אימון סיבולת פרוטוקול מבחני ביצועים ארוכי טווח עבור תסיסנית melanogaster

מטרת הניסוי הבא היא לאמן זבובים מסוג Dsof ו-Melanogaster באמצעות תוכנית חדשנית של אימוני סיבולת ולהעריך את השפעות אימוני הפעילות הגופנית. דבר זה מושג באמצעות מכשיר אוטומטי המרים ומפיל באופן חוזר מספר מבחנות של זבובים, ובכך מפעיל את תגובת הטיפוס האינסטינקטיבית של הזבוב, ומספק להם כך סשן אימון. הזבובים מאומנים מדי יום בלוח זמנים מדורג של שעתיים עד שלוש שעות לאורך תקופת אימון של שלושה שבועות.

בשלב הבא, הזבובים נדרגים למגוון בדיקות התנהגותיות במטרה למדוד את השפעות הפעילות הגופנית. התוצאות מראות כי זבובים שעסקו בפעילות גופנית מטפסים מהר יותר, כפי שנמדד בבדיקת ה-negative geo axis המושרה במהירות או בבדיקת הטבעת (ring assay). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימון סיבולת בבעלי חיים אחרים, הוא אוסף הכלים הנרחב הזמין למניפולציה גנטית של drosophila.

במחקר על פעילות גופנית של סיבולת, הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביצענו מספר רב של בדיקות geo taxis שליליות בודדות. תהינו כמה זמן זבובים יכולים להמשיך לטפס והאם נוכל לאמן אותם לסיבולת בדרך זו. מגדל הכוח (power tower) בנוי על פיסת עץ רב-שכבתית מלבנית המהודקת לשולחן.

סיבוב של 4.5 סיבובים לדקה. מנוע גלגלי שיניים מונח על מספר לוחות ומחובר לבקר מהירות, נתיך ומפסק חשמלי. בתוך קופסת חיבורים, מאוורר של שלושה אינץ' המוחזק בתוך צינור מתכת מופנה לעבר המנוע לצורך קירור.

למנוע מחוברת זרוע מסתובבת עם גלגלת. בקצה, המנוע והזרוע מסתובבים ודוחפים מטה צד אחד של מוט כפוף המחובר לעץ הרבדי. עם ציר דלת בצדו השני של המוט, מחובר גלגל כך שיוכל להתגלגל כנגד פלטפורמה.

היא נעה למעלה ולמטה בעוד המנוע מסתובב; עוצמת המנוע מכוונת כך שמשך מחזור סיבוב מלא הוא 15 שניות. על הפלטפורמה מחוברים מתקני מבחנות לזבובים באמצעות גומיות מתיחה, והמבחנות המוצבות במתקנים אלו מאובטחות באמצעות רשת המחוברת גם היא לפלטפורמה. באמצעות גומיות המתיחה, הפלטפורמה מסוגלת להחליק למעלה ולמטה לאורך מסילות מגירה סטנדרטיות, וכרית מסטירופור בולמת את זעזוע הנפילה. מגדל הכוח מופעל בחדר בבקרת טמפרטורה כדי להתאים לתנאים שבהם גודלים בעלי החיים.

לביצוע ניסוי פעילות גופנית, דרושים לפחות 240 זבובים זכרים בעלי גיל תואם לצורך ניטור אורך של סיבולת ויכולת טיפוס (negative geo axis). יש להחזיק את הזבובים באוכלוסיות של 20 פרטים לכל מבחנה. חלק את המבחנות לשתי קבוצות שוות בגודלן, אחת מהן תבצע פעילות גופנית; את המבחנות של קבוצה זו יש לסגור באמצעות פקקי פלוגים (flugs), ואילו את קבוצת הביקורת יש לסגור באמצעות פקקי ספוג.

משתמשים בספוג לצורך קיבוע מכיוון שגודלו המותאם מאפשר הצבה קלה ליד תחתית הבקבוקון. חומר הספוג הרך יותר מפחית גם פגיעות הנגרמות על ידי פקקי השעם המוצקים יותר. יש להחליף את בקבוקוני המזון בכל יום שני לפני הבדיקה.

במהלך האימון, הזבובים נשארים בתוך מבחנות המזון כיוון שבשימוש במבחנות ריקות, זבובים רבים יותר סובלים מפציעות הקשורות לאימון. בעת העמסת מבחנות זבובי הביקורת על מגדל הכוח (power tower), דחפו מטה את פקקי הספוג שלהן עד לגובה של כ-3 מילימטרים מעל מפלס המזון, ובכך הגבילו את תנועת הזבובים.

תנועה לקבלת תוצאות עקביות. יש לבחון את שתי קבוצות הזבובים חמישה ימים רצופים בשבוע, תוך שימוש בלוח זמנים מדורג המעלה את משך המפגש משעתיים לשלוש שעות ביום לאורך תקופה של שלושה שבועות. כמובן, ניתן להשתמש בכל משטר אחר.

עקביות בטיפול, בשעה ביום ובשיטות הבדיקה לאורך תקופה של שלושה שבועות היא חיונית. תזמון קפדני ותרגול של הפרוטוקולים מפחיתים את הסיכוי לטעויות עקב עייפות. ניתן לבצע את הבדיקות באופן לרוחבי בזבובים לפני, אחרי או במהלך משטר האימון.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם להערכת תגובה בטוחה יותר למשתנה סביבתי. בצעו את בדיקת העייפות ביום שבו לא מתבצע אימון. בתחילת היום, העמיסו את שתי קבוצות הזבובים על מגדל הכוח (power tower).

הפעילו את המכשיר ועקבו אחר כל מבחנה אחת ל-10 דקות. אם בארבע טיפות רצופות, חמש זבובים או פחות במבחנה מטפסים לגובה של יותר משני אינץ', קבוצת הזבובים הזו תיחשב כעייפה. הוציאו את הזבובים העייפים ממגדל הכוח בעודו פועל ורשמו את זמן ההוצאה.

יש לעקוב אחר כל המבחנות למשך 10 שעות לכל היותר ולרכז את התוצאות. בדיקה אחת לצורך כימות. השפעות האימון הן מדידה יומית של מהירות הריצה, אותה ניתן לבצע לאורך משטר האימונים ומעבר לו.

למדידת ההשפעה ארוכת הטווח של האימון. כדי להתחיל את בדיקת מהירות הטיפוס או בדיקת הטבעת, העבירו ראשית את הזבובים לבקבוקונים חדשים וריקים והניחו שורה של שישה בקבוקונים במעמד לבקבוקונים. השתמשו בחתיכות סרט דביק מגולגלות כדי לקבע את הבקבוקונים למעמד.

לאחר מכן, הניחו את המגש לפני מקור אור, כגון קופסת תצוגה לרנטגן, שתספק תאורה אחידה של המבחנות. כעת הגדירו מצלמה לצילום המגש כך שמיקומו של כל זבוב יהיה גלוי בכל מבחנה. לאחר מכן, הקישו על שש המבחנות כדי להפיל את כל הזבובים לתחתית המבחנות וצלמו תצלום תזמוני.

שנייה אחת לאחר שכל הזבובים הופלו. במידה ומשתמשים בפלאש של המצלמה, יש להשתמש בו באופן עקבי. חזור על תהליך זה ארבע פעמים עבור כל סט של מבחנות לפני המעבר למגדל הכוח (power tower).

כדי לנתח את הנתונים, יש לדרג כל תמונה בנפרד באמצעות תוכנה למציאת הגבולות העליונים והתחתונים של המבחנה. לאחר מכן, יש למדוד את גובה הטיפוס עבור כל זבוב. לבסוף, העתיקו את גבהי הטיפוס לתוכנת excel.

לכל זבוב בכל מבחנה ניתן ציון מאפס עד ארבע, התואם לגובה הרבע. הם מטפסים לרמה 4 עבור הרבע הגבוה ביותר ולרמה 0 אם אינם מטפסים כלל. עבור כל מבחנה, חשבו את הציון עבור כל אחד מ-20 הזבובים והוציאו את הציון הממוצע של הקוהורט.

מדד זה נקרא מדד הטיפוס. הממוצע של ארבעת מדדי הטיפוס של כל קוהורטה באותו יום משמש לניתוח הנתונים. אם תוכנה לעיבוד תמונה אינה זמינה, ניתן לסמן קווי רבעים על המבחנות הריקות, ולהקצות לזבובים ערכי רבע באופן ידני, בעוד שזבובים מסוג זה הגיבו לפרוטוקול סיבולת עם ירידה מופחתת ביכולת הטיפוס הקשורה לגיל.

דבר זה נשמר גם לאחר סיום האימון, כפי שבא לידי ביטוי במבחני טבעת אורכיים לאורך חמישה שבועות גיל. לפיכך, ניתן להשתמש בהשראת פעילות גופנית באמצעות תוכנית ה-power tower כקלט התנהגותי, ולהעריך את היכולת של גורמים גנטיים או סביבתיים לווסת השפעה זו. באופן הפוך, ניתן להשתמש ב-power tower גם כפלט.

לדוגמה, כאשר נבחנו זבובים בעלי אחוזי סוכרוז משתנים בתזונתם לבדיקת הזמן עד לעייפות, נמצא כי תכולת סוכרוז מוגברת נמצאה במתאם עם קיבולת סיבולת מוגברת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שכל קבוצות הזבובים תואמות בגילן, וכי השיטות מבוצעות באופן עקבי לאורך כל מהלך הניסוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לבצע אימון סיבולת והערכה של זבובים מכל גנוטיפ.