מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת את תת-האוכלוסיות המובחנות של תאים מיוחדים המתמיינים בביופילמים של אורגניזם המודל, בצילוס עדין. זה מושג על ידי החדרת מדווחי שעתוק תחילה לכרומוזום של עדינות B. דיווחים אלה יבואו לידי ביטוי אך ורק בתת-אוכלוסיית התאים הנחקרים.

השלב הבא הוא לקדם את הפיתוח של ביופילם על ידי גידול עדינים B במדיום מעורר הביופילם, Ms GG gg. לאחר היווצרות הביופילם, התאים מהביופילם מתפזרים ומתקבעים עם פרה-פורמלדהיד. השלב האחרון של ההליך הוא זיהוי אות הקרינה הנפלט על ידי תאים בודדים של הקהילה המיקרוביאלית באמצעות פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה וזרימה ציטומטרית.

בסופו של דבר, התוצאות מראות כיצד תאים מתמחים לייצר ולהפריש. המטריצה החוץ-תאית המרכיבה את הביופילם היא תת-אוכלוסייה שונה מהתאים המפרישים פעילי שטח, מולקולת האיתות האחראית להתמיינות תת-האוכלוסייה של יצרני המטריצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כימות ביטוי שעתוק באמצעות מבחני Vita Ities של ניתוח מיקרו-קרניים, הוא שהיא מאפשרת לנו לנטר את ביטוי הגנים ברמת תא בודד ולדמיין אוכלוסיות תאים קטנות במיוחד של תאים המתמחים בביטוי גן ספציפי.

ביטויי גנים אלה לא יתגלו בעת ניתוח האוכלוסייה הכללית. פלסמידים אינטגרטיביים משמשים לתיוג עדינים B ודוגמה מוצגת כאן. PTAA, מקדם הגנים האחראים לייצור טאס.

חלבון מטריצה משובט לתוך הווקטור באמצעות אתרי ההגבלה ECO R אחד והינדי שלוש. הביטוי של הגן המדווח CFP נמצא כעת בשליטת ptap A כדי להתחיל בהליך התיוג B, עדינים ליניאריים את הפלסמיד האינטגרטיבי על ידי עיכול אנזימטי. אנזים ההגבלה המומלץ הוא XH oh one כאשר הפלסמיד האינטגרטיבי מוכן, לגרום ליכולת טבעית בזן העדין ביותר B 1 68 על ידי גידול התאים במדיום מעורר יכולת למשך חמש שעות ב -37 מעלות צלזיוס.

הוסף את הפלסמיד הליניארי לתרבית של תאים עדינים B מוכשרים ודגירה במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שעתיים, צלחת את התאים על אגר עם ספקט מיצין ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. לכרומוזום העדין B יש שני מיקומים ניטרליים, איימי, E, E ו-LAC A, שניתן להשתמש בהם כדי לשלב איחוי מדווחים מבלי להשפיע על התפתחות הביופילם. הפלסמיד הליניארי PKM 0 0 8 משתלב בגנום של עדינות B על ידי רקומבינציה כפולה.

השלב הבא הוא להעביר את המדווח מהזן המסומן לזן המסוגל ליצור ביופילמים באמצעות פרוטוקול התמרת פאג'ים אחד של SPP. לצורך סרטון זה, מוצגים רק השלבים החשובים בפרוטוקול. גדל את זן התורם 1 68, המכיל את היתוך המדווח במדיום TY ב-37 מעלות צלזיוס עד שהתרבית מגיעה לשלב נייח מוקדם ב-200 מיקרוליטר תאים ל-100 מיקרוליטר של מלאי פאג'ים מדולל בצינור זכוכית.

ובואו נעמוד על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, פיפטה אגר רך TY חם לתוך הצינור וערבב היטב על ידי מערבולת. מורחים בעדינות על צלחת TY טרייה ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה עד 16 שעות כדי לאפשר להילות פאג'ים להתעורר.

כדי לאסוף את הילות הפאג'ים, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום TY לצלחת והשתמש בפיפטת הזכוכית כדי לפרק את האגר העליון. העבירו את מתלה האגר לצינור בז של 15 מיליליטר. מערבולת בעדינות כדי לפרק את האגר ואז צנטריפוגה ב 1000 גרם למשך 15 דקות.

העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. העבירו את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק נקודתי של 22 מיקרון. השתמשו בסופרנטנט זה כדי להדביק תרבית של הזן המקבל שגדל במדיום TY.

הוסיפו 30 מיקרוליטר של סופרנטנט ל-10 מיליליטר תרבית מדוללת מאחד עד 10, ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה הזו ב-5,000 סל"ד למשך שבע דקות, החייאה השעתה את הכדור ב-200 מיקרוליטר של מדיום TY ומרחה על צלחת המכילה SPECT mycin בתוספת 10 מילימולר. נתרן ציטראט.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 36 שעות. בחר מושבה וגדל אותה למשך הלילה בנוזל LB ב -37 מעלות צלזיוס. לבסוף, הבחין בשלושה מיקרוליטרים של תרבית הלילה על מדיום מעורר ביופילם מוצק.

אפשר לתאים לגדול במשך 72 שעות ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר שלושה ימים של צמיחה, ביופילמים שנוצרו על פני האגר Ms.GG יפתחו ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת על פני האגר. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בקיסם או בפינצטה כדי להסיר את הביופילם מפני השטח של אגר MSGG.

העקביות של הביופילם אמורה לאפשר לקלף אותו מעל פני האגר. בחתיכה אחת, הניחו את הביופילם בשלושה מיליליטר של מאגר PBS, פזרו את הביופילם בעדינות. בצע 12 פולסים עם פלט של שלושה ומשרעת של 0.7 שניות כדי לתקן את הדגימות לפני ניתוח תא בודד.

Resus משהה 300 מיקרוליטר של תרחיף התא במיליליטר אחד, תמיסת אלדהיד פרפורמית של 4%, ודוגר בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות בדיוק. לאחר הקיבוע של שבע הדקות, שטפו תאים במאגר PBS שלוש פעמים. לבסוף, השעו מחדש תאים ב-300 מיקרוליטר של מאגר PBS לפני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הכן שקופית מיקרוסקופ על ידי פיפטינג של 200 מיקרוליטר של 0.8% אגרוס מעל השקופית, וכסה אותה בזהירות בשקופית נוספת. לאחר שתי דקות, הסר את השקופית העליונה בעדינות כדי לקבל שכבת אגרוס המחוברת למגלשה במקום התחתון. שני מיקרוליטרים של תאים קבועים על פני שכבת האגרוס ומכסים אותה בזכוכית כיסוי מיקרוסקופ.

הנח את הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ הקרינה. הגדר את תקופת העירור לפי בקרה שלילית שאינה מראה פלואורסצנטיות בתנאים שנבחרו לניסוי. החשיפה צריכה להיות בין 50 ל-200 אלפיות השנייה.

רכוש תמונת פלואורסצנטיות וכן תמונת שדה בהיר עבור כל שדה ראייה. כדי להכין תאים לניתוח ציטומטריית זרימה, יש לפזר את הדגימה של תאים קבועים על ידי סוניקציה קלה. בצע שתי סדרות של 12 פולסים עם תפוקה של חמישה ומשרעת של 0.7 שניות כדי לפזר גושים לתאים בודדים מבלי לגרום לליזה של תאים.

אשר את יעילות פיזור התאים על ידי מיקרוסקופ אור. לאחר מכן, יש לדלל את הדגימה 1 עד 100 במאגר PBS. פקס BD canto שני ציטומטר זרימה ישמש לניתוח זה עבור פלואורסצנטיות YFP.

עירור לייזר ב -488 ננומטר יחד עם מסנן 5 30 30 משמש לפלואורסצנטיות CFP. נעשה שימוש בעירור לייזר ב -405 ננומטר יחד עם מסנן 4 0 8 40, מכייל את ציטומטר הזרימה עם שני בקרות שליליות. דגימה של מאגר PBS ללא תאים בתרחיף צריכה לשמש כבקרה שלילית לגודל החלקיק המורגש על ידי ציטומטר הזרימה.

דגימה ללא מדווח פלואורסצנטי צריכה לשמש כבקרה שלילית לרגישות הפלואורסצנטית של הזרימה. ציטומטר לאחר הכיול, הנח את הדגימה המסומנת עם מדווח פלורסנט בציטומטר הזרימה עבור כל דגימה, נתח לפחות 50,000 אירועים עם קצב זרימה בין 303,000 אירועים בשנייה. כאשר B Subtles גדל על צלחת של המדיום המעורר ביופילם, היווצרות ביופילם MSGG נצפית לאחר שלושה ימי דגירה ב-30 מעלות צלזיוס.

הביופילם מציג ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת המעידה על תת-אוכלוסיות התאים המשתתפות השונות. לדוגמה, ייצור המטריצה החוץ-תאית והביופילמים מביא להיווצרות קמטים על פני המושבה. איור זה מציג דוגמה להדמיה של התמיינות תאים בזן מסומן יחיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

זן זה מכיל את המדווח הפלואורסצנטי Ptap, CFP המתבטא בתת-אוכלוסייה של תאים מייצרי מטריצה צבועים בכחול. תת-אוכלוסייה זו מייצרת ומפרישה את המטריצה החוץ-תאית המרכיבה את הביופילם. התמונה הבאה היא תוצאה של הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זן בעל תווית כפולה המאכלס את הכתב Ptap, A CFP והכתב הנוסף P Surfactin YFP.

מדווח שני זה מאפשר ניטור של תת-אוכלוסיית התאים האחראית להפרשת מולקולת האיתות סורפקטין, המפעילה את מפל האיתות להתמיינות של יצרני המטריצה. כאן, יצרני המטריצה צבועים בצבע כוזב בכחול, בעוד שיצרני פעילי השטח צבועים בצהוב, התוצאות של ציטומטריית זרימה דו-ממדית באמצעות זן מסומן יחיד המכיל את ה-ptap המדווח. YFB מוצג כאן.

זן הביקורת הלא מטופל ללא גנים של חלבון פלואורסצנטי הראה אוכלוסייה אחת עם תאים פלואורסצנטיים יחסית נמוכים המכילים ptap. YFP בתנאים שאינם מעוררי ביופילם לא הבדיל בין תת-האוכלוסייה של יצרני המטריצה, והאוכלוסייה כולה הראתה גם פלואורסצנטיות יחסית נמוכה. לעומת זאת, בתנאים מעוררי ביופילם, תת-אוכלוסייה של תאים עם פלואורסצנטיות יחסית גבוהה זוהתה ככתף מימין לפלואורסצנציה היחסית הנמוכה.

תוצאות שיא המתקבלות מציטומטריית זרימה תלת מימדית מוצגות כאן. אותות פלואורסצנטיים של הערוצים המנוטרים מוצגים בציר X עבור ציר YFP ו-Y עבור CFP, הפאנל השמאלי העליון מציג זן ללא גנים של חלבון פלואורסצנטי כבקרה על פלואורסצנטיות ברקע. בפאנל העליון הימני, נעשה שימוש בזן מסומן יחיד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני פעילי שטח בערוץ הקרינה YFP ממוסגר בצהוב.

בפאנל השמאלי התחתון, נעשה שימוש בזן אחר בעל תווית אחת כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריצה. בערוץ הקרינה CFP הממוסגר בכחול, מנוטרות תת-האוכלוסיות של יצרני מטריצות ויצרני פעילי שטח באמצעות הזן בעל התווית הכפולה והתוצאות מוצגות. בחלונית הימנית התחתונה.

מתגלות שתי תת-אוכלוסיות של תאים המבטאים רמות גבוהות של מדווחים פלואורסצנטיים. כל אוכלוסייה ממוסגרת ומראה שאין חפיפה בביטוי המדווחים בין שתי תת-האוכלוסיות של תאים מתמחים. האיור הסופי הזה מציג את הכימות של תת-האוכלוסיות של יצרני מטריצות וקניבלים על ידי ציטומטריית זרימה תלת מימדית.

בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן מסומן יחיד כדי לזהות את תת-אוכלוסיית הקניבלים. בערוץ הקרינה YFP הממוסגר בצהוב, תת-אוכלוסייה זו של קניבלים תוארה כדי להתמיין בתיאום עם תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס. בפאנל השמאלי התחתון, תת-האוכלוסייה של יצרני המטריצה מזוהה בזן יחיד אחר המסומן בערוץ הקרינה CFP.

ממוסגרים בכחול, התוצאות מהזן הכפול בלוח הימני התחתון הראו תת-אוכלוסייה אחת של תאים פלואורסצנטיים המבטאים את שני YFP של CFP ממוסגרים בירוק. הביטוי הסימולטני של שני המדווחים מצביע על כך ששני מסלולי ההתמיינות של התאים מופעלים בקואורדינטות באותה תת-אוכלוסייה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין ולכמת את תת-האוכלוסיות המובחנות של תאים המהווים ביופילם מיקרוביאלי באמצעות ניתוח תאים של אוכלוסיית התאים כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או ציטומטריית זרימה.