תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי iPS אנושיים באמצעות ביטוי יתר מתווך רטרו-וירוס של OCT4, SOX2, KLF4 ו-c-MYC, בשילוב עם מערכת דגלי GFP. זאת מושגים תחילה על ידי הוספת הכמות המתאימה של רטרו-וירוסים אינדיבידואליים המבטאים GFP. לאחר מכן, התאים שהודאו על ידי הווירוסים המבטאים GFP מועברים לצלחות מצופות בג'לטין בריכוז 0.1% עם פיברובלסטים עובריים של עכבר.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא החלפת המצע למצע גידול של תאי גזע עובריים אנושיים. לבסוף, מבודדים מושבות IPS שבהן ה-GFP הושתק ומראות מורפולוגיה דומה לזו של תאי גזע עובריים אנושיים. בסופו של דבר, התוצאות מראות ביטוי של סממנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית ו-R-T-Q-P-C-R.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעה חיה עם סממני שטח פלוריפוטנטיים ותצפית על שינוי מורפולוגי, הוא ה-iPad הרצוי. ניתן לבודד קולוניות של תאים בקלות באמצעות אובדן ביטוי של GFP כסמן לתאים הפלוריפוטנטיים כדי להתחיל את התרבית. יום אחד לפני ההדבקה, זרע פיברובלסטים אנושיים במצע פיברובלסטים; זרע 1×10⁵ פיברובלסטים אנושיים לתוך באער אחת של פלטת 6 באערים. למחרת, שאב את המצע כדי להסיר תאים מתים והוסף 2 mL של מצע פיברובלסטים טרי עם 5 µg/mL של protamine sulfate.

לאחר מכן, הוסיפו בזהירות את הכמות המתאימה של כל נגיף המבטא GFP בהתאם לריבוי זיהום (multiplicity of infection) של חמישה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה אחד לאחר הזיהום. הסירו את העלייה הנגיפית (viral supernatant) ושטפו שלוש פעמים עם 2 mL PBS.

לאחר מכן, שלושה ימים לאחר ההדבקה, יש להוסיף 2 mL של מצע גידול לפיברובלסטים. בדקו את פלואורסצנציית ה-GFP ומלאו מחדש את הבאר ב-2 mL של מצע גידול לפיברובלסטים. למחרת, זרעו 1×10⁴ תאים לסמ"ר של פיברובלסטים עובריים של עכבר שהקרנו, או תאי מזיני (feeder) מסוג MEF, במצע גידול לפיברובלסטים על גבי צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המצופה ב-0.1% Gelatin.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, נתקו את הפיברובלסטים האנושיים המודבקים באמצעות 1 mL של 0.05% trypsin EDTA למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C, וסובבו במערכת צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 G. השהו מחדש את התאים ב-10 mL של מצע גידול לפיברובלסטים והעבירו את התאים למשטחים מצופים מראש ב-0.1% gelatin עם mfs. לאחר 24 שעות.

החליפו את המצע במצע גידול HESC והחליפו את המצע מדי יום. מושבות דמויות ESC יתחילו להופיע 20 עד 27 ימים לאחר ההדבקה, לאחר הופעת מושבות דמויות ESC תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. בדקו את היעדרה של פלואורסצנציית GFP במושבה המראה מורפולוגיה דומה לזו של HSCs.

באמצעות פיפט של 10 µL, בחרו מושבות IPSC בודדות והעבירו אותן לבאר אחת של פלטת 12 בארות מצופה בג'לטין וב-meth, המכילה מצע HESC. החליפו את המצע מדי יום והעבירו את התאים על ידי שטיפת הפלטה ב-1 mL של DMM F 12.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliter של collagenase והדגרירו למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius. שטפו את התאים פעמיים עם DM A MF 12. לאחר מכן, הוסיפו שני milliliters של מצע HESC טרי.

לאחר מכן, השתמש במגבב תאים (cell lifter) כדי לפרק את המושבות לחלקים קטנים ולהפריד את התאים שנותרו מהצלחת. העבר את חלקי המושבות שהושחו לתוך באער אחת של פלטת שש באערים מצופה בג'לטין ו-MEF, והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים.

לבדיקת התאים באמצעות אימונופלואורסצנציה, שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS וקבעו אותם באמצעות 4%paraldehyde למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS ובצעו פרמבליזציה (חדירה) באמצעות 0.2%tritton X 100 ב-PBS למשך 30 דקות.

חסמו קישור לא ספציפי על ידי דגירה של התאים עם 3% BSA ב-PBS למשך שעתיים. לאחר מכן, דגרו את התאים עם נוגדן ראשוני למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS ודגרו אותם עם נוגדן משני למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS, כאשר השטיפה האחרונה היא השלישית. הוסיפו dappy והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. צלמו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לצורך ניתוח כמותי בזמן אמת.

ביצוע PCR לבידוד RNA כולל מ-IPCs אנושיים שהופקו מפיברובלסטים אנושיים. השתמש בערכה לבידוד RNA. סנתז את הגדיל הראשון של ה-cDNA באמצעות reverse transcriptase.

לאחר מכן, השתמש בו כתבנית עבור QPCR לזיהוי גנים של פלוריפוטנציות. פיברובלסטים אנושיים, משוער BJ, שהודבקו בתערובת של רטרו-וירוסים הנושאים את OCT4, SOX2, KLF4 ו-MYC; מוצגים כאן השינויים המורפולוגיים שנצפו במהלך התכנות מחדש מהיום החמישי. ביומיים 10, 14 ו-21, התאים מתחילים להראות מורפולוגיה דמוית HESC לאחר 21 ימים, וה-iPSCs מזוהים באמצעות פלואורסצנציית GFP.

תאי גזע פלוריפוטנטיים, כגון ESCs ו-IPCs, מבטאים את המכניזם המולקולרי המדכא ביטוי של גנים פרו-ויראליים. עם זאת, הווקטורים הרטרוויראליים המשמשים כאן מבטאים GFP יחד עם גני תכנות מחדש באמצעות LTR רטרוויראלי. לפיכך, תאים המבטאים GFP באופן רציף נחשבים כמבטאים טרנס-גנים ללא השתקה של גנים פרו-ויראליים; כפי שניתן לראות כאן באופן נאמן, מושבות IPSC שעברו תכנות מחדש ורכשו את רשת המולקולות של הפלוריפוטנטיות מראות היעדר ביטוי של GFP.

איור זה מציג ניתוח אימונוהיסטוכימי של מושבות שהופקו מפיברובלסטים של Detroit 5 51 עם נוגדונים ל-TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four, ו-nano כפי שניתן לראות. IPCs שתקנו בהצלחה מביעים את כל הסממנים הללו. בנוסף, בוצע R-T-P-C-R כמותי כדי לנתח את ביטוי הגנים, אשר גילה כי T four SOX two, KLF four M ו-nano היו מוגברים באופן מובהק בהשוואה לתאי הפיברובלסט ההוריים, אך תואמים לאלו של H nine HSCs.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין כיצד להדביק את הנגיף, וכיצד לזהות ולאסוף תאי IPA שעברו תכנות ליפוסומלי מלא באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.