שיטות Assay תסיסנית התנהגות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטות לבחינת התנהגויות חושיות מוטוריות וקואורדינציה של דרוזופילה. זה מושג על ידי הערכה ראשונה של תפקוד מוטורי לבה, שימוש במבחן הזחילה, הערכת תפקוד מוטורי של מבוגרים, שימוש במבחן הטבעת, והערכת קואורדינציה ויכולות חושיות של מבוגרים עם מבחן החיזור. בסופו של דבר, פאנל זה של מבחנים התנהגותיים יכול להראות כיצד גורמים גנטיים וחיצוניים כמו טיפולים תרופתיים יכולים להשפיע על הפעילות והקואורדינציה.

תוך סופלה. היתרון העיקרי של בדיקה זו על פני שיטות קיימות כמו ציר גיאוגרפי שלילי, הוא שבדיקת הטבעת היא תפוקה גבוהה יותר ורגישה יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות, כגון גילוי בשלב מוקדם של פגמים בקטר.

שידגים את הבדיקה הזו יהיה ד"ר ג'יימי בקנל, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. זחילת הזחלים משמשת למדידת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים על התנועתיות כדי להתחיל להקים הכלאה של 10 עד 15 זכרים ו-10 עד 15 בתולות בבקבוק סטנדרטי. לאחר 24 שעות, מבוגרים בריאים יטילו מספיק ביצים כדי לאכלס את הבקבוק כדי לשמור על גיל האוכלוסייה ל-24 שעות.

יש לפנות את הבוגרים לבקבוק טרי ולחזור על התהליך. כעת דגרו את הבקבוק עד לשלישי בכוכבים נצפו זחלים במזון לבקבוק. מוסיפים 50 עד 100 מיליליטר של 20% סוכרוז ונותנים לו לשבת במשך 20 דקות.

הזחלים יצופו למעלה, יאספו את הזחלים באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר עם חיתוך הקצה ויניחו בסל רשת. שטפו את הזחלים בסל הרשת פעמיים במים נטולי יונים. כעת ניתן להתנסות בהם.

כדי לטפל בזחלים בתרופה, השתמש במברשת כדי להעביר את מספר הזחלים הרצוי לכוס של חמישה מיליליטר המכילה תמיסה של 5% סוכרוז ותרופה מעניינת. הניחו להם להאכיל את תמיסת הסוכר המסוממת למשך 15 דקות, ואז שפכו אותם בחזרה דרך סל הרשת, שטפו אותם והמשיכו במדידת השפעת התרופה על התנועתיות. השתמש במברשת כדי להעביר לבה בודדת לצלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר המכילה 2% ארוס.

מניחים מעל דף נייר השתלה. כעת אסוף את הנתונים. כל שעליך לעשות הוא לספור את מספר קווי הרשת שהלבה חוצה בדקה אחת.

לאחר מכן, השתמש במברשת כדי להעביר את הלבה לבאר של צלחת חיתוך זכוכית המכילה תמיסת משחת שמרים מדוללת תחת מיקרוסקופ דיסקציה במשך תקופה של דקה אחת, ספור את התכווצויות פרסיס. התכווצות בודדת נחשבת כתנועה אחורית מלאה לקדמית. חזור על הפעולה עד לספירת המספרים הרצויים של הזחלים.

פרוטוקול הטבעת מודד את מהירות הקטר של בעלי חיים בוגרים, אוסף זבובים זכרים בוגרים שזה עתה הופיעו בהרדמה קלה ומעביר אותם לקובץ סטנדרטי המכיל מזון רגיל או מסומם. שים כ -25 זבובים לכל בקבוקון. שמור על זבובים בטמפרטורת החדר למשך יומיים-שלושה להתאוששות הרדמה מלאה והצטברות רמות תרופות במצב יציב.

לאחר מכן העבירו כ-25 זבובים ללא הרדמה לבקבוקוני פוליסטירן עם תקעים יצוקים, והרכיבו את הבקבוקונים למנגנון טבעת אחד או יותר. אפשרו לזבובים לנוח במשך 15 עד 20 דקות תוך כדי יישור מצלמה דיגיטלית לצילום הבקבוקונים ממבט מהצד, הכינו טיימר והגדירו אותו למשך הזמן הרצוי לבדיקה. בדרך כלל שלוש שניות לביצוע הבדיקה.

החזק את מכשיר הטבעת ביד אחת מבלי להפריע לזבובים והחזק את טיימר המצלמה ביד השנייה בחדות. הקש על המכשיר על הספסל שלוש פעמים כדי להפיל את הזבובים ובו זמנית להפעיל את טיימר הספירה לאחור של המצלמה. חזור על החיבור פעם בדקה עד שבוצעו חמישה או שישה ניסיונות.

זה קריטי לא לעשות שימוש חוזר בבקבוקוני בדיקת הפוליסטירן לאחר איסוף מערכי הנתונים הראשוניים. מכיוון שזבובים חדשים שהוכנסו לבקבוקונים משומשים לא יטפסו באותה מידה כמו זבובים שהוכנסו לבקבוקונים טריים. כדי לאסוף את הנתונים באמצעות ציון מציג תמונות בגובה הממוצע, טפס לפי הקבוצות השונות.

בדיקה זו דורשת הכלאות גנטיות מוכנות בבקבוקים המייצרים צאצאים בשפע כדי לאסוף זבובים לבדיקה. תוך כמה שעות מהסובייקטיביות של החיה, שחר מפנה את הבקבוקים כדי לאסוף את כל הבוגרים במרווחים של שלוש עד ארבע שעות. לאסוף זכרים ונקבות תמימים מינית שזה עתה הופיעו מאכלסים את הזכרים בנפרד בבקבוקונים או צינורות עם מזון מאכלס את הנקבות בקבוצות של חמש עד שש.

במתחמים דומים, נדרשים מספר שווה של זכרים ונקבות לבדיקה. לאחר בידוד הזבובים שנאספו במשך חמישה ימים, התכוננו להעמיס אותם לגלגל הזדווגות ולבצע את הבדיקה. לאחר מכן, העבירו בזהירות נקבה אחת וזכר אחד לתא של גלגל הזדווגות תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

התבונן בזוג במשך 10 דקות או עד שהם מזדווגים בהצלחה במהלך תקופה זו. רשום מתי כל אחת מכמה התנהגויות נצפית לראשונה. רשום כאשר הזכר פונה לראשונה לעבר השיא הנשי.

כאשר הזכר נוגע לראשונה בנקבה עם שיא הרגליים שלו, כאשר הזכר מושיט ורוטט לראשונה שיא כנף כאשר הזכר מלקק לראשונה את רשומת איברי המין הנקביים כאשר הזכר מסלסל לראשונה את בטנו מתחת לעצמו. הקלט מתי הזכר מנסה לראשונה להעלות את הדוא"ל הנשי. לבסוף, רשום את הזמן הכולל של התנהגות החיזור עד להתרחשות ההזדווגות.

עבור חיות בר זה כמעט תמיד תוך חמש עד 10 דקות, לאסוף נתונים לפי שלושה פרמטרים שונים. ראשית, ההשהיה להתנהגות היא הזמן שלוקח עד שהיא נצפית לראשונה. שנית, תדירות ההתנהגות היא האם היא נצפית או לא.

ושלישית, מדד החיזור הוא הזמן שהושקע בחיזור חלקי הזמן הכולל ועד להזדווגות בניסוי עם בעלי חיים. מוטציות ב-F-U-S-T-L-S קשורות לטרשת צידית מיוטרופית. מוטציות גנטיות עם מרכז החדרה הראו מחצית מיכולת הזחילה של קבוצת ביקורת מסוג פרא שנותרו ומוטציה של R 5 21 C הורידה את מהירות הזחילה לכסנטימטר אחד לדקה בלבד.

בדיקת טבעות של זבובים בוגרים צעירים הובילה לגובה ממוצע, שטיפס בין שלושה לחמישה סנטימטרים בפרק זמן של שלוש שניות. בבדיקה זו, לא נצפתה דה-רגישות מכיוון שעד חמשת הניסויים הרצופים המרוחקים דקה אחת זה מזה בזמן ניסיון בדיקת הטבעת. חשוב לזכור להיות מדויקים ככל האפשר בכל הנוגע לתזמון.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את חיבור צפיפות הזחלים תוך 30 עד 40 דקות כדי לצפות ב-10 ניסויים לגנוטיפ אחד אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור גם להבין היטב כיצד להתבונן בהתנהגויות חיזור תוך כדי תנועה.