בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאים אפיתליאליים מתרביות רקמה תלת-ממדיות של תאים מעורבים, במטרה לנתח את השפעתם של פיברובלסטים סטרומליים על הביולוגיה של תאים אפיתליאליים. הדבר מתבצע תחילה על ידי הקמת תרביות משותפות (co-cultures) תלת-ממדיות של תאים סטרואידיים מעורבים. לאחר מכן, הספרואידים מופרדים מתרבית המטריקס על מנת לבודד את התאים האפיתליאליים לאחר תקופת התרבית המשותפת.

השלב הבא הוא ביצוע מעברים (passaging) לתאי האפיתל לאחר השלב של השקיעה המשותפת, עד שיהיו מוכנים לניתוח. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעות החשיפה לפיברובלסטים בתרבית תלת-ממדית על התנהגות תאי האפיתל באמצעות דימוי מיקרוסקופי של התרביות וניתוח של התרבית לאחר השקיעה המשותפת. תאי אפיתל, כגון בדיקות דימוי פלואורסצנטי של פלישה למטריקס ונדידה ב-Transwell כפי שמוצג כאן. את הפרוצדורה ידגים קווין, עמית מחקר מהמעבדה שלי, ביום שלפני הקמת התרביות המשותפות.

הוציאו את ה-Matrigel מהמקפיא והמיסו אותו על קרח במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. ביום הניסוי, הניחו את תווך התרבית על קרח לפחות שעה אחת לפני ערבובו עם ה-Matrigel. כדי לדלל את ה-Matrigel שהופשר.

הוסיפו לשפופרת סטרילית על קרח מחצית מהנפח של מצע H Mac קר מאוד, הדרוש עבור תרבית השיתוף (co-culture). לאחר מכן, הוסיפו לשפופרת את אותה מחצית מהנפח הכולל של matrigel מופשר כדי להגיע לדילול של אחד ለአחד, תוך שמירה על השפופרת על קרח. לאחר מכן, העבירו 50 µL מתערובת מצע ה-matrigel למרכז הבארות המיועדות בפלטה בעלת 24 בארות, והדגרימו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם אוויר לח 5% CO2 למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 450 µL נוספים של תערובת מצע matrigel לבארים והדגרימו למשך 60 דקות נוספות. במהלך ההדגרה השנייה, הכינו תרחיף ביחס של 1:1 של פיברובלסטים ותאים אפיתליאליים בריכוז של 0.5 $\times$ 10⁵ תאים בכל 0.5 mL של מצע H me. לאחר שתערובת מצע ה-matrigel תתגבש, טפטפו בעדינות את תרחיף התאים על גבי הג'ל והחזירו את התרבית לאנקובטור למשך יומיים.

החליפו את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים על ידי שאיבה עדינה מאוד של המצע מצד הבאר והחלפתו בעדינות במצע HEC טרי. עקבו מדי יום אחר היווצרות הספרואידים תחת המיקרוסקופ, וצלמו במידת הצורך באמצעות מיקרוסקופיה של אור או פלואורסצנציה. התחילו בהעברת התרבית למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפית זכוכית סטרילית של 2 ml. לאחר מכן, העבירו את התרבית בעזרת פיפית הזכוכית לפOfWeekל צנטריפוגה סטרילית של 15 ml וסבבו במ centri-fuge למשך 10 דקות ב-350 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, הספרואידים התאיים ישקעו לתחתית הפובלה.

השתמשו בטיפ של פיפט פסטור סטרילי כדי להסיר בעדינות את ה-matrigel המפורק מהחלק העליון של הצנטריפוגה. להכנה, הוסיפו כעת 1 mL של מצע H mac למשקע, ערבבו על ידי שאיבה ופליטה (pipette up and down) פעמיים עד שלוש פעמים באמצעות פיפט זכוכית סטרילי של 2 mL, והעבירו את התרבית לבאר בצלחת תרבית רקמות של 24 בארות. אפשרו לסרטואיד להיצמד למצע למשך 48 שעות לפחות לפני החלפת המצע.

עם הזמן, התאים יעזבו את מבנה הספרואיד ויגדלו כשכבות חד-שכבתיות (monolayers). לאחר שתשקיפי התאים יגיעו ל-50% Confluence, העבירו אותם באמצעות פרוטוקול סטנדרטיזציה לצלוחית של 35 מילימטר למשך יומיים עד ארבעה ימים, ולאחר מכן העבירו אותם לצלוחית של 100 מילימטר למשך שלושה עד חמישה ימים לפני המשך ניתוח התאים. השתמשו בפיפטת פסטור סטרילית כדי לשאוב את המצע, ולאחר מכן הסירו ידנית כמה שיותר שאריות של ספרואידים. בתרביות שיתוף (co-cultures) תלת-ממדיות של ספרואידים, פיברובלסטים עם השתקה מהונדסת של TM one, כפי שמוצג כאן בדמויות D, E ו-F, גורמים להגברת פלישה למטריקס על ידי תאי אפיתל של השרונים בהשוואה לפיברובלסטי השליטה בדמויות A, B ו-C. שימו לב לבליטות האפיתליות הפולשות למטריקס בספרואידים המכילים פיברובלסטים עם השתקת TM one, כפי שמצוין בחצים בדמויות D ו-F. פיברובלסטי עם ביטוי יתר מהונדס של TM one, המוצגים כאן בדמויות J, K ו-L, גרמו להפחתת הפלישה של שורת תאי סרטן השרונים sum 1 59 בהשוואה לפיברובלסטי השליטה בדמויות G, H ו-I. השוו את היעדר הבליטות האפיתליות בספרואידים המכילים פיברובלסטים מהונדסי TM one לאלו המכילים פיברובלסטי שליטה, כפי שמצוין בחצים בדמויות G ו-I, לאחר שהוקמו ספרואידים של תרבית שיתוף.

ניתן לבודד אוכלוסיות תאים מסטרטואידים באמצעות זריעה מחדש בהקשר דו-ממדי. תמונה מורכבת זו מציגה תרביות תחת מיקרוסקופיה של אור ופלוורסצנציה לאחר בידודן מתרבית matrigel. יום אפס מייצג הדמיה מיד לאחר הבידוד; ימים אחד, שני וחמישה מציינים את הימים שחלפו לאחר הבידוד.

שימו לב כי써 הילה של תאים העוזבים סטרואיד זה גדלה עם הזמן. בסופו של דבר, נותר סטרואיד "רפאי" (ghost steroid) עם תאים מעטים מאוד, כפי שמודגש כאן על ידי החץ. סטרואידים מעטים מאוד נותרים לאחר הסרת הסטרואידים הרפאיים ומעבר (passage).

בהתאם לקצבי הגדילה היחסיים של התאים שנבדקו. אוכלוסיות טהורות עשויות להיווצר באמצעות מעברים סדרתיים (serial passage) או שניתן יהיה למיין אותן באמצעות סממנים תאיים מתאימים. בדוגמה זו, דגימות נותחה באמצעות ציטומטריה של זרימה, תוך שימוש בפלואורסצנציה ירוקה ובפלואורסצנציה אדומה כדי לזהות פיברובלסטים המבטאים GFP ותאי אפיתליום המבטאים mCherry, בהתאמה, לצורך קביעת האוכלוסיות היחסיות של תאי אפיתליום ופיברובלסטים.

לאחר בידוד מתרבית השיתוף התלת-ממדית (3D co-culture), תאי אפיתל שומרים על התכונות שהוענקו להם כתוצאה מהתרבית המשותפת עם פיברובלסטים לאורך פרקי זמן ממושכים, דבר המאפשר הזדמנות רבה לניתוח. בדוגמה זו, חשיפה לפיברובלסטים חסרי TM one הובילה להגברת נדידה בתאי H max שגודלו בתרבית שיתוף, נדידה זו נמשכה שבועות לאחר הבידוד מהתרבית התלת-ממדית בהשוואה לחשיפה לפיברובלסטים של ביקורת, המסומנים כאן כ-C בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח שינויים בביטוי גנים ובסימנים אפיגנטיים, על מנת לענות על שאלות נוספות בנוגע להשפעותיהם של פיברובלסטים על תאי אפיתל.