Name: בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: למדו לבודד מיקרוגליה ראשונית ממוחות עכברים נאונטליים לחקר תפקוד תאי מיקרוגליה ותפקידיהם במחלות נוירולוגיות. הפרוטוקול מספק תרביות טהורות לניסויים מבוססי תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ממומן על ידי תוכנית עירונית באוניברסיטת שירותי במדים.

1. דיסקציה של רקמת מוח החולדה ילודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-15 צ&#39;יל של ליבוביץ בתקשורת ממוזגים (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) עד 4 ° C. התקשורת והתרבות חמים (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ל 37 ° C. הכן 4 60x15 מ&quot;מ צלחות פטרי עם 4-5 מ&quot;ל של L-15 מדיה מותנה קרח. לעקר את כל כלי ניתוח עם אתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגורים-P2 ראפ היילודים עם אתנול 70%. (גורי עכברים היילודים בגילאי P1-P5 ניתן להשתמש בפרוטוקול זה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד מהרה לערוף עכברוש גור במספריים חדים סטריליים ושחרר את הראש מיד אתנול 70%. חזור עבור סכום כולל של 5 גורי עכברים מכן להעביר ראשי לתוך תמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח כולו מראשי ומניחים לתוך צלחת פטרי עם 4 - 5 מ&quot;ל L-15 פתרונות (ליבוביץ&#39; L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נהלים 1.2 - 1.4 עבור הגורים הנותרים המלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את קרומי המוח מהמוח ולהעביר desרקמת המוח ired (כלומר, קליפה, המוח הקטן, המוח כולו, וכו &#39;) לתוך צלחת פטרי חדשה עם 4-5 מ&quot;ל של תמיסת L-15 (ליבוביץ L-15 + 0.1% BSA + פן 1% / דלקת) על קרח. </li></ol> 2. הכנת אוכלוסייה מעורבת תא גלייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא פגיעה ברקמת המוח עם מספריים או סכין, להעביר את הרקמה עם פיפטה 10 מ&quot;ל ל 50 מ&quot;ל צינור סטרילי חרוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת חרוט על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant. הוסף 4-5 מ&quot;ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + 0.1% + 1% BSA פן / דלקת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה סטרילית 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא (100 הנקבוביות מיקרומטר) על צינור טרי 50 מ&quot;ל חרוטית. רקמת פיפטה מעלה ומטה פעם אחת עם 5 מ&quot;ל פיפטה סטרילית ועם פיפטה סומק כדי מסננת את התא, לוותר על החומר דרך מסננת לתוך התא צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את המסננת תא עם 4-5 מ&quot;ל של L-15 מדיה טריים (ליבוביץ L-15 + BS 0.1%עט + 1% / דלקת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת חרוטי עם תאים מתוחים על RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C. </li></ol> 3. ציפוי ותחזוקה של מעורבות בתרביות תאים גליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד במוח החולדה גור מעובד להכין 1 T-75 סטריליים קנקן ידי הוספת 12 מ&quot;ל של תרבות המדיה (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) לתוך בקבוק אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant מתאי pelleted ולהוסיף 5-6 מ&quot;ל של מדיה ותרבות כדי גלולה התא. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נפח שווה של ההשעיה התא בקבוק T-75 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלוחיות של CO 2 באינקובטור 5% ב 37 ° C עבור סכום כולל של 1-3 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות יש מודגרות 1 למשך 5 ימים, ביום החמישי, להחליף את התקשורת והתרבות בבקבוק כל אחד עם 12 מ&quot;ל של התקשורת טריים ולחזור חממה. לאחר מכן, כל 3 ימים, להחליף את התקשורת מיזוג של כל אחד עם בקבוק 12 מ&quot;ל של התקשורת טריים להשיג המפגש. זה חייב לעשותנה בזהירות בלי לגעת התחתונה של צלוחיות שבו התאים לצרף. </li></ol> 4. בידוד ציפוי של microglia ראשי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תרבויות גליה מעורבים הם confluent לחלוטין, הסר צלוחיות של חממה ולכסות כמוסות קנקן עם parafilm למנוע חילוף הגזים עם האוויר הסביבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחוץ את צלוחיות ב 100 RPS (מסייע מעבדה SI-600, Jeio טק) עבור שעות 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מדיה מכל צלוחיות עם פיפטה 10 מ&quot;ל מבלי לשבש את שכבת astrocyte על פני הבקבוק. מניחים את צינורות התקשורת ב -50 מ&quot;ל בצורת חרוט. הוסף מדיה טריים על צלוחיות וצפחות ​​וחזרה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת צינורות חרוטי ב RCF 2500 דקות 5 על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant מכל צינורות דמויי קונוס. כדורי סלולריים הם גבוהים מיקרוגליה תאים טוהר. כדורי Resuspend ב 1 מ&quot;ל של microglia ציפוי התקשורת (DMEM FES + 10% + 1% פניצילין / סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספור את צפיפות התאים בתקשורת resuspended באמצעותhemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח מתאים של התקשורת מיקרוגליה ציפוי להשגת 2 x 10e5 תאים לכל צפיפות מ&quot;ל. צלחת בהתאם לניתוח ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר microglia לצרף לילה. </li></ol> 5. נציג תוצאות הפרוטוקול שתואר לעיל התוצאות גבוהות תרבויות טוהר העיקריים מיקרוגליה. כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה לסמן מקרופאג / microglia תאים ספציפיים (Iba1), מצופה תרבויות מיקרוגליה הם&gt; טהור 90% (איור 2). בנוסף, מכתים עבור סמנים סלולריים astrocyte, oligodendrocyte ו נוירונים ספציפיים מדגים זיהום מינימלי (איור 2). לאחר הקמת מעורבות בתרביות תאים גליה, microglia יכול להיות מבודד על ידי ניעור עד 4 פעמים רצופות. הבידוד הראשונית microglia תניב כ -2.2 x 106 תאים למ&quot;ל או כ -9 מיליון תאים לכל 10 צלוחיות והתשואה הצפויה יורדת עם כל שא ברציפותקה. Microglia מבודדים בשיטה זו נעשה שימוש בהצלחה לחקור היכולת phagocytosis, פונקציה כגון ייצור תחמוצת החנקן, רעילות עצבית (איור 3) 13-14. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול להכנת תערובת בתרביות תאים גליה ובידוד של microglia העיקרי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> איור 2. בידוד של microglia טוהר גבוהה אומת על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות microglia (איבא-1, אדום), astrocyte (GFAP, ירוק), תא עצב (NeuN, אדום) oligodendrocyte (CC1, אדום) סמנים ספציפיים. מכתים את ה-DNA של תאים בתרבית על ידי DAPI (כחול) מוצג גם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> איור 3. מבודד microglia ב שיטת descriבמיטה נעשה שימוש במספר מבחני, כולל אך לא רק, מבחני פאגוציטוזיס, מבחני תפקוד לימודי neurotoxicity. במחקרים אלה, מצאנו כי microglia (איבא-1 חיובי, ירוק), כאשר הם נחשפים לשליטה (א) או LPS (ב &#39;) התקשורת שטופלו, להגדיל phagocytosis שלהם שכותרתו fluorescently חרוזים לטקס (אדום), אשר ניתן לכמת ( ג). יתר על כן, LPS (1ng/ml) הטיפול יכול להגביר את ייצור תחמוצת החנקן microglia (ד &#39;). לבסוף, הן באמצעות הוספת transwell מופרד או ישירות microglia-נוירונים תרבויות, מצאנו כי microglia מודגרות עם LPS יכולות לגרום מוות של תאים עצביים, כפי שהיא נמדדת על ידי לקטט דהידרוגנז LDH () שחרור (E, F).

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain%3A+graded+response%2C+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li>
<li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li>
<li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li>
<li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).</li>
<li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3A+immunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
<li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li>
<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אמנם זה פרוטוקול מנוצל באופן שגרתי כדי לייצר microglia טהור ובריא ניסויים מחקריים, שיקול דעת מעמיק של ההיבטים הטכניים במהלך חלקים קריטיים של תהליך יהיה למזער משונות microglia מבודד. ראשית, במהלך דיסקציה של רקמת המוח מן הגורים חולדה היילודים, עבודה במועד הדרוש כדי למזער את הנזק ואת חוסר חמצן לרקמות איסכמי. עם זאת, חשוב גם להסיר לחלוטין את כיסוי meningeal מהמוח במהלך לנתיחה, כי נוכחות של קרומי המוח יתרום זיהום פיברובלסטים משמעותית בשל קצב התפשטות המהירה בתנאים תרבות. <p class="j...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 60 מ&quot;מ X 15 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> פישר המותג </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> מספריים חדים המבתרים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # מלקחיים סטנדרטיים 7 ב טיפים, מעוגלים, 11cm </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> דומונט # 5 מלקחיים סטנדרטיים טיפים, ישרים, 11 ס&quot;מ </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות חרוטי </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות </td><td> גרנייה ביו אחת </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות </td><td> גרנייה ביו אחת </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> תא 100 מיקרומטר סטרילית ניילון מסננת </td><td> בז </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 2 ס&quot;מ רקמות תרבות צלוחיות </td><td> קורנינג </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco מינימלית של אמצעי חיוני (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי סוסים סרום </td><td> דיג </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% אתנול </td><td> חברת וורנר גרהם </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו תמיסת מלח, 10X, pH 7.4 </td><td> איכות ביולוגית, Inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X במים מזוקקים סטרילית </td></tr><tr><td> Biohazard שקיות </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> האוסר מדעי </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם תרבית תאים צלחות עם משטח cellBIND </td><td> קורנינג </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

מיקרוגליה מהוות כ-12% מסך כלל האוכלוסייה התאית במוח של יונקים. בעוד שנוירונים ואסטרוציטים נחשבים לסוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים, המיקרוגליה ממלאת תפקיד משמעותי בפיזיולוגיה התקינה של המוח על ידי ניטור הרקמה לאיתור פסולת ופתוגנים ושמירה על הומאוסטזיס בפארנכימה באמצעות פעילות פגוציטית 1,2. מיקרוגליה מופעלות במהלך מספר מצבים של פגיעה ומחלה, כולל מחלות ניווניות של מערכת העצבים, פגיעות ראש טראומטיות וזיהומים במערכת העצבים 3. תחת תנאי הפעלה אלו, המיקרוגליה מגבירות את הפעילות הפגוציטית שלהן, עוברות שינויים מורפולוגיים ושגשוגיים, ומפרישות באופן פעיל רדיקלים חופשיים של חמצן וחנקן, כימוקינים וציטוקינים פרו-דלקתיים, ולעיתים קרובות מפעילות לולאת פראקרין או אוטוקרין 4-6. מכיוון שתגובות מיקרוגליות אלו תורמות לפתוגנזה של מחלות במצבים נוירולוגיים, נדרש מחקר המתמקד במיקרוגליה.
	בשל ההטרוגניות התאית של המוח, קשה מבחינה טכנית להשיג חומר דגימה מספיק של מיקרוגליה ברמת טוהר גבוהה במהלך ניסויי in vivo. מחקרים עכשוויים על התפקודים הנוירופרוטקטיביים והנוירוטוקסיים של המיקרוגליה דורשים שיטה טכנית שגרתית ליצירה עקבית של מיקרוגליה טהורה ובריאה בתנובה מספיקה למחקר. אנו מציגים, בטקסט ובסרטון, פרוטוקול לבידוד מיקרוגליה ראשונית טהורה מתרביות גליה מעורבות למגוון יישומים המשכיים. בקצרה, טכניקה זו משתמשת ברקמת מוח מופרדת של גורי חולדה ניאונטליים כדי להפיק תרביות תאי גליה מעורבים. לאחר שתרביות הגליה המעורבות מגיעות לקונפלואנציה, מיקרוגליה ראשונית מבודדת באופן מכני מהתרבית באמצעות ניעור למשך זמן קצר. לאחר מכן, המיקרוגליה נזרעת בדרגת טוהר גבוהה לצורך מחקר ניסויי.
	העיקרון והפרוטוקול של מתודולוגיה זו תוארו בספרות 7,8. בנוסף, מתודולוגיות חלופיות לבידוד מיקרוגליה ראשונית מתוארות היטב 9-12. רקמת מוח הומוגניזית עשויה להיות מופרדת באמצעות סבוב צנטריפוגי במדרג צפיפות כדי להפיק מיקרוגליה ראשונית 12. עם זאת, הסבוב הצנטריפוגי הוא באורך בינוני (45 min) ועשוי לגרום לנזק תאי ולהפעלה, כמו גם לגרום להעשרה של מיקרוגליה ואוכלוסיות תאיות אחרות. פרוטוקול אחר שימש לבידוד מיקרוגליה ראשונית במגוון אורגניזמים באמצעות ניעור ממושך (16 hr) בזמן שהם בתרבית 9-11. לאחר הניעור, הנוזל העליון של המדיום עובר סבוב צנטריפוגי כדי לבודד את המיקרוגליה. שיטת בידוד זו, הכוללת שני שלבים וזמן ממושך יותר, עשויה אף היא להפר את תפקוד המיקרוגליה והפעלתה. במעבדתנו אנו משתמשים בעיקר בפרוטוקול בידוד המיקרוגליה הבא ממספר סיבות: (1) מיקרוגליה ראשונית מדמה ביולוגיה in vivo באופן נאמן יותר מקווי תאי מיקרוגליה של מכרסמים שהם אלמוותיים, (2) שיבוש מכני מינימלי מפחית תפקוד תאי לקוי או הפעלה פוטנציאלית, ו-(3) ניתן להשיג תפוקה מספקת ללא צורך במעבר (passage) של תרביות התאי הגליאליים המעורבות.
	חשוב לציין כי פרוטוקול זה משתמש ברקמת מוח של גורי חולדה ניאונטליים לצורך בידוד מיקרוגליה, וכי שימוש בחולדות מבוגרות יותר לבידוד מיקרוגליה עלול להשפיע באופן משמעותי על התנובה, מצב האקטיבציה והתכונות התפקודיות של המיקרוגליה המבודדת. קיימות ראיות לכך שהזדקנות קשורה לתפקוד לקוי של מיקרוגליה, להגברת נוירו-דלקת ולפתולוגיות ניוრო-דגנרטיביות, ולכן מחקרים קודמים השתמשו במיקרוגליה בוגרת ex vivo כדי להבין טוב יותר את תפקידה של המיקרוגליה במחלות ניורו-דגנרטיביות שבהן הגיל הוא פרמטר חשוב. עם זאת, לא ניתן להחזיק מיקרוגליה ex vivo בתרבית למשך תקופות זמן ממושכות. לפיכך, בעוד שפרוטוקול זה מאריך את חייה של מיקרוגליה ראשונית בתרבית, יש לציין כי המיקרוגליה מתנהגת באופן שונה ממיקרוגליה בוגרת, ויש לשקול בזהירות את השמעות של מחקרים in vitro כאשר מתרגמים אותם למסגרת של in vivo.

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial העיקריות<em&gt; במבחנה</em&gt; מחקר ויישומים במורד הזרם.

מיקרוגליה מהוות כ-12% מסך כלל האוכלוסייה התאית במוח היונקים. בעוד שנוירונים ואסטרוציטים נחשבים למרכיבים העיקריים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין תרביות ראשוניות של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות新生 (neonatal). דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד המוח והסרת הקרומים. השלב השני הוא הומוגניזציה של המוח וזריעת תרבית גליאלית מעורבת לבקבוקי T 75.בשלב הבא, מדגריעים את הבקבוקונים למשך 10 עד 14 ימים עד ששכבת מונו-שכבה של אסטרוציטים מגיעה לקונפלואנציה. השלב הסופי הוא ניעור הבקבוקונים כדי לשחרר מיקרוגליה הגדלה על גבי מונו-שכבת האסטרוציטים, מה שיוביל לתרבית מזוקקת של מיקרוגליה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוגליה ראשונית בדרגת טוהר גבוהה בניסויי תרבית תאים בודדים או בניסויי תרבית משולבת (co-culture) ב-in vitro.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת המדרגה (gradient) של Perico, הוא שההפרעה המכנית הנומינלית ממזערת את התפקוד הלקוי או את ההפעלה של המיקרוגליה, וניתן להפיק מיקרוגליה לניסויים במשך שבועות לאחר ההכנה הראשונית. אני אדגים הליך זה יחד עם Tammy Tero, סטודנטית לדוקטורט במעבדתו של Dr. Clifton Dau guard. ניתן להשתמש בתרביות המיקרוגליה בדרגת הטוהר הגבוהה המתקבלות במהלך פרוטוקול זה בניסויי in vitro כדי לחקור את תפקוד המיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, כמו גם במצבים פתולוגיים של מחלה.לתגובתיות של מיקרוגליה לנזקי רקמה, כמו גם לגירויים דלקתיים, יש רלוונטיות ישירה למצבים של פגיעה נוירולוגית ומחלות ניוון עצבי. באופן כללי, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו עלולים להתקשות בשל חוסר היכרות עם האופן שבו יש להסיר את הקרומי המוח מרקמת המוח בזמן, וזאת כדי להפחית זיהום של פיברובלסטים בתרביות ראשוניות של מיקרוגליה. בנוסף, יש לנהוג בזהירות כדי לא לפגוע בשכבת המונולייר של האסטרוציטים במהלך ניעור הבקבוקים והטיפול בתרביות המיקרוגליה.כדי להתכונן להליך, קררו את מצע L 15 ל-4 °C, הכינו צלחות פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר המכילות מצע L 15 והניחו אותן על קרח. חממו את מצע התרבית ל-37 °C וודאו שכל כלי הניתוח עברו סטריליזציה. לאחר עריפת ראשו של גור חולדה בשלב P1 עד P5 באמצעות מספריים חדים, הכניסו את הראש ל-70% ethanol.לאחר איסוף ראשיהם של חמישה גורי חולדה, העבירו את הראשים לתמיסת סלין. הוציאו את המוח השלם מכל ראש על ידי ביצוע חתכים זהירים בשני צידי הגולגולת מעל האוזניים, ומשיכת המוח החוצה אל תוך אחת מפטריות הפטרי הכוללות מצע L 15 על קרח. ברגע שחמשת המוחות הראשונים הועברו ל-L 15 על קרח, ניתן לעבד את חמשת הגורים הבאים באותו אופן, עד לאיסוף כל המוחות.הסר את הקרומים על ידי תפיסה עדינה של קצה שכבת הקרומים בעזרת פינצטה וקילוף זהיר שלה מהקליפה (cortex) שמתחתיה. חיוני להסיר את הקרומים ביסודיות ולעשות זאת במהירות האפשרית. לאחר הסרת הקרומים, העבר כל אחד מהמוחות לצהית פטרי נקייה עם מצע L 15 על קרח.השתמשו בפיפט של 10 milliliter כדי לשאוב את רקמת המוח והמצע מהצלחת אל תוך מבחנה קונית סטרילית של 50 milliliter. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-2, 500 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל.לאחר מכן, השתמש בפיפטה סטרילית של 10 milliliter כדי להעביר את התוכן. השהה את המשקע ב-four to five milliliters של מצע L 15 טרי, ובצע פיפוט של המצע והרקמה מעלה ומטה 10 פעמים. לאחר מכן, הנח מסננת תאים עם נקבים של 100 micron על מבחנה קונית טריה של 50 milliliter.השתמשו בפיפטה סטרילית של 5 mL כדי להעביר את תגלי התרחיף של הרקמה למעלה ולמטה, ולאחר מכן, כאשר הפיפטה צמודה למסנן התאים, העבירו את החומר דרך מסנן התאים אל תוך המבחנה הקונוית. שטפו את המסנן עם 4 עד 5 mL של מצע L 15 רענן ומקורר. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-2,500 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.עבור כל מוח של גור חולדה שעובד, הכין מבחנת T 75 סטרילית על ידי הוספת 12 milliliters של מצע גידול שעבר חימום מוקדם לכל מבחנה. לאחר מכן, לאחר שאיבת הנוזל העליון (supernatant) מהתאים ששקעו, הוסף חמישה עד שישה milliliters של מצע גידול למשקע התאים, ובצע פיפטור למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה של 10 milliliters. לאחר מכן, העבר נפח שווה של תגססת תאים לכל מבחנת T 75.דגרו את הבקבוקים באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שבוע עד שלושה שבועות, והשאירו את התאים ללא הפרעה בחמשת הימים הראשונים לאחר הזריעה הראשונית. לאחר חמישה ימים, החליפו את המצע המותנה בכל בקבוק ב-12 milliliters של מצע טרי כדי להשיג קונפלואנס. יש לבצע זאת בזהירות רבה, ללא מגע עם תחתית הבקבוק שבה נצמדים התאים.ברגע שתרביות הגליאל המעורבות הגיעו למצב של התמזגות מלאה (confluence), הוצא את הבקבוק מהאינקובטור. כסה את פקקי הבקבוקים עם פאראפילם למניעת חילוף גזים עם אוויר הסביבה, והנח את הבקבוקים באינקובטור עם ניעור המכוון ל-100 RPS ו-37 degrees Celsius למשך שעה. לאחר שחלפה השעה, השתמש בפיפט של 10 milliliter כדי לאסוף את המצע מהבקבוקים מבלי להפריע לשכבת האסטרוציטים, והעבר אותו למבחנות קוניות של 50 milliliter. הוסף מצע טרי לבקבוקים והחזר אותם לאינקובטור.לאחר צנטריפוגציה של המבחנות ב-2, 500 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שאבו את הנוזל העליון ושחזרו את התליית התאים ב-1 ml של מצע זריעה למיקרוגליה. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות ספירה תאים אנושית ובפרוטוקולים סטנדרטיים. ברגע שמספר התאים נקבע, הוסיפו נפח מתאים של מצע זריעה למיקרוגליה כדי להגיע לריכוז התאים הרצוי.ריכוז של 2 × 10⁵ תאים למילליליטר בצלחת הוא המתאים לניסוי; החזירו את הצלחות לאינקובטור כדי לאפשר למיקרוגליה להיצמד במהלך הלילה. התאים נצבעו אימונוהיסטוכימית עם נוגדן ספציפי ל-IBA1, סמן של מיקרוגליה, המופיע בצבע אדום.קיימת זיהום מינימלי של התרבית בתאי עצב, כפי שמוצג בתמונה מיקרוסקופית זו של צביעה אימונו-היסטוכימית באמצעות נוגדן לסמן עצבי new NA, המופיע בצבע אדום. השקופית נצבעה בצביעה נגדית עם DPI לצביעת כל גרעיני התאים בכחול. תמונה זו מראה צביעה אימונו-היסטוכימית עם GFAP, שהוא סמן לאסטרוציטים.האסטרוציטים מופיעים בירוק. כאן אנו רואים תמונה של תרבית מיקרוגליה שצבעה אימונו-היסטוכימית באמצעות נוגדן ספציפי ל-CC1, סמן לאוליגודנדרוציטים. האוליגודנדרוציטים מופיעים באדום.היסטוגרמה זו מציגה את תוצאות הכימות של כל סוג תא. ניתן לראות כי תרביות המיקרוגליה שנזרעו הן בטוהר של מעל 90%. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנציה זו מציגה תרבית מיקרוגליה שעברה צביעה אימונוהיסטוכימית ל-IBA1.האזורים האדומים הם חרוזי לטקס המסומנים פלואורסצנטית. התרבית של המיקרוגליה המוצגת כאן טופלה ב-1 ng/mL של lipopolysaccharide, וניתן לראות כי תאי המיקרוגליה ביצעו פגוציטוזה של חרוזי הלטקס המסומנים פלואורסצנטית. כאן, תוצאות בדיקת הפגוציטוזה מוצגות בהיסטוגרמה.נצפתה פאגוציטוזה מוגברת לאחר טיפול ב-LPS. איור זה מראה כי גם ייצור חנקן חמצני (nitric oxide) עולה בתרביות מיקרוגליה לאחר הוספת LPS. לבסוף, הן תרביות מיקרוגליה ונוירונים ישירות והן תרביות המופרדות על ידי תאי השבחה (transwell insert) רגישות להגברת מוות תאי לאחר דגירה עם LPS, כפי שנמדד על ידי שחרור lactate dehydrogenase. לאחר השליטה בחלק הראשון של טכניקה זו, עד לשלב הזריעה לבקבוקי T 75, ניתן להשלים את התהליך תוך שעה וחצי, ואת הפרוצדורה המלאה ניתן להשלים בתוך שבועיים.שיקול נוסף במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה הוא קביעת משך הזמן. יש לתחזק תרביות גליאליות מעורבות לפני בידוד מיקרוגליה ראשונית לצורך זריעה, וזאת לאחר ביסוסן של תרביות ברמת טוהר גבוהה. באמצעות הליך זה, ניתן להעריך את תפקוד המיקרוגליה in vitro; ניתן לקבוע ולמדוד ייצור של nitric oxide, שחרור של ציטוקינים וכימוקינים, וכן פעילות פאזית, וכל זאת באמצעות בדיקות מעבדה שגרתיות.כך, עם פיתוחו של הליך זה, חוקרים בתחום מדעי המוח מחזיקים ביכולת לבחון את פעילות המיקרוגליה בסביבה תאית הומוגנית ולחקור את תפקידיהם תחת תנאיים נוירולוגיים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תרביות ראשוניות של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות רכים. התהליך מתבצע תחילה על ידי בידוד המוח והסרת הקרומים, ולאחר מכן הומוגניזציה של המוח והזרקתו לבקבוקים, אשר מודגלים למשך 10 עד 14 ימים עד להגעה של שכבת מונו-לייר של אסטרוציטים לקונפלואנסיה.השלב הסופי הוא ניעור הבקבוקים כדי לשחרר את המיקרוגליה הגדלה מעל השכבה החד-שכבתיות של האסטרוציטים, דבר שיוביל לתרבית מטוהרת של מיקרוגליה.

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד וטיפוח תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות. זה כרוך בהפרדת מיקרוגליה מתאים עצביים ולא עצביים אחרים באמצעות לוחות המצופים בנוגדן חד שבטי ספציפי למיקרוגליה.

בידוד ותרבית של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות באמצעות מדיה נטולת סרום

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

למדו לבודד מיקרוגליה ראשונית ממוחות עכברים נאונטליים לחקר תפקוד תאי מיקרוגליה ותפקידיהם במחלות נוירולוגיות. הפרוטוקול מספק תרביות טהורות לניסויים מבוססי תאים.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

גלה סרטונים נוספים