקרומטר DMEM: F12, aliquoted ומאוחסנים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KAAD-Cyclopamine היה מחדש ב DMSO על 5mg/ml. זה היה עוד יותר מדולל לריכוז 2 מיקרומטר DMEM: F12, aliquoted ומאוחסנים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> All-טרנס החומצה הרטינואית היה מחדש ב 2.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אתנול 95%. זה היה עוד יותר מדולל לריכוז 2 מ&quot;מ ב DMEM: F12, aliquoted ומאוחסנים ב -80 ° C. </li></ol> 3. האנדודרם מכריע (DE) ו אבי הלבלב (PP) אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמושבות חברתיות ותרבותיות שהושג בין 1 ל 1.5mm קוטר, אינדוקציה DE נערך על ידי הוספת DMEM: F12 השלימו עם B27, BSA 0.2%, 100 ng / mL Activin ו 1 מיקרומטר Wortmannin במשך 4 ימים (יום 0-Day 4) עם התקשורת לשנות בכל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגיוס DE היה שלם, אבי אינדוקציה הלבלב הושרה על ידי שינוי התקשורת DMEM: F12 השלימו עם B27, BSA 0.2% ו-KAAD Cyclopamine בריכוז 0.2 מיקרומטר ל -24 שעות (יום 4 יום 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות מדיה שונה DMEM: F12 השלימו עם B27, 0.2% BSA, KAAD-Cyclopamine בריכוז 0.2 מיקרומטר ו-All-טרנס החומצה הרטינואית בריכוז 2 מיקרומטר במשך 3 ימים עם התקשורת לשנות כל יום (יום יום 5-8) . </li></ol> 4. הלבלב ההבשלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגיוס PP, הקבוצות שונו למדיה התבגרות מורכב DMEM: F12 השלימו עם B27, 0.2% BSA, Nicotinamide 10 מ&quot;מ, 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל אינסולין, 30 ננומטר מיקרוגרם Na SEO 3 ו -50 / 2 מ&quot;ל transferrin עבור 2 דays עם התקשורת לשנות כל יום (יום 8 הימים 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 2 ימים בתקשורת ההתבגרות, שלב ההבשלה הסופית נעשית במקביל באמצעות תנאים שונים להשוואה. בידול הושרה בתנאים הבאים: (i) באמצעות חריץ מעכב DAPT (ii) באמצעות שיתוף תרבות מדיה בלבד, ללא בתאי האנדותל כמו מלאה (iii) באמצעות יצירת קשר ושיתוף עם התרבות תאים RHMVEC. תאים נשמרו בתקשורת DAPT או שיתוף תרבות במשך שבוע (יום 10 הימים 17) עם התקשורת לשנות כל יום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת DAPT הוכן על ידי השלמת אמצעי התקשורת ההתבגרות עם DAPT 30 מיקרומטר. תאים בקבוצות אלה נחשפו לראשונה להשלים MCDB131 למשך 24 שעות ולאחר מכן נחשף למדיה DAPT במשך 6 ימים (יום 11 יום 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף תרבות התקשורת הוכן על ידי השלמת MCDB-131 לתקשורת עם B27, 0.2% BSA, Nicotinamide 10 מ&quot;מ, 10 ng / ml EGF, 1 מיקרוגרם / הידרוקורטיזון מ&quot;ל, 10 מ&quot;ג EndoGro, 90 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​הפרין. למצב בקרת מדיה התאים המבדילים נחשפועד בינוני 131 MCDB המלא ל 24 שעות (יום 10 יום 11) לאחר מכן בתקשורת שונה שיתוף תרבות התקשורת במשך 6 ימים (יום 11 יום 17) (אין לתאי אנדותל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצב קשר שיתוף תרבות, 1000000 RHMVEC נוספה התאים המבדילים ב שלמים MCDB-131 המדיה (VEC טכנולוגיות) למשך 24 שעות (יום 10 יום 11) כדי לאפשר המצורף. לאחר 24 שעות מדיה שונה שיתוף תרבות התקשורת במשך 6 ימים (יום 11 הימים 17) עם התקשורת לשנות כל יום. </li></ol></li></ol> 5. qRT-PCR ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף כל שלב התמיינות (האנדודרם, אבי הלבלב, איון בוגרת) היו lysed ו-RNA הופק באמצעות NucleoSpin RNA ערכת החילוץ השנייה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA איכות נותח על ידי בדיקת ספיגת RNA ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר, ואחריו כימות RNA באמצעות SmartSpec פלוס ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעתוק לאחור בוצעה באמצעות ImProm K II שעתוק לאחורזאת על פי הוראות היצרן. כל התגובות בוצעו עם ng 100 של RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> qRT-PCR בוצעה באמצעות QPCR Mx3005P המערכת (Agilent) ומבריק II SYBR ירוק תערובת QPCR מאסטר פי הוראות היצרן. פריימרים המשמשים מפורטים על השולחן 1. צעד האתחול בוצע על 50 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ואחריה 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. 50 מחזורים הגברה בוצעו באופן הבא: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 54 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי פולד ביטוי mRNA היעד על תאים שלא עברו התמיינות חושב מערכי ה-CT בעזרת הנוסחאות הבאות: ΔCT (דה מרקר i) = CT (דה מרקר אני) - CT (GAPDH) Δ ΔCT (סמן i) = ΔCT (דה מרקר אני) (לדוגמה) - ΔCT (דה מרקר אני) (תאים שלא עברו התמיינות) הביטוי יחסית (דה מרקר i) = 2-ΔΔCT(סמן ט) </li></ol> 6. Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף כל שלב התמיינות (האנדודרם, אבי הלבלב, איון בוגרת) התאים תוקנו בפורמלין 4% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קבוע היו permeabilized באמצעות 0.25% טריטון X-100 (TX) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלא ספציפית מכתים נחסמה על ידי הדגירה בסרום חמור של 10% .05% TX במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה הנוגדן העיקרי בוצע במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס חסימת חיץ בדילול נוגדנים המומלצת (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו עם 0.05% טקסס שלוש פעמים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה נוגדנים משני בוצעה שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך עם נוגדנים מתאימים בדילול בחסימת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו עם 0.05% טקסס שלוש פעמים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים גרעינית נערך על ידי הדגירה Hoescht עם כתם על דילול 1:1000 ב PBSבמשך 5 דקות ואחריו 3 שוטף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קבוע ומוכתמת היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס IX81 הפוך ותוכנה Metamorph הדמיה. </li></ol> 7. נציג תוצאות תוספת של Activin ו Wortmannin כדי hESC מובחן במשך 4 ימים גורם האנדודרם סופי כמו אושר על ידי ניתוח qRT-PCR עבור סמנים דה Sox17, CXCR4 ו Foxa2 ו immunostaining עבור Sox17 כפי שמודגם באיור 2. התמיינות לתאי אבות הלבלב לאחר תוספת של חומצה cyclopamine ו retinoic אושרה על ידי qRT-PCR של אב סמנים הלבלב ו Immunostaining עבור Pdx1 כפי שמודגם באיור 3. בשלב הסופי של בידול, פנה שיתוף תרבות עם תאים RHMVEC המושרה מאוד upregulation הביטוי אינסולין hESC את התאים שמקורם בלבלב אב. היעילות של בידול שיתוף תרבות בתיווך נותח על ידי שיתוףmparing עם מצב שליטה באמצעות DAPT. DAPT שימש פקד חיובי שכן הוא נמצא כעת באחת השיטות בשימוש נרחב ביותר להשגת ההתבגרות הלבלב. מאז שיתוף תרבות בוצעה מדיה שונה בתוספת גורמים תומכים בתאי אנדותל, שליטה נוספת בוצעה עם התקשורת על העדר בתאי האנדותל כדי לאמת את ההשפעה של התקשורת על בידול. פרטים של ניתוח זה מוצגים באיור 4. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> באיור 1. רב שלבית פרוטוקול התמיינות לתאים hESC אינסולין המבטאים. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> איור 2. אינדוקציה האנדודרם מכריע של בתאי גזע עובריים אנושיים. א) qRT-PCR ניתוח של סמנים נציג דה hESC תאים שנחשפו Activin ו Wortmannin למשך 4 ימים. תוצאות ar<html> דואר מנורמל ביחס hESC מובחן. ב) Sox17 מכתים (ירוק) ו DAPI (כחול) הצג ביטוי הגרעין של Sox17. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> 3. איור הלבלב אבי אינדוקציה של תא גזע עוברי נגזר תאים האנדודרם. א) qRT-PCR ניתוח של סמנים מוקדמים הלבלב שמקורם בתאי hESC האנדודרם שנחשפו חומצה cyclopamine ו retinoic במשך 4 ימים לאחר הגיוס DE. תוצאות מנורמל ביחס hESC מובחן. ב) Pdx1 מכתים (סגול) ו DAPI (כחול) מראים ביטוי של Pdx1 גרעינית. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. &quot;&gt; <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> איור 4. התבגרות בשלב הלבלב) qRT-PCR ניתוח של הורמוני הלבלב ב hESC לאחר ההבשלה הלבלב באמצעות DAPT, פנה לתקשורת ושיתוף תרבות או תרבות משותפת (שליטה). תוצאות מנורמל ביחס hESC מובחן. עמ &#39;ערכים מתקבל על ידי התלמיד מבחן t. ב) משותף עם התרבות דיל-AC-LDL RHMVEC שכותרתו (האדום) הצג באזורים בהם ECS לצרף צלחת אם יש חללים ריקים (למעלה), RHMVEC השני ניתן למצוא קשר ישיר עם ESC הבחנה (למטה). ג) C-peptide (ירוק) מכתים עבור תאים המבדילות באמצעות שיתוף תרבות השיטה. סרגל קנה מידה: 12.5 מיקרומטר (למעלה) ו -50 מיקרומטר (למטה) D) Immunostaining של RHMVEC מדגים שום ביטוי אינסולין RHMVEC. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סמן </td><td> Primer1 (5 &#39;ל 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;ל 3&#39;) </td><td> Ref </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> גלוקגון </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Primers לוח 1. המשמש תגובות QPCR.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

במהלך התפתחות הלבלב, תאים בלבלב המבדילים נמצאים בסמיכות עם לתאי אנדותל של אבי העורקים, יתר על כן, איים הלבלב הם בצפיפות vascularized לקדם חילופי מהירה של רמת הסוכר בדם והורמונים איון. לאור עובדות אלה, אין זה מפתיע כי תאי אנדותל למלא תפקיד חשוב בתהליך של organogenesis הלבלב. למרות החשיבות של בתאי האנדותל במהלך פיתוח לבלב היא יותר ויותר להיות מוערך, תפקידה של התמיינות של תאים עובריים במבחנה נחקר פחות. בדו&quot;ח הקודמת שלנו הקמנו את התפקיד החיובי של בתאי האנדותל על...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוזים </td></tr><tr><td> mTeSR1 (עם תוספת) </td><td> גזע התא טכנולוגיות </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC מוסמך matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (השלם) </td><td> VEC טכנולוגיות </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 מוסף </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Activin </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> כל טרנס retinoic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> נתרן סלניום </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 ננומטר </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC טכנולוגיות </td><td> ENDOGRO </td><td> 10 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> הפרין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> הידרוקורטיזון </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey נגל </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm שעתוק II הפוכה מערכת </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> מבריק II SYBR גרין QPCR מאסטר מיקס </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 עז IgG polyclonal </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-17355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 עז polyclonal IgG </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-peptide polyclonal הארנב </td><td> התא איתות </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 488 נגד ארנב החמור IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 647 חמור נגד עז IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריאגנטים וערכות.

תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

לתאי גזע עובריים (ESC) יש שני מאפיינים עיקריים: הם יכולים להיות מופצים ללא הגבלת זמן במבחנה במצב מובחן והם pluripotent, ובכך שיש פוטנציאל להתמיין שושלות רבות. מאפיינים אלה להפוך ESCs אטרקטיבי ביותר עבור טיפול בתאי מבוסס, במהלך טיפולים משובי 1. עם זאת עבור מלוא הפוטנציאל שלו להתממש התאים צריך להיות מובחן לתוך פנוטיפים בוגרים ופונקציונלי, שהוא משימה מרתיעה. גישה מבטיחה בגרימת התמיינות הוא לעקוב מקרוב לחקות את דרך organogenesis בסביבה חוץ גופית ב. התפתחות הלבלב ידוע להתרחש בשלבים מסוימים 2, החל האנדודרם, אשר יכול להתפתח לאיברים שונים, לרבות הכבד והלבלב. אינדוקציה האנדודרם ניתן להשיג על ידי אפנון של מסלול קטרי באמצעות תוספת של Activin 3 בשילוב עם גורמי גידול מספר 4-7 </sup&gt;. תאים האנדודרם מוחלטות ואז לעבור המחויבות הלבלב על ידי עיכוב של עיכוב קיפוד קולי, אשר יכולה להיות מושגת במבחנה על ידי תוספת של cyclopamine 8. התבגרות הלבלב מתווך על ידי אירועים מקבילים מספר כולל עיכוב של חריץ איתות, מצטבר של אבות הלבלב לתוך 3-dimentional אשכולות: אינדוקציה של כלי הדם, עד כמה שם. ללא ספק המצליחה ביותר הבשלה חוץ גופית של חברתיות ותרבותיות ובתאים הנגזרות הלבלב הושגו באמצעות עיכוב ברמה הגבוהה מאותתת על ידי תוספת DAPT 9. אמנם מוצלח, הדבר גורם התשואה הנמוכה של הפנוטיפ בוגרת עם פונקציונליות מופחתת. אזור למד פחות היא ההשפעה של תא האנדותל איתות ההתבגרות הלבלב, אשר יותר ויותר מוערך כגורם תורם חשוב ההתבגרות in-vivo הלבלב איון 10,11. המחקר הנוכחי בוחן אפקט כזה של endothelתא ial איתות ההבשלה של האדם חברתיות ותרבותיות ובתאים הנגזרות הלבלב לייצר אינסולין תוך איון דמויי תאים. אנו מדווחים על פרוטוקול רב שלבית בידול מכוון שבו ESCs האדם הנגרמת על ידי 1 Activin יחד עם עיכוב של מסלול PI3K כלפי האנדודרם. מפרט הלבלב של תאים האנדודרם מושגת על ידי עיכוב של סוניק הקיפוד איתות ידי Cyclopamine יחד עם אינדוקציה retinoid על ידי תוספת של החומצה הרטינואית. השלב האחרון של ההתבגרות הוא המושרה על ידי איתות תא האנדותל מושגת על ידי תצורת שיתוף תרבות. בעוד בתאי האנדותל כמה נבדקו בתרבות משותפת, כאן אנו מציגים הנתונים שלנו בלב החולדה תאים אנדותל כלי הדם (RHMVEC), בעיקר על מנת להקל על ניתוח.

המחקר הנוכחי מתאר גישה בידול מכוון של גרימת הבחנה הלבלב של בתאי גזע עובריים אנושיים. חשיבות רבה היא מציאת תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של תא גזע עובריים אנושיים נגזר אבות לתאי הלבלב אינסולין המבטאים.

לתאי גזע עובריים (ESC) יש שני מאפיינים עיקריים: הם ניתנים להרבייה בלתי מוגבלת בתרבית (in vitro) במצב לא מובחן, והם...

פרוטוקול זה מציג בידול רב-שלבי של תאי גזע עובריים אנושיים כגישה יעילה להפקת תאים מפרישי אינסולין, עם תפוקה גבוהה יותר מאשר פרוטוקולים שפותחו בעבר. ראשית, משרים היווצרות של אנדודרם סופי (definitive endoderm) באמצעות Activin A ומעכב PI3K. לאחר מכן, כדי לעודד השראת תאי אב ללבלב (pancreatic progenitor induction), חושפים את התאים לـ dopamine A וחומצה רטינואית. לבסוף, מבצעים תרבית משותפת (co-culture) עם תאים אנדותליאליים כדי לתווך את הבשלת תאי האב של הלבלב לתאים המבטאים אינסולין.המשיכו לאנליזות פונקציונליות באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה ו-QPCR כדי להוכיח ביטוי של C-peptide ועלייה בביטוי (upregulation) של אינסולין. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון not, הוא ששיטה זו מביאה לעלייה גבוהה יותר בביטוי של אינסולין וכן לתפוקה גבוהה יותר של cpep בתרבית של תאים המבטאים זאת. גדלו מושבות של תאי גזע עובריים אנושיים H one לגודל שבין 1 ל-1.5 מילימטרים בקוטר עבור התאים CO to 12.פלטת בארות עם מיליליטר אחד לכל בארה של HESC matrigel המדולל במצע D-M-E-M-F 12; בינתיים, שפו את המצע מה-HSCs והחליפו אותו ב-MTR one. לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי גירוד (scraping). העבירו אותם לפרוכת 15 מיליליטר, הוסיפו MTR one טרי, ולאחר מכן זרעו ביחס פיצול של 1:4 בבארות של פלטת 12 בארות שקומו מראש ב-matrigel.ברגע שתאי ההתרבייה מגיעים לקוטר של 1 עד 1.5 מילימטרים, יועלה תהליך הגבוב על ידי הוספת מצע השראה לאנדודרם דפיניטיבי (definitive endoderm induction medium) המכיל activin A ומעכב PI3K מסוג wortmannin, למשך ארבעה ימים בתרבית.חידוש המצע מדי יום. יש להמשיך להשראת תאי אב ללבלב (pancreatic progenitor induction) תחילה על ידי תרבית במצע D-M-E-M-F 12 מלא המכיל 0.2 micromolar KAAD, cycl dopamine למשך 24 שעות. לאחר מכן, יש להחליף את המצע למצע D-M-E-M-F 12 מלא המכיל 0.2 micromolar של KAAD Cycl dopamine ושני micromolar של all trans retinoic acid, ולהדגיר למשך שלושה ימים תוך חידוש המצע מדי יום בתרבית.השאירו את התאים במצע הבשלה למשך יומיים לפני ביצוע שלב ההבשלה הסופי, כביקורת חיובית להבשלה in vivo של תאי פרוגניטור פנקראטיים המופקים מתאי גזע עובריים (ESC) בנוכחות מעכב ה-notch ששמו DAPT, לפני הפיצול. בחנו את התאים האנדותליאליים תחת המיקרוסקופ, לאחר מכן בצעו טריפסינזציה וספירה של התאים עבור תנאי קולטורה משולבת במגע (contact co-culture). הוסיפו מיליון תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מלבב חולדה לתאים המבדילים במצע MCDB 131 מלא.הכינו גם תרבית ביקורת של מצע co-culture עם תאי אנדותל בלבד. הניחו את כל תנאי הטיפול באינקובטור למשך שישה ימים עם החלפת מצע. אספו מדי יום דגימות תאים מסוף כל שלב בתהליך הדיפרנציאציה.חלצו RNA מ-Endo dam, מתאי אב ללבלב ומתמצת איlets בוגרות באמצעות ערכת nucleus spin E-R-R-N-A בהתאם להוראות היצרן. קבעו את איכות ה-RNA באמצעות יחס הבליעה ב-260 nanometers לעומת 280 nanometers בעזרת ספקטרופוטומטר smart spec plus וקוורץ וט. כמו כן, חשבו את ריכוזי הדגימות כך שיהיו 100 nanograms של תבנית RNA לכל דגימה.בצעו תגובות RT באמצעות ערכת reverse transcription של impromptu. המשיכו להכנת QPCR באמצעות הפריימרים המוצגים, העמיסו את התגובות למכשיר התרמוסייקラー והפעילו את תוכנית ה-QPCR. לאחר מכן, בעזרת ערכי ה-CT, חשבו את שינוי הפי (fold change) של ביטוי ה-mRNA של יעד ביחס לתאים לא מובחנים בסוף כל שלב של ההבדלה.קיבעו את התאים ב-4% formaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו פרמיאליזציה באמצעות 0.25% Triton X 100 למשך 10 דקות כדי למנוע צביעה לא ספציפית. הוסיפו 10% donkey serum ב-0.05% TX למשך 30 דקות.בשלב הבא, הוסיפו נוגדן ראשוני בתוך תמיסת חסימה (blocking buffer) והדגירו למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הדגימות עם 0.05% Triton X למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן השני המדולל בתמיסת חסימה והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.בצעו שלושה שטיפות של חמש דקות עם 0.05%X כדי להסיר גרעינים שנסבעו בצבעי horse stain בדילול של 1:1000 ב-PBS; הדגירו למשך חמש דקות, ולאחר מכן בצעו שלושה שטיפות עם PBS. רכשו תמונות של התאים המקובעים והצבועים באמצעות מיקרוסקופ הפוך ותוכנת דימוי.הוספה של activin A ו-Wnt3a לתאי גזע עובריים אנושיים לא מובחנים למשך ארבעה ימים משרה היווצרות של אנדודרם דפיניטיבי. אנליזת qRT-PCR אישרה את נוכחותם של סממני האנדודרם הדפיניטיבי הצפויים: SOX17, CXCR4 ו-FoxA2.צביעה אימונוהיסטוכימית עבור SOX 17 בירוק מראה קולוקליזציה עם הגרעין הצבוע ב-DPI בכחול כאן. התמיינות לתאי אב ללבלב לאחר הוספת cyclo, amine ו-rettino acid אוששה על ידי Q-R-T-P-C-R של סממני תאי אב ללבלב וכן על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית עבור PDX one. בשלב הסופי של ההתמיינות, תרבית משותפת במגע עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של לב חולדה הובילה לעלייה חזקה בביטוי האינסולין בתאי האב ללבלב שהופקו מ-HESC.תרביות משותפות של L עם AC LDL מסומנות RHM VEC מראות אזורים שבהם ECS נצמדו לפלטה. במקומות שבהם ישנם חללים ריקים, ניתן למצוא RHM VEC אחרים במגע ישיר עם ESC המבדיל, כצפוי. צביעה אימונוהיסטוכימית של RHM VEC מעידה על כך שלא ניתן לזהות ביטוי של אינסולין.צביעת Eptide מהווה גם סמן יעיל לתאים שהתמיינו באמצעות שיטת שיתוף-תרבית (co-culture) לאחר פיתוחה. טכניקה זו אפשרה חקירה של אינטראקציות בין תאים בתהליך התמיינות תאי גזע, דבר אשר באופן ניכר מגביר את הפונקציונליות של הפנוטיפ הבוגר.

endothelial-cell-co-culture-mediates-maturation-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

כאן מוצגת שיטה חדשה המאפשרת המרה של פיברובלסטים בעור בוגרים לתאים המפרישי אינסולין. טכניקה זו מבוססת על המרה אפיגנטית, אינה כרוכה בשימוש בווקטורים רטרו-ויראליים או ברכישת מצב פלוריפוטנטי יציב. לכן זה מבטיח מאוד עבור יישומי רפואה תרגומית.

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 + אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

פרוטוקול זה מציג השוואה בין שני פרוטוקולי אינדוקציה שונים להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) כלפי שושלות הלבלב במבחנה: הפרוטוקול האינטגרטיבי והפרוטוקול הלא אינטגרטיבי. הפרוטוקול האינטגרטיבי מייצר יותר תאים המייצרים אינסולין (IPCs).

במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית

התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין.

גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

למד פרוטוקול רב-שלבי להבשלת תאי גזע עובריים אנושיים לתאים מייצרי אינסולין באמצעות שיתוף תרבות עם תאי אנדותל. שיטה זו מגבירה את התפוקה ואת הבשלת התאים לטיפול בסוכרת.

תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי

גלה סרטונים נוספים