תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תאי IPS אנושיים באמצעות ביטוי יתר בתיווך רטרו-וירוס של OCT 4, SOX 2K LF 4 ו-M עם מערכת דיווח GFP. זה מושג על ידי הוספת הכמות המתאימה של GFP בודד המבטא רטרו-וירוס. לאחר מכן, התאים הנגועים בנגיף המבטאים GFP מועברים לצלחות מצופות ג'לטין של 0.1% עם פיברובלסטים עובריים של עכברים.

השלב השלישי של ההליך הוא החלפת המדיום במדיום תרבית תאי גזע עובריים אנושיים. לבסוף, מושבות IPS מושתקות GFP המציגות מורפולוגיה דומה לתאי גזע עובריים אנושיים מבודדות. בסופו של דבר, התוצאות מראות ביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים באמצעות צביעה אימונו-פלואורסצנטית ו-R-T-Q-P-C-R.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטה קיימת כמו צביעת אורח חיים עם טוש משטח פלוריפוטנטי והתבוננות בשינוי מורפולוגי הוא האייפד הרצוי. ניתן לבודד מושבות תאים בקלות באמצעות אובדן ביטוי GFP כסמן לתאים הפלוריפוטנטיים כדי להתחיל בתרבית. פיברובלסטים אנושיים בפיברובלסטים מדיום יום אחד לפני ההדבקה צלחת אחת כפול 10 עד חמישית פיברובלסטים אנושיים לבאר אחת של צלחת שש בארות למחרת שואבים את המדיום כדי להסיר תאים מתים ומוסיפים שני מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של פרוטמין סולפט.

לאחר מכן הוסף בזהירות את הכמות המתאימה של כל וירוס מבטא GFP המתאים לריבוי הדבקה של חמישה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה יום לאחר ההדבקה. הסר את שטיפת הסופרנטנט הנגיפי שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBS.

לאחר מכן הוסף שני מיליליטר, מדיום פיברובלסטים שלושה ימים לאחר ההדבקה. בדוק את הקרינה של GFP ומלא את הבאר בשני מיליליטר. מדיום פיברובלסטים למחרת צלחת אחת כפול 10 עד רביעי לסנטימטר רבוע של עכבר מוקרן, פיברובלסטים עובריים או תאי הזנה מת' במדיום פיברובלסטים על צלחת פטרי של 10 סנטימטר מצופה ב-0.1% ג'לטין.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, נתק את הפיברובלסטים האנושיים הנגועים עם מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 גרם. 24 שעות מאוחר יותר.

החלף את המדיום במדיום תרבית HESC והחלף את המדיום מדי יום. מושבות דמויות ESC יתחילו להופיע 20 עד 27 יום לאחר ההדבקה לאחר הופעת מושבות דמויות ESC תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדוק אם אין פלואורסצנטיות GFP במושבה המציגה מורפולוגיה דומה ל-HSCs.

בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר. בחר מושבות IPSC בודדות והניח אותן בבאר אחת של צלחת 12 בארות מצופה ג'לטין ומת' ובתוספת מדיום HESC. שנה את המעבר היומי הבינוני של התאים על ידי שטיפת הצלחת במיליליטר אחד של DMM F 12.

לאחר מכן מוסיפים 0.5 מיליליטר קולגנאז ודוגרים במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. שוטפים את התאים פעמיים עם DM A MF 12. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מדיום HESC טרי.

לאחר מכן השתמש במרים תאים כדי לפרק את המושבות לחתיכות קטנות ולנתק את התאים הנותרים מהצלחת. העבירו את חתיכות המושבות התלויות לבאר אחת של ג'לטין ושש מצופה MEF. צלחת היטב ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.

לבדוק את התאים על ידי אימונופלואורסצנטיות. שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS וקבעו אותם עם 4% פרלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS וסללו אותם עם 0.2% טריטון X 100 ב-PBS למשך 30 דקות.

חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של התאים עם 3%BSA ב-PBS למשך שעתיים. לאחר מכן, דגרו על התאים עם נוגדן ראשוני למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS ודגרו עליהם עם נוגדנים משניים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.

שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS במהלך הכביסה האחרונה. מוסיפים דאפי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזמן אמת כמותי.

PCR מבודד RNA כולל מ-IPCs אנושיים שמקורם בפיברובלסטים אנושיים. שימוש בערכת בידוד RNA. סנתז cDNA של גדיל ראשון באמצעות טרנסקריפטאז הפוך.

לאחר מכן השתמש בו כתבנית עבור QPCR לאיתור גנים פלוריפוטנטיים. פיברובלסטים אנושיים, BJ אחד שנדבק בקוקטייל של רטרו-וירוסים הנושאים OCT 4, SOX 2, KLF 4, ומיק המוצגים כאן הם השינויים המורפולוגיים שנצפו במהלך התכנות מחדש מהיום החמישי. היום ב-10, 14 ו-21, התאים מתחילים להראות את המורפולוגיה של HESC לאחר 21 יום, וה-IPCs מזוהים על ידי פלואורסצנטיות GFP.

תאי גזע פלוריפוטנטיים כגון ESCs ו-IPCs מבטאים את המנגנון המולקולרי לדיכוי ביטוי גנים פרו-ויראלי. עם זאת, הווקטורים הרטרו-ויראלים המשמשים כאן מבטאים GFP יחד עם תכנות מחדש של גנים על ידי LTR רטרו-ויראלי. לפיכך, תאים המבטאים GFP באופן רציף נחשבים כמבטאים טרנסגנים ללא השתקת גנים פרו-ויראלים כפי שניתן לראות כאן בנאמנות, מושבות IPSC מתוכנתות מחדש שרוכשות את הרשת המולקולרית של פלוריפוטנטיות מראות את היעדר ביטוי GFP.

איור זה מציג ניתוח אימונוהיסטוכימי של מושבות שמקורן בפיברובלסטים של דטרויט 5 51 עם נוגדנים ל-TRA 180 1, TRA אחד 60 SSEA 4 T 4 וננו כפי שניתן לראות בהצלחה. IPCs מתוכנתים מחדש מבטאים את כל הסמנים הללו. בנוסף, בוצע R-T-P-C-R כמותי כדי לנתח את ביטוי הגנים וגילה כי T ארבע SOX שתיים, KLF ארבעה M וננו היו מוגברים באופן משמעותי בהשוואה לתאי הפיברובלסטים ההורים, אך תואמים לזה של H תשעה HSCs.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להדביק את הנגיף, לזהות ולהרים את תאי ה-IPA המתוכנתים במלואם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.