GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע

המטרה הכללית של סרטון זה היא לספק תיאור מפורט עבור אנליזה מבוססת GC של נגזרות אלדון ניטריל אצטט של גלוקוזמין וחומצה מיוקית שחולצו מקרקעות. התהליך מתחיל בעיכול חומצי, המפרק פולימרים אורגניים ומשחרר גלוקוזמין וחומצה מיוקית. לאחר מכן, מובילים את מונומרים של סוכרים חומצות-אמינו ומטהרים אותם מהתמיסה המעורבת.

לאחר מכן מתבצע תהליך נגזרת (Derivatization) כדי להפוך סוכרים אמינו אלו לאלדון ניטריל אצטטים נדיפים לצורך ניתוח מבוסס כרומטוגרפיה גזית. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא מיצוי נוזל-נוזל וקביעה באמצעות GC. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הפרדה בקו הבסיס של סוכרי האמינו מסוג אלדון ניטריל אצטט, המקרינים בין התקנים של myo ואצטול (acetol) ומתיל גלוטמין, באמצעות GC עם גילוי יינון בעירה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות הוא שהיא מאזנת באופן אופטימלי בין רגישות מדויקת, פשטות, הפרדה גרפית כרומטית טובה ויציבות בעת אחסון הדגימות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום מחזור הפחמן הגלובלי, כגון תרומתם של מיקרואורגניזמים ב-SSE למאגרים של פחמן יציב בקרקע. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות ומידע על הצטברות של שאריות מיקרוביאליות בקרקעות, ניתן ליישמה גם במטריצות אחרות, כגון מערכות אוקייניות, רקמות ביולוגיות ואפילו דגימות חוצאי-ארציות.

כדי להתחיל בפרוטוקול זה, ייבשו בהקפאה (freeze dry) דגימות קרקע לאחר האיסוף מהשטח, וגרסו והומוגניזרו את דגימות הקרקע באמצעות מטחנת כדורים לקרקע או מכתש ועלי. שקלו את דגימות הקרקע הגרוסות אל תוך בקבוקי הידרוליזה של 25 מיליליטר. הוסיפו 10 מיליליטר של חומצה כלורידית בריכוז שש מולארית לכל בקבוק הידרוליזה, ומלאו בגז חנקן לפני הסגירה ההדוקה של הפקק.

בצעו הידרוליזה בטמפרטורה של 105 °C באינקובטור למשך שמונה שעות. בעזרת מפסק טיימר אוטומטי, הוציאו את הבקירות מהאינקובטור וקררו אותן לטמפרטורת החדר.

הוסף 100 µL של myo acetol כסטנדרט פנימי לכל בקבוק. ערבב על ידי סיבוב. הגדר משפכים מפלסטיק המנקזים לתוך בקבוקי פירה בנפח 200 mL, עם מפרקים מזכוכית משחוקה בגודל taper 24 40, המונחים על כוסות פלסטיק ליציבות.

קפלו עיגולי נייר סינון איכותי מסוג Watman מספר 2 לרבעים והניחו אותם בתוך משפכים. סובבו כל בקבוק הידרוליזה ושפכו את התוךית אל המשפך. כדי לסנן כל דגימה, ייבשו את התסנן באמצעות אידור סיבובי בטמפרטורה של כ-45 °C תחת ואקום.

שסעו את השקיעה המיובשת מכל בקבוק פירקס (flask) בעזרת 3 עד 5 מיליליטר של מים ושפכו אותה לתוך מבחנת טפלון בנפח 40 מיליליטר. שטפו כל בקבוק עם מנה שנייה של מים. התאימו את ה-pH של הדגימות לטווח של 6.6 עד 6.8 באמצעות תמיסת פוטסיום הידרוקסיד בריכוז 1 מולרי כדי להשקיע יוני מתכת ומולקולות אורגניות אחרות. לאחר מכן, הסירו את המשקעים באמצעות צנטריפוגציה ב-2000 ×g למשך 10 דקות.

שפכו את העיליונות למבחנות זכוכית של 40 מיליליטר וכסו את פתחי המבחנות בפרפילם; הקפיאו את העיליונות ולאחר מכן נקבו חורים בפרפילם. ייבשו בהקפאה את העיליונות הקפואים כדי להסיר את כל הנוזל. לאחר שהעיליונות התייבשו, המיסו את השארית באמצעות שלוש מיליליטרים של מתנול יבש.

לאחר ערבול יסודי במערבל Vortex, סגרו את המבחנות ואז סובבו בצנטריפוגה ב-2000 ×g למשך 10 דקות. כדי להשקיע את המלחים, העבירו את תמיסות העל לתוך מבחנות תגובה קוניות בנפח של 3 מיליליטר, ואדו את הנוזלים עד ליובש באמצעות מכשיר אידוי מהיר (rapid VA machine) בטמפרטורה של 45 °C או תחת זרם עדין של גז חנקן יבש. לאחר האידוי, הוסיפו לכל מבחנה 100 µL של תמיסת התאושה (recovery standard) ו-methyl glutamine, וכן 1 מיליליטר של מים.

לאחר מכן, הקפיאו את הדגימות לפני תחילת תהליך הדרביזציה. הכינו סטנדרטים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, ולאחר מכן ביצעו lyophilization (הקפאה ויובש) הן לדגימות והן לסטנדרט. הכינו ריאגנט דרביזציה המכיל 32 mg/mL של hydroxylamine hydrochloride ו-40 mg/mL.

ארבעה dimethyl amino purine במתנול של purine. הוסף 300 µL של ריאגנט הגזירה לכל אחד מהמבחנות הריאקטיביות, סגור אותן היטב וערבב במיקסר (vortex) ביסודיות. הנח את המבחנות הסגורות במכחול מים בטמפרטורה של 75 עד 80 °C למשך 35 דקות.

הוצא את המבחנות מאמבט המים וקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 1 mL של acetic anhydride לכל אחת מהמבחנות הריאקטיביות בנפח 3 mL, סגור אותן היטב וערבב ב-vortex ביסודיות. לאחר מכן, בצע דגירה שנייה באמבט מים בטמפרטורה של 75 עד 80 °C למשך 25 דקות.

הוצא את המבחנות מאמבט המים וקרר לטמפרטורת החדר. כדי להתחיל בהפרדה ובמדידה, הוסף 1.5 milliliters של di chloro methane לכל מבחנה, ולאחר מכן ערבב במערבל vortex. לאחר הוספת מיליליטר אחד של hydrochloric acid בריכוז one molar לכל מבחנה וערבוב יסודי במערבל vortex, השאר את התמיסות ללא הפרעה עד להפרדת שני השלבים.

שאבו והשליכו את השכבה המימית העליונה. באמצעות פיפטור של 1000 microliter ובאותה שיטה, חלצו את השכבה האורגנית שלוש פעמים, אך השתמשו ב-1 milliliter מים בשלב השטיפה האחרון. הקפידו לוודא שכל השכבה המימית העליונה הוסרה.

ייבשו את התמיסה הסופית באמצעות VAP מהיר ב-45 °C או באמצעות זרם של גז חנקן, המיסו כל דגימה ב-300 µL של ethyl acetate hexane, והעבירו לבקבוקוני בורג ענבריים של 2 mL עם אינסרט לנפח קטן וסגרו היטב לצורך כימות בניתוח של כרומטוגרפיית גזים עם גלאי יינון להבה (FID), תוך שימוש בעמודה קפילרית לא פולרית מסיליקה מותכת כגון DB five, כפי שמוגדר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הרצה וניתוח סטנדרטיים, כווננו את קצב זרימת גז הנשיאה כך שנגזרות ה-acetol glucosamine וה-mu amic acid יאלוטו ב-250 °C, וה-end methyl glutamine יאלוט ב-270 °C.

בצע הזרקה בפיצול של 30 ל-1 בנפח של one microliter, כאשר כניסת ה-GC מכוונת ל-250 degrees Celsius באמצעות דוגם אוטומטי, לאחר הרצת הכרומטוגרפיה הגזית. כשלב סופי בפרוצדורה זו, בצע תיקוף של נגזרות באמצעות שיטות הכרומטוגרפיה והספקטרומטריה שנדונו בפרוטוקול הכתוב. דוגמאות לניתוח של glucosamine וחומצה אורמית מדגימי סטנדרט וממדגם קרקע מוצגות כאן; בנוסף ל-glucosamine וחומצה מוקית, ניתן לקבוע בו-זמנית שני איזומרים של glucosamine, שהם osain ו-galactose amine, באמצעות השיטה, בהתבסס על הכמות המדויקת של הסטנדרטים שהחלו והמקדמי תגובה של כל שני סטנדרטים פנימיים.

ניתן לקבוע את הכמות של סמנים ביולוגיים אלו בדגימות הקרקע. תקן התשואה שימש גם לניטור איכותני של תהליך הגזירה. הסכימות ליצירת aldon nitrile acetate, נגזרת glucosamine וחומצה muic מוצגות כאן.

מספר אחת מייצג את תגובת הניטריל, ומספר שתיים מייצג אצטילציה. המבנים המוצעים של פרגמנטים יוניים שנוצרו בעקבות יינון אלקטרוני נבחנו על ידי השוואת ספקטרומי היונים של דגימות שהוכנו עם שילובים שונים של איזוטופים. כאן מוצגת הזזת המסה של היון הדומיננטי של נגזרת אלדון ניטריל אצטט של גלוקוזאמין בתרחישים שונים.

בדוגמה זו, ההכנה בוצעה עם חומרים שאינם מסומנים, כמו גם עם אצטילכלוריד מסומן איזוטופית וגלוקוזמין מסומן איזוטופית. הכוכבית על המבנה הכימי מייצגת את אטום האיזוטופ הכבד או את קבוצת האיזוטופים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על תנאים אנहाइडריים קפדניים במהלך הדרייבטיזציה.

הן הממסים האורגניים והן כלי הזכוכית המשמשים בשלב זה חייבים להיות יבשים. בעוד שספקים רבים מוכרים ממסים אנסידריים (anhydrous), ניתן לייבש את אלה שביד על ידי העברתם דרך עמודות המכילות סוכני ייבוש כגון מגנזיום סולפייט. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרומטריית מסות ליחסים, על מנת להשיב על שאלות נוספות כגון כיצד מגיבים המאקרו-ביוטיות, וכיצד פחמן או חנקן מתחלפים ונצברו בקרקעות על ידי בידול בין מאקרו-סביבות חיות למתות לאחר התפתחותן.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי המקרו-אקולוגיה, הביולוגיה והכימיה של הקרקע, לבחון את התרומה של מקרו-אורגניזמים לחומר אורגני בקרקע ולסבסבציה (sequestration) במערכות קרקעיות טבעיות או מנוהלות.