מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמינ ולקוונט את תתי-האוכלוסיות המובחנות של תאים מתמחים המבדילים את עצמם בביופילמים של אורגניזם המודל, bacillus subtles. דבר זה מושג תחילה על ידי החדרת רפורטרים תעתוקיים לכרומוזום של B subtles. רפורטרים אלה יבואו לידי ביטוי באופן בלעדי בתת-האוכלוסייה של התאים הנחקרים.

השלב הבא הוא לעודד התפתחות של ביופילם על ידי גידול של B subtles בתוך תוצר המושרה ביופילם, Ms GG gg. לאחר היווצרות הביופילם, התאים מהביופילם מופזרים ומקובעים באמצעות פאראפורמאלדהיד. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא גילוי אות הפלואורסצנציה הנפלט מתאים בודדים של הקהילה המיקרוביאלית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה.

בסופו של דבר, התוצאות מראות כיצד תאים התמחו בייצור והפרשה. המטריצה החוץ-תאית המרכיבה את הביופילם היא תת-אוכלוסייה השונה מהתאים המפרישים את הסורפקטנט, מולקולת האיתות האחראית על התמיינות תת-האוכלוסייה של יצרניות המטריצה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כימות ביטוי שעתוק באמצעות בדיקות Viability או אנליזת מיקרו-מערכים, הוא שהיא מאפשרת לנו לנטר ביטוי גנים ברמת התא הבודד ולהדמיות ויזואלית אוכלוסיות תאים קטנות במיוחד, אשר התמחו בביטוי של גן ספציפי.

ביטויים גנטיים אלו לא יזוהו בעת ניתוח של האוכלוסייה הכללית. פלסמידים אינטגרטיביים משמשים לסימון של B subtles ודוגמה לכך מוצגת כאן. PTAA, הפרומוטור של הגנים האחראים לייצור של tass.

חלבון מטריקס משתבט לתוך הווקטור באמצעות אתרי ההכרה ECO R one ו-Hindi three. ביטוי הגן המדווח CFP נמצא כעת תחת בקרה של ptap A. כדי להתחיל את הליך הסימון של B, subtles, יש לבצע לינאריזציה לפלסמיד האינטגרטיבי באמצעות עיכול אנזימטי. אנזים ההכרה המומלץ הוא XH oh one. כאשר הפלסמיד האינטגרטיבי מוכן, יש להשרות כשירות טבעית (natural competence) בזן 1 68 של B subtlest על ידי גידול התאים במדיום להשראת כשירות למשך חמש שעות ב-37 °C.

הוסף את הפלסמיד הליניארי לתרבית של תאי B subtilis קומפטנטיים והדגר למשך שעתיים ב-37 °C. לאחר שעתיים, זרע את התאים על אגר עם spectinomycin והדגר למשך לילה ב-37 °C. לכרומוזום של B subtilis יש שני לוקוסים ניטרליים, Amy E ו-LAC A, שניתן להשתמש בהם כדי לשלב חלומי רפורטר (reporter fusions) מבלי להשפיע על התפתחות הביופילם. הפלסמיד הליניארי PKM 0 0 8 משתלב בגנום של B subtilis באמצעות רקומבינציה כפולה.

השלב הבא הוא להעביר את הדיווח (reporter) מהזן המסומן לזן המסוגל ליצור ביופילמים באמצעות פרוטוקול הטרנסדוקציה של פאג SPP one. לצורך סרטון זה, מוצגים רק השלבים החשובים בפרוטוקול. גדלו את זן התורם 1 68, הנושא את היתוך הדיווח, במצע TY בטמפרטורה של 37 °C עד שהתרבית מגיעה לשלב סטציונרי מוקדם, בתוך מבחנה מזכוכית המכילה 200 µL של תאים ו-100 µL של מלאי פאגים מדולל.

נשאיר את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, נעביר בעזרת פיפטה אגר רך TY חם אל המבחנה ונערבב היטב באמצעות וורטקס. נמרח בעדינות על צלחת TY נקייה ונדגור בטמפרטורה של 37 °C למשך 8 עד 16 שעות כדי לאפשר להיווצרות הילת פאג'ים.

לאיסוף הילהי הפאג', הוסיפו שלוש מיליליטר של מצע TY לצלחת והשתמשו בפיפטת זכוכית כדי לפרק את האגר העליון. העבירו את תגלי האגר למבחנת פלקון של 15 מיליליטר. ערבבו בעדינות במערבל וורטקס (Vortex) כדי לפרק את האגר, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-1000 G למשך 15 דקות.

העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה. סננו את הנוזל העליון באמצעות מסנן מזרק של 22 micron. השתמשו בנוזל עליון זה כדי להדביק תרבית של זן המקבל שגודלה במצע TY.

הוסיפו 30 µL של על-נוזל (supernatant) ל-10 mL של תרבית המדוללת ביחס של 1:10, והדגרימו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה ב-5,000 RPM למשך שבע דקות, השעיו שוב את המשקע ב-200 µL של מצע TY ופזרו על צלחת המכילה SPECTmycin בתוספת 10 mM של Sodium citrate.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 36 שעות. בחרו מושבה וגדלו אותה במהלך הלילה במצע LB נוזלי בטמפרטורה של 37 °C. לבסוף, טפטפו 3 µL מהתרבית של הלילה על מצע מוצק המשרה ביופילם.

אפשרו לתאים לגדול במשך 72 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לאחר שלושה ימי צמיחה, ביופילמים שנוצרו על פני הגאר של Ms.GG יפתחו ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת על פני הגאר. כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו בקיסם שיניים או בפינצטה כדי להסיר את הביופילם מפני הגאר של MSGG.

עקביות הביופילם צריכה לאפשר את קלופו מפני השטח של האגר. העבירו את הביופילם, כיחידה אחת, לתוך 3 mL של בופר PBS, ופזרו את הביופילם בעדינות. בצעו 12 פולסים עם הספק של 3 ואמפליטודה של 0.7 שניות כדי לקבע את הדגימות לפני ניתוח של תאים בודדים.

השעה מחדש 300 µl מתליה התאים ב-1 mL של תמיסת paraformaldehyde בריכוז 4%, ודגרי בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות בדיוק. לאחר קיבוע של שבע דקות, שטוף את התאים בבופר PBS שלוש פעמים. לבסוף, השעה מחדש את התאים ב-300 µl של בופר PBS לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הכינו שקופית למיקרוסקופ על ידי הפיפטור של 200 µL של 0.8% agros על השקופית, וכסו אותה בזהירות עם שקופית נוספת. לאחר שתי דקות, הסירו בעדינות את השקופית העליונה כדי לקבל שכבת agros הדבקה לשקופית בתחתית. טפטפו 2 µL של תאים מקובעים על פני שכבת ה-agros וכסו אותה עם זכוכית כיסוי למיקרוסקופ.

הנח את הדגימה על במה של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. הגדר את תקופת העירור בהתאם לבקרת שלילה שאינה מראה פלואורסצנציה בתנאים שנבחרו לניסוי. זמן החשיפה צריך להיות בין 50 ל-200 milliseconds.

רכשו תמונת פלואורסצנציה וכן תמונת שדה בהיר עבור כל שדה ראייה. כדי להכין את התאים לניתוח בציטומטריית זרימה, פזרו את דגימת התאים המקובעים באמצעות סוניקציה עדינה. בצעו שתי סדרות של 12 פולסים עם פלט של חמש ואמפליטודה של 0.7 שניות כדי לפזר גושים לתאים בודדים מבלי לגרום לליזיס של התאים.

אששו את יעילות פיזור התאים באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר מכן, דללו את הדגימה ביחס של 1:100 בבופר PBS. לניתוח פלואורסצנציית YFP ייעשה שימוש בציטומטר זרימה BD FACS Canto II.

עבור פלואורסצנציית CFP נעשה שימוש בעירור לייזר באורך גל של 488 ננומטר בשילוב עם מסנן 5 30 30. עבור עירור לייזר באורך גל של 405 ננומטר נעשה שימוש במסנן 4 0 8 40; יש לכייל את סייטומטר הזרימה באמצעות שתי בקרות שליליות. מדגם של תמיסת PBS ללא תאים בסספנסיה ישמש כבקרת שלילית לגודל החלקיקים הנמדדים על ידי סייטומטר הזרימה.

דגימה ללא רפורטר פלואורסצנטי צריכה לשמש כביקורת שלילית לרגישות הפלואורסצנטית של ציטומטר הזרימה. לאחר כיול, הנח את הדגימה המסומנת ברפורטר פלואורסצנטי בציטומטר הזרימה; עבור כל דגימה, נתח לפחות 50,000 אירועים בקצב זרימה שבין 303,000 אירועים לשנייה. כאשר B Subtles גדל על צלחת של מצע inducing biofilm, ניתן להבחין ביצירת MSGG biofilm לאחר שלושה ימי דגירה ב-30 °C.

הביופילם מראה ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת המעידה על תת-אוכלוסיות תאים נפרדות המשתתפות בתהליך. לדוגמה, ייצור המטריקס החוץ-תאי והביופילמים גורם להיווצרות קמטים על פני השטח של המושבה. איור זה מציג דוגמה להדמיה של דיפרנציאציה של תאים בזן מסומן בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

זן זה נושא את הדיווח הפלואורסצנטי Ptap, A CFP, המובע בתת-אוכלוסייה של תאים מייצרי מטריקס הצבועים בכחול. תת-אוכלוסייה זו מייצרת ומפרישה את המטריקס החוץ-תאי המרכיב את הביופילם. התמונה הבאה היא תוצאה של ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זן בעל סימון כפול הנושא את הדיווח Ptap, A CFP, ואת הדיווח הנוסף P Surfactin YFP.

דיווח זה השני מאפשר ניטור של תת-אוכלוסיית התאים האחראית להפרשת מולקולת האיתות surfactin, המפעילה את רצף האיתות להבחנה של יצרני המטריצה. כאן, יצרני המטריצה צבועים בכחול (צבע מלאכותי), בעוד שיצרני ה-surfactin צבועים בצהוב (צבע מלאכותי), כתוצאה של ציטומטריה זרימה דו-ממדית (2D flow cytometry) באמצעות זן סימון יחיד הנושא את הדיווח ptap. כאן מוצג YFB.

זן הביקורת שלא טופל ושהיה נטול גנים של חלבון פלואורסצנטי הראה אוכלוסייה אחת של תאים הנושאים את ptap עם פלואורסצנציה יחסית נמוכה. YFP בתנאים שאינם מעודדים יצירת ביופילם לא בידלה את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס, וכל האוכלוסייה הראתה פלואורסצנציה יחסית נמוכה. לעומת זאת, בתנאים מעודדי יצירת ביופילם, זוהתה תת-אוכלוסייה של תאים עם פלואורסצנציה יחסית גבוהה ככתף מימין לפלואורסצנציה היחסית הנמוכה.

תוצאות השיאים שהתקבלו מציטומטריית זרימה תלת-ממדית מוצגות כאן. אותות הפלואורסצנציה של הערוצים שנבדקו מוצגים בציר X עבור YFP ובציר Y עבור CFP; הפאנל השמאלי העליון מראה זן ללא גנים של חלבון פלואורסצנטי כבקרה לפלואורסצנציה של הרקע. בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן מסומן יחיד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני סורפקטין בערוץ הפלואורסצנציה של YFP, המסומן במסגרת צהובה.

בפאנל השמאלי התחתון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד אחר כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס. בערוץ הפלואורסצנציה של CFP המסוגר במסגרת כחולה, מנוטרות תתי-האוכלוסיות של יצרני המטריקס ויצרני הסורפקטנט באמצעות הזן בעל הסימון הכפול, והתוצאות מוצגות בפאנל הימני התחתון זה.

זוהו שתי תתי-אוכלוסיות של תאים המבטאים רמות גבוהות של מדדי הפלואורסצנציה. כל אוכלוסייה ממוסגרת, מה שמראה כי אין חפיפה בביטוי המדדים בין שתי תתי-האוכלוסיות של התאים המתמחים. איור סופי זה מציג את הכימות של תתי-האוכלוסיות של יצרי המטריקס והקניבלים באמצעות ציטומטריית זרימה תלת-ממדית.

בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן סימון יחיד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של הקניבלים. בערוץ הפלואורסצנציה של YFP המסוגר בצהוב, תת-אוכלוסייה זו של קניבלים תוארה כמבדלת באופן מתואם עם תת-האוכלוסייה של יצרי המטריקס. בפאנל השמאלי התחתון, תת-האוכלוסייה של יצרי המטריקס מזוהה בזן סימון יחיד אחר בערוץ הפלואורסצנציה של CFP.

במסגרת כחולה, התוצאות מהזן בעל הסימון הכפול בלוח הימני התחתון הראו תת-אוכלוסייה יחידה של תאים פלואורסצנטיים המבטאים הן YFP והן CFP במסגרת ירוקה. הביטוי הסימולטני של שני המדדים מעיד על כך ששני נתיבי הדיפרנציאציה של התאים מופעלים באופן מתואם באותה תת-אוכלוסייה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו ניתן להדגים ולכמת את תת-אוכלוסיות התאים הנבדלות המרכיבות ביופילם מיקרוביאלי, באמצעות אנליזה של אוכלוסיית התאים כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או ציטומטריה של זרימה.