טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להאיץ את ניתוח הבידול העצבי של תאי מוצא עצביים אנושיים המגודלים בסביבה תלת-ממדית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי גידול התאים במטריקס טהור של הידרוג'ל המבוסס על פפטידים המרכיבים את עצמם. לאחר מכן, התאים משוחררים מהפיגומים התלת-ממדיים.

בשלב השלישי, מבוצע צביעה אימונו-פיטוכימית של התאים. התאים נספרים באמצעות ניתוח פלואקומטרי (flow cytometric analysis). לבסוף, ניתן לקבוע את קצב הדיפרנציאציה העצבית או את קצב האפופטוזיס באמצעות ניתוח פלואקומטרי לסמני עצבים או לסממנים אפופטוטיים, בהתאמה.

באמצעות טכניקה זו, הכימות של הדיפרנציאציה העצבית מהירה הרבה יותר ונתוני ה-Optane נאספים בבסיס רחב יותר מאשר בטכניקות של מיקרו-פוטוגרפיה. עבור הטמעת תאים במטריצה טהורה, מקמו תחילה כיסוי זכוכית סטרילי בקוטר 13 מילימטר בכל אחד משני בארות של פלטת תרבית תאים בעלת ארבע בארות. לאחר מכן, אחסנו את הפלטה בבנץ' נקי לשימוש מאוחר יותר. בשלב הבא, נתקו את תאי המוצא העצביים האנושיים (hNPCs) על ידי הוספת 2.5 מיליליטר של טריפסין שהוכן טרי.

הוסף תמיסת Benzon לצלחת התרבית והדגרי את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר חמש דקות, עצור את התגובה באמצעות תמיסת מעכב טריפסין Benzon. לאחר מכן, לאחר סבב צנטריפוגה של התאים שהסתרו ב-3000 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, השהה מחדש את המשקוע שהתקבל ב-5 mL של תמיסת סוכרוז 10%, ולאחר מכן שטוף את תרחיף התאים תחת אותם תנאי צנטריפוגה.

לאחר השלכת ה-snat Resus, השעו את המשקע בתמיסת הסוכרוז עד לריכוז תאים סופי של 1 × 10⁶ תאים למיליליטר. כעת, כמהר ככל האפשר, ערבבו 60 µL של ת сусפנזיית התאים עם תמיסה אחת, העבירו 120 µL מס сусפנזיה זו לפרועת הקונית עם תמיסה שתיים וערבבו בזהירות, ולאחר מכן העבירו מיד כשכבה 100 µL מהתערובת על כל אחת מזכוכית הכיסוי בלוח בעל ארבעה בארות. לבסוף, הוסיפו לאט 200 µL של מצע תרבית תאים לכל בארה.

לאחר שתי עד שלוש דקות, הוסיפו 200 µL נוספים של מצע גידול תאים לבארים כדי להתחיל את ההרכבה העצמית של המטריצה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת באזור המחומם של מvertret המטריצה (clean bench). הימנעו ככל האפשר מהזזת פלטת התרבית לאחר שהמטריצות הורכבו, והשתמשו בפיפט של 1000 µL כדי להסיר את רוב המצע, אך לא את כולו, כדי למנוע את התייבשות המטריצות.

לאחר מכן, שטפו את המטריצות עם 500 µL של מצע טרי למשך 10 דקות. לבסוף, הסירו את מצע השטיפה. הוסיפו 500 µL נוספים של מצע והניחו את פלטת התרבית באינקובטור.

במידת האפשר, יש לאחסן את המטריצות באינקובטור נפרד כדי למנוע ניעור מקרי של המבנים ביום הראשון של ניסוי הצביעה. יש להסיר את המצע מהמטריצות באמצעות פ pipette של 1000 µL ולאחר מכן לשטוף את הפיגומים ב-PBS פעם אחת למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 400 microliters של paraldehyde לכל באר כדי לקבע את המטריצות, והדגס אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קיבוע הפיגומים, שטוף אותם עם 500 microliters של PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, הדגס את המבנים בבופר חסימה למשך שש עד תשע שעות, תוך החלפת הבופר אחת לכל שתי עד שלוש שעות, עם דגסה סופית למשך הלילה בבופר חסימה טרי בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius; למחרת, הסר את בופר החסימה.

הוסיפו את תמיסת הנוגדן לבארות והדגירו את המטריצות שוב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כעת, הסירו את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו את הפיגומים ב-500 microliters של PBS למשך שמונה שעות, תוך החלפת ה-PBS מדי שעתיים, ולאחר מכן למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם PBS טרי. לאחר השטיפה הלילית, הסירו את ה-PBS והדגירו את הפיגומים עם תמיסת הנוגדן המשני למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר, בחושך.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות עם PBS ארבעה עד שישה פעמים למשך שעה בכל פעם, ולאחר מכן דגרו את המבנים עם PBS רענן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחשיכה למשך הלילה. כעת הוסיפו 50 µL של MOE all dab co על שקופיות המיקרוסקופ כדי להכינן להצמדת המטריצות. לאחר מכן, הצמידו בזהירות זכוכית כיסוי לכל שקופית.

לבסוף, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להוציא מיקרוגרפים בודדים דומים לאלה של ה-NPCs הצבועים בירוק עבור ביטוי המרקר הנוירונלי beta three tubulin המוצג כאן. לאחר שטיפת הפיגומים עם 500 µL של HBSS למשך דקה אחת, השתמשו בפיפטה של 1000 µL כדי להעביר את הפיגומים למבחנה קונית של 15 mL. לאחר מכן, השקיעו מחדש את תמיסת התאים מספר פעמים באמצעות פיפטה של 1000 µL כדי לפרק את המטריצות באופן מכני, ולאחר מכן סבבו את תמיסת הפיגומים ב-3000 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפטה והשקיעו מחדש את המשקע (pellet) ב-500 µL של תמיסת trypsin benzine על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים.

לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C. עצרו את התגובה לאחר חמש דקות באמצעות 1 mL של מעכב טריפסין. העבירו את תמיסות ה-Benznase באמצעות פיפוט מעלה ומטה מספר פעמים, לאחר סבוב של תרחיף התאים תחת אותם תנאי צנטריפוגה.

הסירו שאריות מטריצה על ידי שטיפת התאים עם 2 mL של בופר HBSS פעמיים. לבסוף, הסירו צברים על ידי העברת תמיסת תליית התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון בצנטריפוגה תחת אותם תנאים, ואספו את התאים למצע גידול תאים. התחילו בקיבוע התאים המופרדים ב-1%paraform paraldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.

לאחר השקעת התאים, השעו את המשקע בבופר שטיפה. כעת, לאחר סבב צנטריפוגה של התאים למשך 10 דקות ב-350 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, השעו את המשקע שנוצר ב-25 µL של תמיסת הנוגדנים. דגרו את תמיסות התאים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר.

לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של pon buffer ישירות לדגימות, ושטפו את תרחיפי התאים פעמיים תחת אותם תנאי צנטריפוגה. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו 25 µL מהנוגדן המשני והדגירו את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, בחשכה. לאחר שטיפת התאים פעמיים נוספות עם saponin buffer, השביו את המשקע ב-500 µL של wash buffer לצורך אנליזה בציטומטריית זרימה.

באיור זה מוצגים NPCs של H העטופים במטריקס טהור; התאים גדלים בצורה של ספירות, מבנים צפופים שבהם קוטר הספירות יכול להגיע למאות מיקרונים בין ספירה אחת לשנייה. ניתן להבחין בצרורים של זקיפים שנבנו על ידי התאים, כפי שמוצג על ידי החצים הלבנים. על אף שתאים בודדים בקושי ניתנים לזיהוי, תאים העטופים במטריקס טהור בתוספת laminin גדלים במבנים פחות צפופים ומפוזרים באופן הומוגני יותר כפי שניתן לראות באיור זה, ואף ניתן לזהות תאים בודדים באזורים פחות צפופים, כפי שמוצג על ידי החצים השחורים. כאן, ה-H NPCs עברו דיפרנציאציה במשך ארבעה ימים במטריקס טהור בתוספת laminin וצבעו בירוק לסימון ביטוי של הסמן הנוירונלי.

בטא תלת-טובולין (Beta three tubulin) מוצג כדי להעריך את אחוז התאים החיוביים. ניתן לקבוע את מספר התאים הכולל על ידי ספירת גרעיני התאים הצבועים כאן בכחול באמצעות DAPI. מיקרוגרפ זה מייצג השלכה מלאה של Z-stack של תמונות שצולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ניתן להדביק מחדש תאים ששוחררו מהמטריצה, לדוגמה, על לבישי זכוכית (cover slips) כפי שמוצג באיור זה, לצורך מחקרי תפקוד נוספים. מיקרוגרפיה זו מציגה תאים שגודלו בתלת-ממד לאחר שעברו את הליך השחרור שהוזכר קודם לכן וגודלו במשך שלושה ימים. צביעה של beta three tubulin באדום חושפת מורפולוגיה דומה לזו של התאים ששוכנו בפיגום התלת-ממדי, כאשר נעשה שימוש בתאים לא צבועים כביקורת שלילית.

שער הניתוח (GA), המיוצג כאן כמסגרת השחורה, הוגדר לצורך הניתוח שלאחר מכן של תאים חיוביים ל-beta three tubulin. בגרף פיזור זה (dot plot), התאים החיוביים מופיעים בתוך המסגרת השחורה בחלק הימני של ציר ה-x; ניתן להבחין גם באוכלוסייה בינונית במסגרת המקווקוות, אשר ככל הנראה מייצגת שיירי תאים (cell debris). השוואה בין ספירה ידנית של תאים לבין ספירה באמצעות ציטומטריה של זרימה מוצגת באיור סופי זה. ניתן לזהות פרופורציה גבוהה בהרבה של תאים חיוביים באמצעות ניתוח ציטומטרי של זרימה, כפי שמוצג על ידי הריבועים השחורים הפתוחים, בהשוואה למספר התאים שניתן לספור בדרך כלל בספירה ידנית, כפי שמוצג על ידי המשולשים השחורים המלאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש במדדי איכות נמוכים לגידול של MPCs של קצה בפיגום תלת-ממדי, ובאופן שחרור התאים מהפיגום עבור מנתחים של זרימה ציטומטרית.