בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

מטרת פרוצדורה זו היא לבודד את חלבוני הפריון המסיסים והבלתי מסיסים (PRP) מכל הרצועות במוח אנושי תקין. דבר זה מושג תחילה על ידי הומוגניזציה של רקמת מוח אנושית ובידוד הפראקציות. לאחר מכן, מבוצעת שיקוע במהירות (velocity sedimentation) במדרגות ריכוז של סוכרוז.

לאחר מכן מבצעים כרומטוגרפיה של הדרכה על פי גודל (size exclusion chromatography). לבסוף, PRP נלכד באמצעות חלבון gene five או G five P. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות בידוד של PRP מסיס ובלתי מסיס או ליגנדים מהמוח האנושי הרגיל באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה במדרגות ריכוז של סוכרוז, כרומטוגרפיה של הדרכה על פי גודל, ולכידת PRP באמצעות G five P. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר של מחלות פריונים, כולל מחלת קרוץפלד-יקונוב,ו BO pontoon encephalopathy, ומחלות דגנרציה קליניות. יתרה מכך, הן יכולות לספק תובנות לגבי בידוד של אגיגרטי חלבון מסיסים ובלתי מסיסים, לא רק עבור מחלות פריונים, אלא גם עבור מחלות אחרות כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטות אלו יתקשו בביצוען, כיוון שכל השלבים הניסויים חשובים ודורשים זהירות יתרה. הדגמה חזותית של שלבים אלו היא קריטית, מכיוון שסינון ה-SEC ולכידת ה-PRP עם G5P הם שלבים מורכבים לביצוע שעלולים להיכשל ללא פעולה מדויקת יותר. כדי להכין הומוגנאט ממוח, התחילו בהוספת 100 µL של לביס באפר (lysis buffer) ל-100 mg של רקמת מוח קפואה; הומוגניזו את הרקמה על קרח באמצעות פסטל ממונע, הקפיאו אותה על קרח יבש למשך חמש דקות והומוגניזו אותה פעם נוספת.

הכינו הומוגנאט מוח כולל בריכוז של 20% או 10% על ידי הוספה של 300 או 800 µL, בהתאמה, של בופר ליזיס. באמצעות צנטריפוגת שולחנית, סובבו את ההומוגנאט ב-1000 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. אספו את ה-SNA באמצעות צנטריפוגה עם רוטור S SW 55, וסובבו את פראקציית ה-S1 ב-35,000 RPM למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C.

העבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. השעירו את המשקע שאינו מסיס בדטרגנט בבופר ליזיס כדי להכין דגימות ל-western blot. דגרו את פראקציות S2 ו-P2 עם 50 micrograms per milliliter של proteinase K למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius.

סיימו את העיכול על ידי הוספה של 5 mM PMSF ותמיפת דגימה של SDS. הרתיחו את הדגימות למשך 10 דקות והמתינו לקירור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לצורך ביצוע שיקוע במהירות (velocity sedimentation), התחילו בהדגרה של 450 µL מהfraciton S one בריכוז 20% עם נפח שווה של 2% Sarco X במים על קרח למשך 30 דקות, בתוך מבחנות צנטריפוגה של 5 mL. הוסיפו 0.5 mL מכל אחד מהריכוזים 60%, 30%, 25%, 20%, 15% ו-10% של סוכרוז. העמיסו 0.4 mL של incubator S one על גבי מדרג הסוכרוז של 10% עד 60%.

סנטריפוג את מדרגות הגרדיאנט ברוטור SW 55 במהירות של 48,000 RPM למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס מהחלק העליון של המבחנה. אסוף 12 פראקציות שוות של 283 µL כל אחת. השתמש ב-20 µL מכל פראקציה ובנפח שווה של בופר דגימות SDS.

להכנת דגימות לג'ל SDS page. הרתיחו את הדגימות למשך 10 דקות, ולאחר מכן קיררו אותן למשך ארבע דקות. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 1000 G למשך דקה אחת.

לאחר מכן ערבבו אותם במערבל vortex לפני העמסתם על ג'ל מוכן של הפרדה לפי גודל. כרומטוגרפיה משמשת לקביעת המצב האוליגומרי של מולקולות PRP. התחילו בהעמסת נפחי דגימה של 200 µL של שבעה סמני מסה מולקולרית נפרדים על עמודה של 1x30 של חרוזי SUEx 200 HR.

השתמשו בנפח האלוציה של דקסטראן כחול כנפח המת () . חשבו את נפחי שיא האלוציה של VE מהכרומטוגרמה ומהשימורי הפראקציונליים. חשבו את KAV, מקדם החלוקה, באמצעות המשוואה KAV שווה ל-V פחות V zero חלקי VT פחות V zero.

ליצירת עקומת כיול, שרטטו את ה-KAV של סטנדרטי החלבון אל מול הלוגריתם של המשקל המולקולרי של הסטנדרטים. לאחר מכן, העבירו 200 µL של S one לעמודה בקצב זרימה של 0.25 mL/min.

שטפו את העמודה עם lysis buffer 1%cile והנחילו פראקציות של 0.25 milliliter באמצעות אספן פראקציות. דגרו 125 µL מכל פראקציה עם 500 µL של methanol שקולל מראש בטמפרטורה של -20 °C למשך שעתיים. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 13,000 G למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

ריס, השCב את המשקע ב-20 µL של תמיסת דגימה SDS והסבהה בבישול למשך 10 דקות. קירר לטמפרטורת החדר והפרד על ג'לים של 15% poly acrylamide. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי להסיק את המשקלים המולקולריים של מיני ה-PRP השונים שהופקו כדי לצמיג את מולקולת ה-G five P לחרוזי המגנט.

דגרו 100 µg של G five P עם 350 µL של חרוזי מגנט פועלים מסוג toci ב-1 mL של PBS בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 שעות. השתמשו במגנט חיצוני כדי למשוך את חרוזי ה-G five P לדופן מבחנות ה-eppendorf והסִירו את התמיסה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 1 mL של PBS עם 0.1%BSA כדי לחסום קישור לא ספציפי.

דגרו את החרוזיים המשולבים ב-G5P במיליליטר אחד של 0.2 M Tris-HCl, pH 7.4 המכיל 0.1% BSA למשך חמש שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, שטפו את החרוזיים שלוש פעמים. הסירו את השטיפה האחרונה והוסיפו מיליליטר אחד של PBS כדי לבודד PRP. דגרו 100 µL של S1 או P2 עם 60 µL של חרוזיים משולבים ב-G5B במיליליטר אחד של תמיסת קישור (binding buffer) תחת סיבוב קבוע למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.

הנח את המבחנה על המגנט. הסר את התמיסה ושטוף את החרוזים שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה. הסר את השטיפה האחרונה והוסף תמיסת דגימה SDS.

חממו את החרוזים בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. העמיסו את הדגימות על ג'לים מוכנים (precast) בריכוז של 15% והריצו במתח של 150 V למשך כ-80 דקות. העבירו את החלבונים לממברנת PVDF במתח של 70 V למשך שעתיים, לאחר חסימה של הממברנות ב-5% חלבון חלב ב-TBST.

דגרו אותם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם הנוגדנים ל-PRP. לאחר הדגרה עם נוגדנים משניים המשורשרים ל-HRP, דגרו את הממברנה עם תמיסת כימילומינצנציה בה accordance עם הוראות היצרן, וחשפו את הסרט כפי שניתן לראות כאן בהשוואה לדגימות של מחלת CRUT valve jaakko או CJD ספורדית. כמות קטנה של PRP תאי בלתי ממיס זוהתה בפרקציית P 2 ממוחות נורמליות.

עם זאת, רוב החלבון השתקם בשבר S two. PRP בלתי ממיס מהווה כ-5% עד 25% מכלל ה-PRP, כולל מינים באורך מלא ומינים קטועים בקצה. ניתוחים באמצעות שיקוע במדרגות גרדיאנט סוכרוז גילוי כי בעוד שרוב ה-PRPC ממוחות שאינן לוקות ב-CJD השתקם בשברים העליונים, כמויות קטנות של PRP זוהו גם בשברים התחתונים nine 11, המכילים בדרך כלל אגרגטים גדולים. מגוון של מיני PRP פתוגניים או PRP SC, הנעים בין מונומרים.

רצועות קטנות יותר ומצברים גדולים יותר בודדו באמצעות סינון ג'ל במוח עם מחלת השגב בערפליות (CRUT valve yakup disease). באופן מפתיע, כמות קטנה של מצברים גדולים יותר בעלי משקל מולקולרי הגבוה מ-2000 kilodaltons נמצאה גם בחלקים בלתי מסיסים של מוחות תקינים. יתרה מכך, דימרים וטטראמרים של PRPC לא נמצאו רק בחלקים בלתי מסיסים, אלא גם בחלקים בלתי מסיסים.

לאחר טיפול ב-PK וב-PNGases. ה-PRP שנלכד על ידי G five P זוהה באמצעות הנוגדן one E four נגד PRP 97 1 0 5 3. מקטעי ליבה העמידים ל-PK, שהוגדרו כ-PRP asterisk 20, PRP asterisk 19 ו-PRP asterisk seven, זוהו כאשר הם נודדים ב-20 kDa, 19 kDa ו-7 kDa בהתאמה.

עם זאת, לא נגמר PRP כאשר הנוגדן one E four עבר דגירה מוקדמת עם פפטיד סינתטי בעל רצף זהה לאפיטופ של one E four, מה שמעיד כי הפסים שזוהו על ידי one E four הם פרגמנטים של PRP. הנוגדן anti C זיהה שני פרגמנטים שונים של PRP הנודדים באזור של 18 kilodaltons ובאזור של 12 עד 13 kilodaltons. בנוסף ל-PRP ETE 20 Once method.

ניתן לבצע טכניקה זו בארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד את מקבצי ה-PRP המסיסים והבלתי מסיסים בחלק התחתון של מוח האדם לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך למחקר על גורלם של PIP כדי לחקור מידע על אישושם במוח.