לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים
14 ביוני 2012
Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה כרומוזום תסיסנית עוברים באמצעות לייזר Leica מערכת סריקה confocal.
מטרת ניסוי זה היא להדגים ויזואליזציה של דינמיקת חלבונים ודפוסי לוקליזציה in vivo בעוברים חיים של drosofilla באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של צילומי time-lapse. זאת על ידי איסוף ראשוני של עוברים ממאגרי drosophila מתוחזקים. לאחר מכן, העבירו את העוברים לשקופית והסירו ידנית את הגלומות מהעוברים עד לקבלת עוברים חשופים.
לאחר מכן, הדגימות מורכבות באופן מאורגן על שקופיות שהוכנו מראש, ובהתאם לניסוי, ניתן לבצע הזרקה מיקרוסקופית של ריאגנטים מתאימים המשרים נקודת בקרה של כישורה (spindle checkpoint). השלב הסופי בהליך זה הוא ביצוע הדמיית time-lapse של העוברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בסופו של דבר, נעזרים ב-time-lapse ובמיקרוסקופיה מוקדית כדי להראות את חלבוני נקודת הבקרה של הכישורה, התנהגות של כרומוזומים בקו-לוקליזציה, ואת ההשפעה של חומרים משרים של נקודת הבקרה בקווי תאי oph טרנסגניים הקשורים לנקודת הבקרה.
השיטה יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הבקרה של ה-ME, כגון השפעת מוטציות או מחיקה של חלבון ה-spindle checkpoint באמצעות שימוש בקווי גנים על הקולוקליזציה של רכיבי בקרה אחרים, וההשלכות של כך על היכולת של ה-spindle assembly checkpoint לתפקד ביעילות. זבובים טרנסגניים נשמרים בטמפרטורה של 25 °C בתוך מבחנות פלסטיק המכילות מזון לזבובים, עם תוספת של אבקת שמרים יבשה בחלק העליון. מחליפים את המבחנה באופן שוטף מדי שבועיים עד שלושה שבועות, בהתאם לתנאי הגידול.
להכנת מזון לזבובים, חממו כמות מתאימה של תערובת מזון לזבובים תוך כדי ערבוב קבוע כדי להמיס את הרכיבים באמצעות משאבה פריסטלטית, וחלקו שמונה עד 10 מיליליטר של מצע זה כדייסה לתוך כל בקבוקון פלסטיק. כאשר דייסת המזון התקשתה והגיעה לטמפרטורת החדר, פנקו כל בקבוקון עם פקק ספוגית מכותנה. הניחו בקבוקוני מזון אלו במגש, אטמו בשקית פלסטיק ושמרו בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס לצורך איסוף ביצים בקנה מידה קטן.
העבירו כ-50 זוגות של זבובים בוגרים בני יומיים עד שלושה למבחנה עם מזון זבובים טרי, שעל פניו הוספנו אבקת שמרים יבשה עבור הטלת עוברים. דגרו בטמפרטורה של 25 °C, שבמקרה זה שמורה על ידי מיזגן. בכל שעה, העבירו את הזבובים למבחנה טריה והשאירו את העוברים למשך 30 דקות.
כדי להבטיח שחלק מהעוברים שנאספו היו בשלב מחזור חלוקה גרעיני שמונה עד 10. האיסוף בשעה הראשונה נשאר בדרך כלל ללא שימוש, שכן הוא מכיל לעיתים קרובות עוברים מיושנים שנותרו בגופי הנקבות כאשר התנאים לא היו מתאימים להטלה. לפיכ労, בניסויים אלה ייעשה שימוש רק בעוברים מההעברה בשעה השנייה והלאה.
בנוהל זה נעשה שימוש בעגיות מיקרוסקופ ובכיסויים בגודל 50 על 22 מילימטר. התחל בלקיחת כיסוי, ובעזרת מכחול עדין ולח, הרטב קלות את ארבע הפינות בצד אחד עם כמות קטנה מאוד של מים. הנח את הכיסוי על עגיית מיקרוסקופ.
מתיחות הפנים הנימית הנגרמת על ידי שכבת הנוזל הדקה אמורה למנוע את תזוזת מכסי הזכוכית. מרחו פס דק של דבק הפטן במרכז מכס הזכוכית. על ההפטן להתנדף תוך שניות ולהשאיר את הדבק על מכס הזכוכית.
בשלב הבא, השתמשו בעט יהלום כדי לחתוך כיסוי זכוכית נוסף לריבועים קטנים של כ-1.5 מילימטר רבוע. הסירו ריבוע אחד והניחו אותו בקצה אחד של רצועת הדבק. ריבוע זה ישמש לפתיחת קצה המחט כאשר נדרש מיקרו-הזרקה.
קחו שקף מיקרוסקופ נוסף, הדביקו עליו חתיכה של סרט דביק דו-צדדי באורך של שני סנטימטרים והסירו את נייר הכיסוי כדי להתחיל את הליך ציפוי העובריים. העבירו את הזבובים למבחורת מזון רעננה באמצעות מברשת עדינה ולחה. העבירו כ-50 ביצים אל הסרט הדביק הדו-צדדי שעל השקף שהוכן.
השתמשו בכמות מתאימה של נוזל כדי לאפשר לביצים להתפרוס. כאשר הנוזל יתאדה, הביצים יידבקו לסרט הדבק תחת מיקרוסקופ דיסקציית. געו בעדינות בביצים מספר פעמים לאורך הציר הארוך שלהן בעזרת הצד החיצוני של חצי מזוג פינצטות, עד שה-Corian יישבר וייפתח.
השאירו את העובר בתוך מעטפת הקוריאן (Corian shell) כדי למנוע התייבשות מהירה. המשיכו בתהליך זה עד שיוטפלו 10 עד 20 ביצים. לאחר מכן, הסירו את העוברים ממעטפת הקוריאן אחד אחד והניחו אותם בעדינות בסרט אנכי.
על רצועת הדבק. יישרו את העוברים כך שהצד הארוך שלהם יהיה מקביל אך הפוך לצד הארוך של רצועת הדבק. הניחו את העוברים בתא ייבוש למשך שלוש עד שמונה דקות.
לבסוף, כסו את העוברים בכמות מתאימה של שמן מינרלי (volter left tennis oil) כדי למנוע התייבשות יתר לפני המיקרו-הזרקה. המיקרו-הזרקה היא ההיבט המורכב ביותר של פרוצדורה זו. כדי להפוך את המיקרו-הזרקה לקלה ויעילה ככל האפשר, יש לעקוב אחר הפרוטוקול הספציפי להכנת השקופית.
יש להכין את העוברים בזהירות כדי שיהיו במצב אופטימלי למיקרו-הזרקה. את המחטים למיקרו-הזרקה של עוברים מכינים מראש. באמצעות קצה טעינה דק, מלאו לאחור מחט ב-1 עד 2 µL של ריכוז מתאים של הרכיב בבופר הזרקה.
החזיקו את המחט בתוך תומך המחטים במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך מדגם Leica TCSP שני, כאשר צינור הלחץ מחובר למערכת הבקרה של ההזרקה. אתרו עובר תחת עדשה פי 40. לאחר מכן, אתרו את צללית המחט מבלי לשנות את מישור המיקוד.
פעולה זו מבוצעת על ידי הזזת המחט למרכז שדה הראייה והורדתה בהדרגה עד למישור המוקד הימני. הזזו את במה של המיקרוסקופ בעדינות רבה כדי למצוא את ריבוע הזכוכית של כיסוי הדגימה (cover slip) המותקן מראש בקצה אחד של פס הדבק. הזזו בעדינות רבה את קצה המחט עד שייגע בקצה ריבוע הזכוכית הקטן וישבור אותו בעדינות.
הזיזו את הבמה כך שהעוברים יחזרו לשדה הראייה ובחרו עובר בגיל המתאים להזרקה. הזיזו בזהירות את העובר קרוב למחט וכוונו מחדש את מיקוד המישור עבור העובר והמחט כאחד. הזיזו את העובר אל תוך המחט.
הזריקו טיפה של ריאגנט לצד העובר ולאחר מכן הסירו את העובר. סרטי Time lapse או תמונות בודדות של עוברים חיים נאספים באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה כפולה מסוג Leica TCSS SP עם עדשת שיקוע בשמן פי 40. כאשר מדמיינים מספר פלואורופורים בעלי ספקטרום חופף המובעים יחד באותו עובר, אורך הגל של פליטת כל חלבון פלואורסצנטי נאסף באופן סדרתי.
התמונות התקבלו מאוחר יותר בעת קביעת מסגרות הזמן לצילומי time-lapse. יש להביא גורמים אלו בחשבון. תמונה בודדת מתקבלת בדרך כלל כממוצע של שני קווי סריקה.
עם ממוצע של שתי סריקות פרמיות, נדרשים לפחות 6.3 שניות לסריקת תמונה של 512 על 512 פיקסלים במצב סריקה סימולטני, ו-15.44 שניות במצב סריקה סקוונציאלי, כדי להפיק יחס אות לרעש טוב. החור (pinhole) מכוון בדרך כלל ל-1 עד 2 au או יחידות איירי (airy unit), והספק הלייזר מותאם לרמה הנמוכה ביותר האפשרית כדי למנוע פוטו-بلیச்சிנג (photo bleaching) משמעותי. סרט time-lapse מייצג זה מראה את הגיוס הקינטי הדינמי של CDC 20 אל הליבה ותנועת כרומוזומים בעוברים חיים של ophs in cial.
צילומי Time-lapse נלקחו מעובר טרנסגני ראשוני המבטא את G-F-P-C-D-C 20, המוצג בירוק, ואת RFP his stone two B המוצג באדום. במהלך מחזורי חלוקת הגרעין, צולמו שבעה עד שמונה פריימים בכל 10 שניות, והפריים שבו התאים כבר נמצאים בפרופאזה (prophase) הוגדר כנקודת זמן אפס. איור זה מציג פריימים מסרט ה-time-lapse; ניתן להבחין ב-G fp CDC 20 בקולטיקינchord (kinetochores) של הפרופאזה והפרומתפאזה, כפי שמסומן בחצים הלבנים בתמונות שלוש וארבע בהתאמה, והוא נשאר על הקולטיקינchord של המטאפאזה והאנפאזה, כפי שנצפה בתמונות חמש ושש בהתאמה.
G-F-P-C-D-C 20 מוּדחה מהגרעין בממשק המסומן על ידי ראש החץ הלבן בתמונה אחת, ונכנסת לגרעין בשלב הפרופזה המוקדמת כפי שמוצג בתמונה שתיים. בתמונות שמונה עד 14 נקבעו מורפולוגיות של כרומטין באמצעות מרקרי RFP histone 2B שהובעו יחד ובצורה ממוזגת. התמונות מוצגות בשורה התחתונה.
באמצעות פרוטוקול זה ניתן לחקור את תפקודי נקודת הבקרה של הרכבת כישורי המטפאלים (spindle assembly checkpoint או SAC) על ידי מניפולציה של העוברים באמצעות הזרקה מיקרוסקופית של נוגדנים, חלבונים המסומנים פלואורסצנטית או תרכובות כימיות רלוונטיות שעשויות להפעיל את ה-SAC. בדוגמה זו, העוברים טופלו ב-colchicine כדי לדפולימריז את המיקרוטובולים, ובכך לעורר את ה-SACG FP CDC 20 או GFP MAD. שני אותי ליבה קינטיים שימשו כסממנים להתקדמות מחזור התא.
בפאנל העליון, ה-ARES מצביעים על הגרעינים המעוכבים בתמונות שתיים עד שש. האזור המסומן בחץ בתמונה אחת מצביע על כך שלפני הטיפול בקולכיצין, G-F-P-C-D-C 20 מוחרג מהגרעין בשלב האינטרפאזה המאוחרת. התמונות בפאנל האמצעי מראות כי בהיעדרו של MAD אנדוגני, G-F-P-C-D-C 20 המסומן בחצים בתמונות שבע עד 12 ממשיך להתנודד פנימה והחוצה מהגרעין, ועلى גבי המעטפת הגרעינית.
למרות שנראה כי הציטוקינזה פגומה, הדבר מרמז על כשל בתפקוד ה-SAC במניעת התקדמות התאים בתגובה לטיפול ב-Colchicine. דוגמה להפרדה כושלת של גרעיני הבת נצפית בתמונה 10. לבסוף, בפאנל התחתון, ראשי חצים בתמונות 14 עד 18 מצביעים על גרעיני קינטית (kinetic cores) נייחים עם הצטברות של חלבוני היתוך GFP MA two, מה שמרמז כי GFP MA two פונקציונלי מתקן את הפנוטיפ של פגם ה-sac בעובר מוטנטי של MA two.
חץ התמונה בערך 13 מצביע על הצטברות של GFP MAD 2 בגרעין בשלב אינטרפזה מאוחר. לאחר צפייה בסרטונים אלו, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן קצירת עוברים של תוכנה שניים מהגבעולים, ביצוע דה-קוורדינציה ידנית של עוברים לפני הכנת שקופיות להחדרה מיקרוסקופית וביצוע דימוי זמן-אמת in vivo באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים ויזואליזציה של דינמיקה של חלבונים ודפוסי לוקליזציה in vivo בעוברים חיים של Drosophila באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של time-lapse. השיטה מאפשרת ניתוח של התנהגות חלבוני ה-spindle checkpoint והתיאום שלהם עם תנועת הכרומוזומים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- הקינטוכור חיוני לניטור ההפרדה המיטוטית.
- הבנת הדינמיקה של חלבונים חיונית להשגת תובנות על חלוקת התאים.
- עוברי Drosophila משמשים כמודל לחקר תהליכים אלו.
- דימות Time-lapse מאפשר תצפיות בזמן אמת על אירועים תאיים.
מטרת המחקר
- להדמיה של הגיוס והתחלופה של חלבוני הקינטוכור.
- לבחינת התיאום של חלבונים אלו עם תנועת הכרומוזומים.
- להערכת ההשפעות של חומרים המעוררים את נקודת הבקרה של השpulumi (spindle checkpoint).
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף עוברי Drosophila ממקרי stock מתוחזקים.
- הכנת סליידים עבור דימות time-lapse.
- מיקרו-הזרקה לעוברים של ריאגנטים המשרים נקודות בקרה (checkpoint).
- שימוש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר של Leica לצורך דימות.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה של דינמיקת חלבוני נקודת הבקרה של הציר.
- תצפית על קולוקליזציה של חלבונים עם התנהגויות של כרומוזומים.
- ניתוח השפעת מוטציות על תפקוד נקודת הבקרה של הציר.
- ביסוס מתודולוגיה לחקר אינטראקציות בין חלבונים בעוברי חיים.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי הדינמיקה של חלבוני נקודת הבקרה של כישור המטפלה.
- מיקרוסקופיית Time-lapse יעילה לצפייה בתהליכים תאיים חיים.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים של חלוקת התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה של התנהגות דינמית של חלבוני הקינטוטור ותנועת כרומוזומים בעוברים חיים מספקת מסגרת מכנית לבחינת נאמנות המיטוזה, שהיא גורם קריטי ליציבות גנומית. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי מתן אפשרות לתצפית בזמן אמת על גיוס ותפקוד של רכיבי נקודת הבקרה של הרכבת השpulumi (SAC), דבר הרלוונטי ישירות לטיפולים בסרטן ולהסרת סיכונים מכניים בשלבי הגילוי המוקדמים. השימוש במודל הניתן למניפולציה גנטית כמו Drosophila מאפשר ביצוע של בדיקות הדמיה ניתנות לשכפול ובקנה מידה רחב, שיכולות לספק ביטחון חיזוי באסטרטגיות של מודולציה של מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת חלבוני SAC ואינטראקציות בין קינטוכולור למיקרוטובולי בזמן אמת.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על הפעלה ועכבה של נקודות בקרה בתגובה להפרעות.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכת מעורבות המטרה (target engagement) ושינוי במסלול הסיגנל על ידי קורלציה בין לוקליזציה של חלבונים לתוצאות תפקודיות, כגון מעצר מיטוטי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: ביסוס פלטפורמה הניתנת לשחזור להכנת מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה (עוברים טרנסגניים) לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך התהליך.
- פלטים כמותיים: מאפשר מדידה של קינטיקה של גיוס חלבונים, קולוקליזציה ותנועה כרומוזומלית כמדדי תפקוד לסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מדרגיות ושימוש חוזר: ניצול חלוקות גרעיניות סינכרוניות בעוברים סינציטליים ליצירת נתונים בעלי תוכן גבוה ורזולוציית זמן, המתאימים לאופטימיזציה של הבדיקה ולהשוואה בין ניסויים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: מקשר תובנות מכניסטיות לגבי הפרה של ה-SAC לפנוטיפים של חוסר יציבות גנומית הנצפים בסרטן ובהפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- המשכיות תרגומית: תומכת במעבר מאישוש מטרה במערכות מודל להערכה פרה-קלינית, על ידי ביסוס קשרים סיבתיים בין דינמיקת חלבונים לדיוק המיטוטי.
- הסרת סיכונים מכניסטית: מבהירה את מנגנוני ההפעלה וההעברה של אות ה-SAC, ובכך מפחיתה את אי-הוודאות בטרגט של רגולטורים הקשורים לקינטוכור, כגון Cdc20 או Mad2.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בזמן אמת של מעורבות המטרה ומודולציה של מסלולים, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), ובמיוחד עבור תרכובים המכוונים לוויסות המיטוזה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי ויזואליזציה של גיוס חלבוני SAC, תחלופתם ותיאום מרחבי עם תנועת הכרומוזומים במהלך ההתקדמות המיטוטית.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם תוצאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית (למשל, עוצמת פלואורסצנציה של הקינטוכור, יישור כרומוזומים) המאפשרות הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר נתונים דינמיים רב-פרמטריים (מיקום, תזמון, קולוקליזציה) המקלים על ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי והפרעות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי הדגמה כיצד תפקוד לקוי של SAC מוביל לשגיאות מיטוטיות, ובכך מספק מידע לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים לאי-יציבות גנומית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת הדמיה שניתן להשתמש בה שוב ללימוד מנגנונים מיטוטים שמורים על פני רקעים גנטיים ותנאי הפרעה שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בבקרה של SAC ובסיגנלינג של הקינטוכולור.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והסמיות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להכנת עוברים, קיבוע ודימוג תוך שימוש במדווחים טרנסגניים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של השפעות מיטוטיות לא ספציפיות (off-target), ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בקווי הפיתוח האונקולוגיים.
- השפעה על הפורט폴יו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי תרכובות המווסתות את נאמנות נקודת הבדיקה (checkpoint fidelity) בבהירות מכניסטית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול Drosophila, טיפול בעוברים ותחזוקה של קווים טרנסגניים.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה קונפוקלית עם יכולות סריקה בלייזר ו-time-lapse לצורך דימות רב-צבעים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין הצוותים בנוגע לשביעות שלבי העוברים, מיקרו-הזרקת ריאגנטים ופרמטרים של רכישת תמונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למערכות מודל אחרות או למטרות חלבון שאינן מרכיבי ה-SAC.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים של חיוניות העוברים, סיכוני פוטוטוקסיות במהלך דימות ממושך, והקושי הטכני בביצוע מיקרו-הזרקה במחזורי גרעין מוקדמים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:45
Maintaining Flies and Collecting Eggs
3:43
Preparing Coverslips and Slides
5:10
Dechorionating Embryos
6:36
Provoking the SAC by Microinjecting Embryos with Appropriate Reagents
8:55
Imaging Embryos
10:08
Results: Observing Dynamic Kinetochore Behavior and Chromosome Motion
13:28
Conclusion
