בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial העיקריות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תרביות תאי מיקרוגליה ראשוניות ממוחות של חולדות יילודים. זה מושג על ידי בידוד המוח והסרת קרומי המוח. השלב השני הוא הומוגניזציה של המוח וצלחת לתרבית גליה מעורבת לצלוחיות T 75.

לאחר מכן, הצלוחיות מודגרות במשך 10 עד 14 ימים עד שחד-שכבת אסטרוציטים מגיעה למפגש. השלב האחרון הוא לנער את הצלוחיות כדי לשחרר מיקרוגליה שגדלה על גבי האסטרוציטים החד-שכבתיים, וכתוצאה מכך תרבית מטוהרת של מיקרוגליה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוגליה ראשונית בטוהר גבוה במבחני תרבית תאים בודדים במבחנה ובתרבית משותפת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שיטת שיפוע פריקו, הוא ששיבוש מכני נומינלי ממזער תפקוד לקוי או הפעלה של מיקרוגליה, וניתן ליצור מיקרוגליה לניסויים במשך שבועות לאחר ההכנה הראשונית. אני אדגים את ההליך הזה יחד עם תמי טרו, סטודנטית לתואר שני במעבדה של ד"ר קליפטון דאו. ניתן להשתמש בתרביות מיקרוגליה בטוהר גבוה שהושגו במהלך פרוטוקול זה בניסויים במבחנה כדי לחקור את תפקוד המיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים רגילים, כמו גם במצבי מחלה פתולוגיים.

למיקרוגליה, היענות לנזק לרקמות, כמו גם לגירויים דלקתיים יש רלוונטיות ישירה לפגיעה נוירולוגית ולמצבים של מחלות ניווניות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהם אינם יודעים כיצד להסיר את קרומי המוח מרקמת המוח בזמן על מנת להפחית את זיהום הפיברובלסטים בתרביות המיקרוגליה הראשוניות. בנוסף, יש להקפיד שלא לפגוע בשכבת האסטרוציטים במהלך טלטול צלוחיות וטיפול בתרביות המיקרוגליה.

כדי להתכונן להליך, צ'י ליבי הוא L 15 מדיה לארבע מעלות צלזיוס, מוכן לצלחות פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר המכילות מדיה L 15 ומניחים על קרח. לחמם את אמצעי התרבות ל-37 מעלות צלזיוס ולוודא שכל כלי הניתוח עברו סטריליזציה. לאחר עריפת ראשו של גור חולדה P אחד עד P חמש עם מספריים חדים, זרוק את הראש לתוך אתנול 70%.

לאחר איסוף ראשיהם של חמישה גורי חולדות, העבירו את הראשים לתמיסת מלח. הסר את כל המוח מכל ראש על ידי ביצוע חתכים בזהירות משני צידי הגולגולת מעל האוזניים, ומשיכת המוח החוצה לתוך אחת מבעיות הפטרי המכילות L 15 מדיום על קרח. ברגע שחמשת המוחות הראשונים הועברו ל-L 15 על קרח, חמשת הגורים הבאים יכולים להיות מעובדים באותו אופן כאשר כל המוחות נאספו.

הסר את קרומי המוח על ידי אחיזה עדינה בקצה יריעת קרום המוח בעזרת מלקחיים וקילוף בזהירות מקליפת המוח הבסיסית. חיוני להסיר היטב את קרומי המוח ולעשות זאת במהירות האפשרית. לאחר הסרת קרומי המוח, העבירו כל אחד מהמוחות לצלחת פטרי טרייה של L 15 בינוני על קרח.

השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לשאוב את רקמת המוח והמדיום מהצלחת לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה ב -2, 500 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעקבות צנטריפוגה לשאוף.

לאחר מכן הסופינט משתמש בפיפטה סטרילית של 10 מיליליטר לריס. תלו את הגלולה בארבעה עד חמישה מיליליטר של מדיה טרייה של L 15, פיפטו את המדיה והרקמה למעלה ולמטה 10 פעמים. לאחר מכן הניחו מסננת תאי נקבוביות של 100 מיקרון על צינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר.

השתמש בפיפטה סטרילית של חמישה מיליליטר כדי להזיז את תרחיף הרקמה למעלה ולמטה, ולאחר מכן כשהפיפטה נשטפת למסננת התאים, הוציא את החומר דרך מסננת התא לתוך הצינור החרוטי. שטפו את המסננת עם ארבעה עד חמישה מיליליטר של מדיה L 15 צוננת טרייה. לאחר מכן צנטריפוגה של 2,500 RCF למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס.

עבור כל מוח גור חולדה שעובד, הכינו בקבוק T 75 סטרילי על ידי הוספת 12 מיליליטר של מצע תרבות מלפני המלחמה לכל בקבוק. לאחר מכן, לאחר שאיבת הנוזל מהתאים הגלולים, הוסף חמישה עד שישה מיליליטר של מצע תרבית לכדור התא, פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן העבירו נפח שווה של תרחיף תאים לכל בקבוק T 75.

דגרו את הצלוחיות בחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שלושה שבועות, מה שמאפשר לתאים לשבת ללא הפרעה במשך חמשת הימים הראשונים לאחר הציפוי הראשוני. לאחר חמישה ימים, החלף את המדיום הממוזג בכל בקבוק ב -12 מיליליטר של מדיום טרי כדי להשיג מפגש. יש לעשות זאת בזהירות רבה מבלי לגעת בתחתית הבקבוק בו מתחברים התאים.

לאחר שתרביות הגליה המעורבות נפגשות לחלוטין, הסר את הבקבוק מהחממה. מכסים את מכסי הבקבוק בפרם כדי למנוע חילופי גזים עם אוויר סביבתי ומניחים את הצלוחיות באינקובטור רועד המכוון ל-100 RPS ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר שחלפה השעה, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לאסוף את המדיה מהצלוחיות מבלי לשבש את שכבת האסטרוציטים והחלק לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. מוסיפים מדיה טרייה לצלוחיות ומחזירים לחממה.

לאחר צנטריפוגה של הצינורות ב-2, 500 RCF למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס, שאפו את הסופינט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של תווך ציפוי מיקרוגליה. לאחר מכן ספרו את התאים באמצעות ציטומטר אנושי ונהלים סטנדרטיים. לאחר קביעת מספר התאים, הוסף נפח מתאים של אמצעי ציפוי מיקרוגליה כדי להשיג תא.

ריכוז של פעמיים כפול 10 לחמשת התאים לצלחת מיליליטר מתאים לניסוי וחזרה לחממה. כדי לאפשר למיקרוגליה להיצמד למשך הלילה. התאים היו אימונוציוניים עם נוגדן ספציפי ל-IBA, סמן מיקרוגליאל, שנראה אדום.

יש זיהום מינימלי של התרבית בתאי עצב כפי שמודגם על ידי תמונת מיקרוסקופ זו של צביעה חיסונית באמצעות נוגדן לסמן עצבי NA חדש, שנראה אדום. השקופית הוכתמה ב-DPI כדי לצבוע את כל גרעיני התאים בכחול. תמונה זו מציגה צביעה חיסונית עם GFAP וסמן אסטרוציטים.

האסטרוציטים נראים ירוקים. כאן אנו רואים תמונה של תרבית המיקרוגליה המוכתמת בנוגדנים ספציפיים ל-CC אחד, סמן אוליגודנדרוציטים. האוליגודנדרוציטים נראים אדומים.

היסטוגרמה זו מציגה את תוצאות הכימות של כל סוג תא. ניתן לראות כי תרביות המיקרוגליה המצופות הן יותר מ-90% טהורות. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זו מציגה תרבית מיקרוגליאלית שהייתה כתם חיסוני עבור IBA.

האזורים האדומים מסומנים בחרוזי לטקס פלואורסצנטיים. תרבית המיקרוגליה המוצגת כאן טופלה בפוליסכריד ליפו של ננוגרם אחד למיליליטר, וניתן לראות כי לתאי המיקרוגליה יש פגוציטוזיס, חרוזי הלטקס המסומנים בפלואורסצנט. כאן, תוצאות בדיקת הפגוציטוזיס מוצגות בהיסטוגרמה.

פגוציטוזיס מוגבר נראה לאחר טיפול ב- LPS. נתון זה מראה כי ייצור תחמוצת החנקן עולה גם בתרביות מיקרוגליה לאחר הוספת LPS. לבסוף, תרביות נוירונים מופרדות של מיקרוגליה ישירות או טרנסוול רגישות למוות מוגבר של תאים לאחר הדגירה עם LPS כפי שנמדד על ידי שחרור לקטט דהידרוגנאז לאחר שליטה בחלק הראשון של טכניקה זו, עד לציפוי ל-T 75, ניתן לבצע צלוחיות תוך שעה וחצי, וניתן לבצע את ההליך המלא תוך שבועיים.

שיקול נוסף במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה הוא קביעת משך הזמן. יש לשמור על תרביות גליה מעורבות לפני בידוד מיקרוגליה ראשונית לציפוי לאחר הקמת תרביות טוהר גבוה. באמצעות הליך זה, ניתן להעריך את תפקוד המיקרוגליה במדידה חוץ גופית של ייצור תחמוצת החנקן, שחרור ציטוקינים וכימוקין, כמו גם פעילות פאזית באמצעות בדיקות מעבדה שגרתיות.

לפיכך, עם התפתחות הליך זה, לחוקרים בתחום מדעי המוח יש את היכולת לחקור את פעילות המיקרוגליה בסביבה תאית הומוגנית ולחקור את תפקידיהם בתנאים נוירולוגיים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין תרביות תאי מיקרוגליה ראשוניות ממוחות של חולדות יילודים. על ידי בידוד המוח והסרת קרומי המוח, ולאחר מכן הומוגניזציה של המוח וציפוי לצלוחיות, לאחר מכן הצלוחיות מודגרות למשך 10 עד 14 ימים עד שחד-שכבת אסטרוציטים מגיעה למפגש.

השלב האחרון הוא ניעור הצלוחיות כדי לשחרר מיקרוגליה שגדלה על גבי האסטרוציטים החד-שכבתיים, וכתוצאה מכך תרבית מטוהרת של מיקרוגליה.