Name: מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: למדו לחקור תת-אוכלוסיות תאים מיוחדות בביופילמים של Bacillus subtilis באמצעות דיווחי תעתיק פלואורסצנטיים וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברמת תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי תוכנית מחקר לחוקר הצעיר, מהמרכז לחקר מחלות מדבקות (ZINF) מאוניברסיטת וורצבורג. חואן גרסיה C-Betancur הוא עמית דוקטורט בבית הספר ללימודי מוסמכים של מדעי החיים (GSLS) מאוניברסיטת וורצבורג.

<ol><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li>
<li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+microbial+communities%3A+biofilms%2C+interactions%2C+and+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-associated proteins.</a> C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).</li>
<li>O'Gara, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ica+and+beyond%3A+biofilm+mechanisms+and+regulation+in+Staphylococcus+epidermidis+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).</li>
<li>Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability+and+biofilm+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).</li>
<li>Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+sigmaD-dependent+autolysins+in+Bacillus+subtilis+population+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity.</a> J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).</li>
<li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+signaling+in+a+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li>
<li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture%2C+sporulation%2C+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li>
<li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactin%2C+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis%3A+isolation%2C+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li>
<li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li>
<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardwood%2C+CR+%22Molecular+Biological+Methods+for+Bacillus%22">Molecular Biological Methods for Bacillus</a>. , Wiley. (1990).</li>
<li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+systems+in+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li>
<li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production%2C+competence+development%2C+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li>
<li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+by+sporulating+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li>
<li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

העובדה קהילות חיידקי להראות subpopulations של תאים המבטאים קבוצה מסוימת של ראיות גנים המורכבות של קהילות מיקרוביאלי 33,34. פרוטוקול זה אמור לעזור לקבוע אם הביטוי של הגן בכל עניין מוגבל subpopulation מסוים של תאים מיוחדים בתוך הקהילה של חיידקים. ויזואליזציה של subpopulations אלה מחייב פיתוח של טכניקות חדשות, כי שיטות מסורתיות כדי לפקח על ביטוי גנים או ניתוח microarray דרג את רמות ביטוי הגנים לקהילת החיידקים כולה תנודות של ביטוי גנים בתוך הקהילה חיידקים הם הפסידו בדרך כלל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טכניקה </td><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg הרכב </td><td> אשלגן זרחתי 5mm </td><td> רוט </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100mm מגבים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד 2 מ&quot;מ </td><td> רוט </td><td> 2189.1 </td></tr><tr><td> סידן כלוריד 700μM </td><td> רוט </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> כלוריד 50μM Ferric </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> כלוריד האבץ 1μM </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> תיאמין 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> גליצרול 0.5% </td><td> רוט </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Gluta0.5% בן זוג </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> טריפטופן 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> פנילאלנין 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> תא קיבעון </td><td> Paraformaldehyde </td><td> רוט </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Sonication </td><td> תא Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> הקרינה מיקרוסקופית </td><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> שם של התוכנה </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> הקרינה מיקרוסקופית </td> &lt;td&gt; אסף </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> תזרים cytometry </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> תזרים cytometry </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

היווצרות biofilm היא תכונה כללית כמעט כל 1-6 חיידקים. כאשר חיידקים ליצור biofilms, תאים נארזים תאי מטריקס כי היא היוותה בעיקר על ידי חלבונים exopolysaccharides, בין היתר 7-10. קהילת חיידקים עטוף בתוך biofilm לעיתים קרובות ניתן לראות את הבידול של subpopulation מובהק של תאים מיוחדים 11-17. Subpopulations אלה לדור בכפיפה אחת, ולעתים קרובות להראות ארגון במרחב ובזמן בתוך biofilm 18-21. היווצרות biofilm ב האורגניזם subtilis מודל בצילוס דורש בידול של subpopulations שונים של תאים מיוחדים. ביניהם, subpopulation של מפיקי מטריקס, אחראי לייצר ולהפריש תאי מטריקס של biofilm הוא חיוני ליצירת biofilm 11,19. לפיכך, בידול של מפיקי מטריקס היא סימן ההיכר של היווצרות biofilm ב B. subtilis. השתמשנו כתבים ניאון כדי לחזות ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ב biofilms של B. subtilis 15,19,22-24. באופן קונקרטי, יש לנו ציין כי subpopulation של מפיקי מטריקס מבדיל בתגובה לנוכחות של האות בהפקה עצמית תאי surfactin 25. מעניין, surfactin מופק על ידי subpopulation של תאים מיוחדים שונים subpopulation של מפיקי מטריקס 15. הפרדנו בדוח זה גישה טכנית צורך לדמיין ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin בתוך biofilms של subtilis ב. לשם כך, כתבים ניאון של הגנים הדרושים לייצור מטריקס ייצור surfactin מוכנסים לתוך כרומוזום של B. subtilis. עיתונאים באים לידי ביטוי רק subpopulation של תאים מיוחדים. לאחר מכן, subpopulations יכולים להיותמעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry זרימה (ראה איור 1). העובדה subpopulations שונים של תאים מיוחדים לדור בכפיפה אחת בתוך הקהילות תאיים של חיידקים נותן לנו נקודת מבט שונה על רגולציה של ביטוי גנים פרוקריוטים. פרוטוקול זה מטפל בתופעה בניסוי וניתן להתאים בקלות כל מודל עבודה אחר, כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההטרוגניות פנוטיפי בתוך קהילה של חיידקים.

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin כמה<em&gt; ב subtilis</em&gt; Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

היווצרות ביופילם היא תכונה כללית של כמעט כל החיידקים 1-6. כאשר חיידקים יוצרים ביופילמים, התאים עטופים במטריצה חוץ-תאית המורכבת בעיקר מ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים ולכמת תתי-אוכלוסיות נפרדות של תאים ייעודיים המבדילים את עצמם בביופילמים של אורגניזם המודל, bacillus subtiles. הדבר מושג תחילה על ידי הכנסת רפורטרים תעתוקיים לכרומוזום של B subtles. רפורטרים אלו יבואו לידי ביטוי באופן בלעדי בתת-האוכלוסייה של התאים הנחקרים.השלב הבא הוא לעודד התפתחות של ביופילם על ידי גידול של B subtles במצע המשרה ביופילם, Ms GG gg. לאחר היווצרות הביופילם, התאים מהביופילם מפוזרים ומקובעים באמצעות para formaldehyde. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא זיהוי אות הפלואורסצנציה הנפלט מתאים בודדים של הקהילה המיקרוביאלית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה וציטומטריה של זרימה.בסופו של דבר, התוצאות מראות כיצד תאים התמחו בייצור והפרשה. המטריצה החוץ-תאית המרכיבה את הביופילם נוצרה על ידי תת-אוכלוסייה שונה מאותם תאים המפרישים סורפקטנט, המולקולה המאותתת האחראית על ההבחנה של תת-האוכלוסייה של יצרי המטריצה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כימות ביטוי שעתוק באמצעות בדיקות Viability או אנליזת מיקרו-מערך (microarray), הוא שהיא מאפשרת לנו לנטר ביטוי גנים ברמת התא הבודד ולהציג ויזואלית אוכלוסיות תאים קטנות במיוחד שהתמחו בביטוי של גן ספציפי.ביטויים גנתיים אלה לא יזוהו בעת ניתוח האוכלוסייה הכללית. פלסמידים אינטגרטיביים משמשים לסימון B subtles ודוגמה לכך מוצגת כאן. PTAA, הפרומוטור של הגנים האחראים לייצור tass.חלבון מטריקס משוכפל לתוך הווקטור באמצעות אתרי ההגבלה ECO R one ו-Hindi three. ביטוי הגן המדווח CFP נמצא כעת תחת בקרתו של ptap A. כדי להתחיל את הליך הסימון של B, subtles, יש לבצע ליניאריזציה לפלסמיד האינטגרטיבי באמצעות עיכול אנזימטי. האנזים להגבלה המומלץ הוא XH oh one. כאשר הפלסמיד האינטגרטיבי מוכן, יש להשרות כשירות טבעית (natural competence) בזן 1 68 של B subtlest על ידי גידול התאים במצע להשראת כשירות למשך חמש שעות ב-37 °C.הוסיפו את הפלסמיד הלינארי לתרבית של תאי B subtilis כשירים (competent) והדגרימו למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius. לאחר שעתיים, זרעו את התאים על מצע אגר עם spectinomycin והדגרימו למשך לילה ב-37 degrees Celsius. לכרומוזום של B subtilis יש שני לוקוסים ניטרליים, Amy E ו-LAC A, שניתן להשתמש בהם להטמעת איחורי דגיש (reporter fusions) מבלי להשפיע על התפתחות הביו-פילם. הפלסמיד PKM 0 0 8 הלינארי נטמע בגנום של B subtilis על ידי רקומינציה כפולה.השלב הבא הוא להעביר את הרפורטר מהזן המסומן לזן המסוגל להוות ביופילמים באמצעות פרוטוקול טרנסדוקציית פאג SPP one. לצורך סרטון זה, מוצגים רק השלבים החשובים בפרוטוקול. גדלו את זן התורם 1 68, הנושא את היתוך הרפורטר, במצע TY בטמפרטורה של 37 °C עד שהתרבית מגיעה לשלב סטציונרי מוקדם, בנפח של 200 µL תאים ל-100 µL של מלאי פאג מהול בתוך מבחנה מזכוכית.נמתין בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, נעביר באמצעות פיפטה אגר רך מסוג TY חם אל המבחנה ונערב היטב באמצעות וורטקס. נמרח בעדינות על פלטת TY טריה ונדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך שמונה עד 16 שעות כדי לאפשר להופעת הילות של פאג'ים.כדי לאסוף את הילה של הפאג'ים, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע TY לצלחת והשתמשו בפיפטת זכוכית כדי לפרק את שכבת האגר העליונה. העבירו את תרחיף האגר לנבובת פלקון של 15 מיליליטר. ערבבו בעדינות במערבל וורטקס כדי לפרק את האגר, ולאחר מכן סנטריגו ב-1000 G למשך 15 דקות.העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה. העבירו את הנוזל העליון דרך מסנן מזרק של 22 מיקרון. השתמשו בנוזל עליון זה כדי להדביק תרבית של זן המקבל שגודלה במצע TY.הוסיפו 30 µL של על-נוזל (supernatant) ל-10 mL של תרבית המדוללת ביחס של 1:10, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, סבבבבו בצנטריפוגה במהירות של 5,000 RPM למשך שבע דקות, השעיקו מחדש את המשקע ב-200 µL של מצע TY והפריסו על צלחת המכילה SPECTmycin בתוספת 10 mM של נתרן ציטראט.דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 36 שעות. בחרו מושבה וגדלו אותה במהלך הלילה במצע LB נוזלי בטמפרטורה של 37 °C. לבסוף, טפטפו 3 µL מהתרבית שגדלה במהלך הלילה על מצע מוצק המעודד יצירת ביופילם.אפשרו לתאים לצמוח במשך 72 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. לאחר שלושה ימי צמיחה, ביופילמים שנוצרו על פני הגאר של Ms.GG יפתחו ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת על פני הגאר. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השתמשו בקיסם שיניים או בפינצטה כדי להסיר את הביופילם מפני הגאר של MSGG.עקביות הביופילם צריכה לאפשר את קלופו מפני השטח של האגר. העבר את הביופילם כיחידה אחת לשלושה מיליליטר של PBS buffer, ופזר את הביופילם בעדינות. בצע 12 פולסים עם output של שלושה ואמפליטודה של 0.7 שניות כדי לקבע את הדגימות לפני ניתוח של תא בודד.השעה מחדש 300 µL של תרחיף התאים ב-1 mL של תמיסת פאראפורמאלדהיד 4%, והדגר בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות בדיוק. לאחר קיבוע של שבע דקות, שטוף את התאים במערך PBS שלוש פעמים. לבסוף, השעה מחדש את התאים ב-300 µL של באפר PBS לפני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.הכינו זכוכית למסך מיקרוסקופ על ידי טפטוף של 200 µL של 0.8% agros על גבי הזכוכית, וכסו אותה בזהירות עם זכוכית נוספת. לאחר שתי דקות, הסירו בעדינות את הזכוכית העליונה כדי לקבל שכבה של agros הדבקה לזכוכית התחתונה. טפטפו 2 µL של תאים מקובעים על פני השטח של שכבת ה-agros וכסו אותה עם זכוכית כיסוי למסך מיקרוסקופ.הנח את הדגימה על השולחן של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. קבע את זמן העירור בהתאם לבקרת שלילה שאינה מראה פלואורסצנציה בתנאים שנבחרו עבור הניסוי. זמן החשיפה צריך להיות בין 50 ל-200 milliseconds.רכשו תמונה פלואורסצנטית וכן תמונת שדה בהיר עבור כל שדה ראייה. כדי להכין את התאים לניתוח בציטומטריה של זרימה, פזרו את דגימת התאים המקובעים באמצעות סוניקציה עדינה. בצעו שתי סדרות של 12 פולסים עם הספק של חמישה ואמפליטודה של 0.7 שניות כדי לפרק גושים לתאים בודדים מבלי לגרום לליזיס של התאים.יש לאשר את יעילות פיזור התאים באמצעות מיקרוסקופיה של אור. לאחר מכן, יש לדלל את הדגימה ביחס של 1:100 בבופר PBS. לניתוח של פלואורסצנציית YFP ייעשה שימוש במכשיר BD FACSCanto II flow cytometer.עירור בלייזר באורך גל של 488 ננומטר, בשילוב עם מסנן 5 30 30, משמש עבור פלורסצנציית CFP. עירור בלייזר באורך גל של 405 ננומטר, בשילוב עם מסנן 4 0 8 40, משמש לכיול ציטומטר הזרימה באמצעות שתי בקרות שליליות. דגימה של תמיפת PBS ללא תאים בסספנסיה תשמש כבקרה שלילית לגודל החלקיקים המזוהים על ידי ציטומטר הזרימה.דגימה ללא מדד פלואורסצנטי (fluorescent reporter) צריכה לשמש כביקורת שלילית לרגישות הפלואורסצנטית של ציטומטר הזרימה. לאחר הכיול, מקבלים את הדגימה המסומנת במדד פלואורסצנטי לתוך ציטומטר הזרימה; עבור כל דגימה, מנתחים לפחות 50,000 אירועים (events) בקצב זרימה של עד 30,000 אירועים לשנייה. כאשר B Subtles גדל על צלחת של מצע המשרה היווצרות ביופילם, MSGG, נצפית היווצרות ביופילם לאחר שלושה ימי דגירה ב-30 °C.הביופילם מציג ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת המעידה על תתי-אוכלוסיות תאים שונות המשתתפות בתהליך. לדוגמה, ייצור המטריקס החוץ-תאי והביופילם גורם להיווצרות קמטים על פני השטח של המושבה. איור זה מציג דוגמה להדמיה של דיפרנציאציה של תאים בזן מסומן בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.זן זה נושא את המדווח הפלואורסצנטי Ptap, A CFP, המובטא בתת-אוכלוסייה של תאים המייצרים מטריקס וצבועים בכחול. תת-אוכלוסייה זו מייצרת ומפרישה את המטריקס החוץ-תאי המרכיב את הביופילם. התמונה הבאה היא תוצאה של הדמיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זן עם סימון כפול הנושא את המדווח Ptap, A CFP, ואת המדווח הנוסף P Surfactin YFP.דיווח זה השני מאפשר ניטור של תת-אוכלוסיית התאים האחראית להפרשת מולקולת האיתות surfactin, המפעילה את רצף האיתות לדפרנציאציה של יצרני המטריצה. כאן, יצרני המטריצה צבועים בכחול (צבע מלאכותי), בעוד שיצרני ה-surfactant צבועים בצהוב (צבע מלאכותי), כתוצאה של ציטומטריה של זרימה דו-ממדית (2D flow cytometry) תוך שימוש בזן מסומן בודד הנושא את הדיווח ptap. כאן מוצג YFB.זן הביקורת שלא טופל וללא גנים של חלבון פלואורסצנטי הראה אוכלוסייה יחידה עם פלואורסצנציה יחסית נמוכה בתאים הנושאי ptap. YFP תחת תנאים שאינם מעודדים ביופילם לא הבדיל את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס, וכל האוכלוסייה הראתה גם היא פלואורסצנציה יחסית נמוכה. בניגוד לכך, תחת תנאים מעודדי ביופילם, זוהתה תת-אוכלוסייה של תאים בעלי פלואורסצנציה יחסית גבוהה ככתף מימין לפלואורסצנציה היחסית הנמוכה.תוצאות השיא שהתקבלו מציטומטריה של זרימה בתלת-ממד מוצגות כאן. אותות פלואורסצנציה של הערוצים שננטרו מוצגים בציר X עבור YFP ובציר Y עבור CFP; הפאנל השמאלי העליון מראה זן ללא גנים של חלבון פלואורסצנטי כביקורת לפלואורסצנציה של הרקע. בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני סורפקטין בערוץ הפלואורסצנציה של YFP, המסומן במסגרת צהובה.בפאנל השמאלי התחתון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד אחר כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס. בערוץ הפלורסצנציה של CFP המסוגר בכחול, מנוטרות תתי-האוכלוסיות של יצרני המטריקס ויצרני הסורפקטנט באמצעות הזן המסומן כפולה, והתוצאות מוצגות בפאנל הימני התחתון זה.זוהו שתי תתי-אוכלוסיות של תאים המבטאים רמות גבוהות של השומנים הפלואורסצנטיים. כל אוכלוסייה ממוסגרת, מה שמראה כי אין חפיפה בביטוי השומנים בין שתי תתי-האוכלוסיות של התאים המתמחים. איור סופי זה מציג את הכימות של תתי-האוכלוסיות של יצרי המטריקס והקניבלים באמצעות ציטומטריה של זרימה בתלת-ממד.בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של ה"קניבלים". בערוץ הפלואורסצנציה של YFP המסוגר במסגרת צהובה, תת-אוכלוסייה זו של קניבלים תוארה ככזו המבדילה באופן מתואם את תת-האוכלוסייה של יצרי המטריקס. בפאנל השמאלי התחתון, תת-האוכלוסייה של יצרי המטריקס מזוהה בזן מסומן בודד אחר בערוץ הפלואורסצנציה של CFP.במסגרת כחולה, התוצאות מהזן בעל הסימון הכפול בפאנל הימני התחתיו הראו תת-אוכלוסייה אחת של תאים פלואוריסצנטיים המבטאים הן YFP והן CFP במסגרת ירוקה. הביטוי הסימולטני של שני המדווחים מעיד על כך ששני מסלולי התמיינות התאים מופעלים באופן מתאם באותה תת-אוכלוסייה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו ניתן להדגים וכמותית את תתי-האוכלוסיות המובחנות של תאים המרכיבות ביופילם מיקרוביאלי, באמצעות אנליזה של אוכלוסיית התאים כגון מיקרוסקופיה פלואוריסצנטית או ציטומטריית זרימה.

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

תפקידו של מבחר (הפרדה מרחבית) בתרחישים האבולוציונית ניתן לבדוק באמצעות מערכות חיידקים פשוטה במעבדה המאפשרים נשלט התאמת הפריסה המרחבית. על ידי שינוי צפיפות התאים המייסדים, רמות מבחר שונות ניתן מדמיינות באמצעות זני חיידקים שכותרתו fluorescently ב biofilms המושבה של Bacillus subtilis.

ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

Cytometry זרימה בשילוב עם קיבוץ באשכולות חזותית מציע שיטה קלה לשימוש ומהיר עבור הלומדים biofilms הימית. זה יכול לשמש biofilm אפיון, זיהוי שינויים במבנה הקהילה biofilm, וזיהוי של חלקיקים והאביוטיים שמוטבע על biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

למדו לחקור תת-אוכלוסיות תאים מיוחדות בביופילמים של Bacillus subtilis באמצעות דיווחי תעתיק פלואורסצנטיים וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברמת תא בודד.

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

גלה סרטונים נוספים