Name: מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למד מדידת כימוטקסיס תאי בזמן אמת באמצעות מערכת ECIS/Taxis. השיטה מנצלת חיישני עכבה חשמליים לעקוב אחרי תנועת תאים לכיוון אלקטרודת היעד דרך שכבת אגרוז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES07408 ו EB00208).

1. ECIS / מוניות אלקטרודה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח זהב של מערך ECIS / מוניות האלקטרודה (בהיקף של 8 תאים לכל שקופית) הוא התייצב לראשונה על ידי טיפול מקדים עם ציסטאין 10 mM סטרילית במים deionized (DH 2 O) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate הפתרון ציסטאין מן החדר כל אלקטרודה, יש לשטוף 3 פעמים עם סטרילית DH 2 O, ולהחליף μl 250 בינוני שלם (RPMI 1640, 10% FBS, 25 HEPES חיץ mM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מערך אלקטרודות כדי ליצור קשר עם מספרי זיהוי אישיים על בעל מערך המכשיר כדי לבצע בדיקת האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ'יימברס המחוברים כראוי יודגשו בירוק על מסך המחשב. אם לתאי מודגשים באדום, הם לא מחוברים האלקטרודה יש ​​לשנות את מיקומו של בעל מערך קשרים עבור כל חדרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל החדרים מחוברים, ללחוץ על כפתור "בדוק" בבקר תוכנה להרתיעלכרות את ההתנגדות הראשונית ואת ערכי קיבול עבור חדר אחד. ערכי ההתנגדות צריכה להיות בין 1600 ו 2000 אוהם, וערכים קיבול צריכה להיות בין 5 ל 6 nanofarads עבור מערך 8 קאמרית. אם החדר אינו נמצא הפרמטרים האלה מקובלים, חדר יחיד אין להשתמש כדי לאסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את האלקטרודה מבעל מערך להכין את חדרי בודדים agarose. Aspirate בינוני מלשכתו ולשטוף כל תא 3 פעמים עם סטרילית DH 2 א ' </li></ol> 2. הכנת agarose צ'יימברס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב צינורית סטרילית מ"ל 15 פוליפרופילן חרוטי, 0.03 גרם מידה של Seakem GTG agarose ולהוסיף 1 מ"ל סטרילי PBS. החלפת מכסה צינור רופף, וממיסים agarose ב החיטוי של מחזור 2 נוזל דק '(נמס במיקרוגל אינו יעיל עבור assay זה). זה זמן קצר לא להמיס את צינור חרוטי. עבור תאים פחות אנין שאינן דורשות סרום לתרבות, (למשל discoideum Dictyostelium) 0.5%agarose יכול להתבצע בכל אמצעי מתאים נמס במיקרוגל. החיטוי הוא הכרחי עבור תאים הדורשים סרום, כמו זה יהיה מפוגל אם נמס במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ"ל של מדיום RPMI חימם באמבטיה מלאה מים (55 ° -60 ° C) ישירות agarose חם, לריכוז סופי של 0.5% agarose ו pipet מעלה מטה בעדינות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 300 Pipet μl של המדיום agarose נמס לתוך תא אחד, להחליף את ECIS / מערך כיסוי מוניות ולאפשר ג'ל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet שנותר agarose לתוך כובע של שפופרת 15 מ"ל להעריך gelling agarose. Agarose זה עודף ישמש גם בחלק 4: חיתוך בארות לתוך agarose. </li></ol> 3. בניית והשחזה קנית כלי חיתוך טוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדד 2 14 cannulae בוטה מד סוף, באמצעות 5/64 "קצת. סובב את קצה המקדח בפתיחת כל צינורית עם המקדחה במהירות נמוכה, מה שהופך מסוימת המקדח חותך בקצה הפנימי של כל אחד אופ צינוריתening כדי ליצור חוד החנית חדה (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח שני חורים עד 1 "x 2" "פרספקס (איור 4 ב-D) עם 5/64" x ¼ קצת בעיתונות התרגיל. הכנס כל חידד 14 צינורית מד כך בולט במרחק שווה בין כל חור פרספקס. </li></ol> 4. חיתוך וולס לתוך agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר cannulae 14 מד ידי קלות בוערים הטיפים. לפני חיתוך בארות בחדר ECIS, לאפשר cannulae להתקרר לטמפרטורת החדר, או לצנן cannulae ידי נגיעה agarose בכובע של שפופרת 15 מ"ל. אם הטמפרטורה של הצינורית הוא גבוה מדי, agarose יתמוססו כמו בארות קאמרית נחתכים, עיבוד בארות את מעוות ופגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר זוג צינורית מעל שתי נקודות זהב סביב אלקטרודה היעד בתא אחד (איור 2 ג ו - 5). הכנס את צינורית אנכית, ללא כל תנועה אופקית, לעצור במגע עדין בין צינורית ופני האלקטרודה. מוציאים בזהירות את הצינורית, שוב ללא כל תנועה אופקית. המיקום של בארות נוספות נגד הדרגתיים אפשרי גם עם תצורה של לנענע צינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את התקע agarose שהותירה הצינורית, תוך שימוש סטרילי 9 "פיפטה פסטר, מחובר לחץ ואקום נמוך, עם מלכודת ואקום לתפוס פסולת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של שלמות התקשורת RPMI אל פני השטח של תא אחד על 37 מעלות צלזיוס, במשך 2 דקות כדי להרוות את agarose ולאחר מכן בעדינות לשאוב התקשורת מפני השטח ואת בארות מבלי להפריע agarose. </li></ol> 5. טוען וולס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם כל אחד מסוגל להחזיק נפח של μl 7. ל 1 גם בחדר זה, להוסיף 7 μl של תאים ההשעיה. עבור תאים Jurkat טי, השתמש 2 X10 7 תאים למ"ל. תאים אלה יגיבו 7 μl של 200 ng / mL SDF-1α מדולל RPMI שלם, שאין לה נסיוב. להשתמש במדיה להשלים לבד כמו המשך שליליתרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בארות נטענים, להציג כל תא של המערך עם מיקרוסקופ הפוכה על מנת להבטיח כי כל בארות נחתכו מלא כמו שצריך. תאים צריך להיות בגבולות הגבול בסדר. אם הם נראים גם בארות, או מתפשטים מעבר לגבול התא טוב, אז הפער נוצר תחת agarose. הערה בארות שנקבעו באופן לא תקין, כפי הנתונים לא ניתן לפרש באופן אמין מן החדרים האלה. </li></ol> 6. איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה של בעל מערך מחדש לחבר את כריות זהב על מערך אלקטרודות על קפיץ סיכות פוגו של בעל ולחץ על "התקנה". בורות המחוברים כראוי יודגשו בצבע ירוק. אם בארות הם אדום, הם לא מחוברים האלקטרודה יש ​​מיקומו של בעל המערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר "8WE1" (8 טוב 1 האלקטרודה) מן התפריט הנפתח בלוח התוכנה כדי לציין את תצורת מערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר "לבדוק" את התוכנה ב contrלוח ol כדי לקבוע את ההתנגדות הראשונית ואת ערכי קיבול עבור כל טוב. ערכי ההתנגדות צריכה להיות בין 1600 ו 2000 אוהם, בעוד שערכי קיבול צריכה להיות בין 5 ל 6 nanofarads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תדרים מרובים כדי למדוד את ההתנגדות בתדרים שונים. יש בחירה אישית של תדרים, או באמצעות סדרה של תדרים המומלצות. תקן מספר רכישה הגדרות תדר ללכוד נתונים על 11 שנקבע מראש תדרים (52.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 16,000, 32,000 ו 64,000 Hz) בשיעור של 8 בארות / דקה. מרווח הזמן בין המדידות יכול גם להיות מותאם אישית. איסוף נתונים תדר מרובים מאפשר ניתוח, קיבול התנגדות עכבה ו. איסוף ערכי ההתנגדות ב 4000 הרץ מספיקה בדרך כלל לחקר יונקים chemotaxis סלולריים, אבל התדרים נוספים עשויים לספק מידע בהקשרים אחרים 12,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך הניסוי סה"כ ניתן לקבוע, על יד ימיןהפאנל, או את הניסוי ניתן לעצור באופן ידני, על ידי לחיצה על "סיום" פעם התאים יצרו התנגדות המעידים על הגעתו האלקטרודה. הזמן שלוקח לתאים להגיע האלקטרודה תלוי בסוג התא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על "התחל" כדי להתחיל באיסוף הנתונים. </li></ol> 7. ניהול נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות הנתונים ניתן לייצא ל-Excel, תוכנת 1600R ECIS, המלווה את מערכת ECISθ היא השיטה היעילה ביותר כדי לנתח נתונים ECIS / מוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת ניתוח הנתונים סרגל הכלים מכיל לחצני הבחירה Z, R, ו-C אלה לקבוע אם, עכבה התנגדות או קיבול, בהתאמה, הוא זמם על הציר האנכי על ציר x (זמן שחלף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ECIS / מוניות הצגת הנתונים בצורה היעילה ביותר כאשר ההתנגדות על פני זמן ב 4000 הרץ. שינויים מהירים התנגדות, או microtransients (איור 1), מעידות על תנועת הסלולר על האלקטרודה. קומפילציה, obinning r נקודות הנתונים, כך שלא כל הנקודות בגרף, לא מומלץ ECIS / מוניות, שכן הוא יהיה microtransients הממוצע מתוך הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגרף נעשה עם תוכנת ECIS1600R, זה יכול להיות מיוצא על ידי בחירת "גרף יצוא" מתפריט קובץ, ונשמר כקובץ. Tif או. בקובץ jpg. </li></ol> 8. נציג תוצאות נייד chemotaxis מותווה על ידי עלייה ההתנגדות ב 4000 הרץ. ההגעה של תאים על האלקטרודה יעד מצוין גם על ידי הופעתו של תנודות מהירים התנגדות בשם microtransients או micromotion כמתואר Opp et. al., 2009 (איור 1) 14. תוצאה שלילית מצוין באמצעות עקבית, או ירידה קלה, ההתנגדות ב 4000 הרץ, כפי שניתן לראות באיור 1 באדום. העדר microtransients הוא גם סימן של היעדרות של תנועת התא כדי האלקטרודה. הגידול ההתנגדות היא Pro ישירותportional לתאי מספר החוצים את האלקטרודה 10. תוספת של נוגדן חד שבטי ספציפי chemoattractant או רעלנים ידוע להפריע מצמידים קולטנים ז חלבון יכול לחסום chemotaxis 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> באיור 1. Chemotaxis של תאים Jurkat האדם טי בתגובה SDF1α. תאים Jurkat האדם טי (2.0x10 6 תאים / מ"ל) נחשפו שיפוע של SDF-1α (החל בריכוז 100 ng / ml) או RPMI 1640 כביקורת שלילית. התנגדות מנורמלת ב 4000 הרץ היה בגרף. אדם Jurkat ותאי T עבר בתגובה SDF-1α, כפי שמעיד הגידול התנגדות microtransients, בעוד שום תנועה נתפס עם חשיפה RPMI 1640. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> איור 2. צפה לראש כ ECIS / מוניות אלקטרודה withouלא agarose. כל אלקטרודה ECIS / מוניות מורכב של 8 תאים בודדים. החדר כל מניות האלקטרודה גדול (א), והוא מכיל אלקטרודה היעד היחיד (ב). כל תא יש גם 2 חוגים זהב (ג), אשר משמשים כמדריך כאשר חיתוך בארות agarose עם cannulae. ריבועי זהב (ד) הם רפידות מגע המתחברים את הסיכות פוגו על מנת להחיל את AC הנוכחי האלקטרודה. האלקטרודות היעד יחידות כל אחד במעגל עם אלקטרודה נגדית גדול (ה). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> איור 3. שתי בארות נחתכים לתוך תא אחד agarose-מלא. כאשר chemoattractant מתווסף 1 טוב זה מפזרת כדי ליצור שיפוע ב agarose, עם הריכוז הגבוה ביותר של chemoattract הקרוב chemoattractant היטב. התאים לטייל מתחת agarose לעבר ריכוזים גבוהים יותר של chemoattractant והוא יכול לעבור את האלקטרודה היעד. כמוהתאים לעבור את האלקטרודה היעד, עלייה של ההתנגדות נרשם על ידי התוכנה ECIS 1600R. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> באיור 4. החדרת cannulae 14 2 מד אל פרספקס. א) ב '5/64 "המקדח משמש כדי לחדד את קצה הצינורית.) שני החורים יש לקדוח לתוך פרספקס כדי להכיל את cannulae 14 מד פי ירה את הפריסה. C) השתמש מקדחה כדי להבטיח את החורים הם בניצב על פני השטח pleixglass. ד ') שני Cannulae חידד מוכנסים דרך ¼ "פרספקס, 2 מ"מ זה מזה (נמדד מן הקצוות הפנימיים). Cannulae אלה חידדו מוכנסים היטב לתוך agarose לחתוך את הבארות. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> איור 5. יישור cannulae עם נקודות זהב בתא ECIS / מוניות. כדי לחתוך בארות, cannulae חידד חייבלהיות מתואם עם נקודות זהב חובקים את האלקטרודה היעד בתחתית תא ECIS / מוניות. Cannulae צריך להיות מוכנס בצורה אנכית, ללא כל תנועה אופקית, והוציאו באותו אופן.

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li>
<li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li>
<li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li>
<li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li>
<li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis%3A+an+evaluation+of+the+cortical+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li>
<li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li>
<li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells%3A+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li>
<li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li>
<li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li>
</ol>

דוד Knecht ומיכאל ליינס יש פטנט על הטכנולוגיה שהונפקו ECIS / מוניות, אשר כפי כבר רישיון אוניברסיטת קונטיקט כדי יישומי לביופיסיקה, Inc

מאפיינים חדשים של assay ECIS / מוניות כוללים את יכולתה להפוך אוסף של נתונים בזמן אמת כמו תאים להגיב chemoattractant. תוך יישום נפוץ ביותר של טכנולוגיה זו היא למדוד תגובות הסלולר הדרגתיים chemotactic בודדים, או הדרגתיים המורכבות תערובות של אגוניסטים chemotaxis ואת היריבים, הגישה ECIS / מוניות גם ניתנות וריאציות על אלו תצורות יכול להיות מועיל למדי הערכת התגובה התאית. אין עדות טובה כי חופפים או הדרגתיים עוקבים יכול להשפיע על התנהגויות הסלולר בדרכים חדשות. יתר על כן, סביר להניח כי אלה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> לביופיסיקה שימושית </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS אלקטרודה מערך </td><td> לביופיסיקה שימושית </td><td> 8W Chemotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarose </td><td> BioWhittaker יישומים מולקולרית </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone בסרום שור עוברית </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> פnicillin / סטרפטומיצין </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> פניצילין 5,000 IU / mL: סטרפטומיצין 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מאגר HEPES </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> פתרון 1M, תרבית תאים כיתה </td></tr><tr><td> 14 מד נירוסטה קנית (2) 4 אינץ&#39; </td><td> אספקת כללי מעבדה </td><td> 5-8365-1 </td><td> בלאנט נקודה </td></tr></tbody></table>

מדידת chemotaxis סלולרי עם ecis / מוניות

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

התנועה נייד בתגובה לגירויים חיצוניים חיונית תהליכים תאיים רבים, כולל ריפוי פצעים, דלקות כתגובה לזיהום. השיטה הנפוצה היא למדוד chemotaxis assay קאמרית בוידן, שבו תאים chemoattractant מופרדים על ידי קרום נקבובי. כמו תאים נודדים דרך הממברנה אל chemoattractant, הם דבקים התחתון של הקרום, או נפילה לתוך התקשורת הבסיסיים, והם מוכתמים מכן וספר חזותית 1. בשיטה זו, התאים נחשפים שיפוע תלול chemoattractant חולף, אשר נחשב ייצוג ירודה של הדרגתיים נמצאו ברקמות 2. עוד מערכת assay, תחת agarose chemotaxis assay, 3, 4 צעדים תנועת התא על פני מצע מוצק בסרט מימית דק שיוצר מתחת לשכבת agarose. שיפוע שמתפתח agarose שטחית נחשב Appropriate ייצוג טבעי הדרגתיים. Chemotaxis ניתן להעריך על ידי הדמיה מיקרוסקופית של המרחק. שניהם assay קאמרית בוידן ו-assay תחת agarose מוגדרים בדרך כלל מבחני נקודות קצה. מערכת אוטומטית ECIS / מוניות משלבת את הגישה מתחת agarose עם החשמל Cell-המצע התנגדות חישה (ECIS) 5, 6. ב assay זה, אלקטרודות היעד נמצאים כל אחד 8 חדרים. גדול נגד האלקטרודה עובר כל אחד 8 חדרים (איור 2). כל חדר מלא agarose ושתי בארות קטנים הם קיצוץ agarose משני צדי האלקטרודה היעד. אחד גם הוא מלא עם האוכלוסייה התא הבדיקה, ואילו השני מחזיק את מקורות chemoattractant לשדר (איור 3). הנוכחי עבר דרך המערכת יכולה לשמש כדי לקבוע את השינוי בהתנגדות המתרחשת כאשר תאים עוברים על האלקטרודה היעד. תאים על היעד electrodדואר להגביר את ההתנגדות של המערכת 6. כמו כן, תנודות מהירים ההתנגדות מייצגים שינוי יחסי הגומלין של התאים עם משטח האלקטרודה מעידים על שינויים מתמשכים צורה סלולריים. מערכת ECIS / מוניות יכולים למדוד את התנועה של האוכלוסייה התא בזמן אמת על פני פרקי זמן ארוכים, אבל גם רגיש מספיק כדי לזהות את בואם של תא בודד על האלקטרודה היעד. Dictyostelium discoidium ידוע להעביר בנוכחות חומצה פולית שיפוע 7, 8 ו chemotactic התגובה שלו ניתן למדוד באופן מדויק על ידי ECIS / 9 מוניות. Chemotaxis ליקוציט, בתגובה SDF1α וגם היריבים chemotaxis יש גם למדוד עם ECIS / 10 מוניות, 11. למשל התגובה ליקוציט כדי SDF1α מוצג באיור 1.

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

תנועה תאית בתגובה לגירויים חיצוניים היא יסודית לתהליכים תאיים רבים, כולל ריפוי פצעים, דלקת והתגובה ל...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד כמוטקסס בבדיקה אוטומטית בזמן אמת, המשתמשת בחיישן עכבה של תשתית תאים חשמלית, או EISs. הדבר מתבצע תחילה על ידי הכנת אלקטרודות axxis באמצעות מילוי של כל תא ב-0.5% agros במצע RPMI מלא. השלב הבא הוא חיתוך בו-זמני של שתי בארות בתוך ה-agros של כל תא באמצעות ג'יג של קנולה במידה 14, ושאיבה של שני פלאגי ה-agros מכל תא.באר אחת ממולאית בתמיסת תאים בודדים, בעוד שהשנייה ממולאית בחומר מושך כימולקטטי (chemo attractant). לאחר מכן, האלקטרודה מחוברת למערכת ISIS theta באמצעות מחזיק המערך המוצב בתוך אינקובטור המכוון לפרמטרים אטמוספריים המתאימים לסוג התאים הנבדקים. לבסוף, ניתן לצפות בכימוטקסיס תאי על ידי מדידת השינוי בהתנגדות בזמן אמת, כאשר התאים מגיעים לאלקטרודת היעד שבין שתי הבארות.היתרון המרכזי של בדיקת ה-axxis על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת תא בוידן (Boyden chamber) או בדיקות תת-אגריות (under agar) קונבנציונליות המבוססות על מיקרוסקופ, הוא שהיא מאפשרת מדידות אוטומטיות של כימותקסיס (chemotaxis) בזמן אמת ללא צורך במניפולציה שוטפת של המערכת. כדי להתחיל בהכנת האלקטרודות, ייצבו את פני השטח של הזהב במערך אלקטרודות ISIS Texas על ידי טיפול מקדים בציסטאין סטרילי בריכוז 10 millimolar במים דאיוניים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים. לאחר הטיפול המקדים, שאבו את תמיסת הציסטאין מכל תא אלקטרודה.שטוף שלוש פעמים במים דה-יוניים סטריליים והחלף ב-250 µL של מצע מלא. לאחר מכן, חבר את מערך האלקטרודות לפיני המגע במחזיק מערך המכשיר כדי לבצע בדיקת אלקטרודות. תאים שמחוברים כראוי יסומנו בירוק על מסך המחשב.אם התאים מודגשים באדום, פירוש הדבר שהם אינם מחוברים, ויש למקם מחדש את האלקטרודה במחזיק המערך כדי ליצור מגעים עבור כל התאים. לאחר שכל התאים מחוברים, לחצו על כפתור הבדיקה בבקר התוכנה של ISYS Theta כדי לקבוע את ערכי ההתנגדות והקיבול הראשוניים עבור כל תא; ערכי ההתנגדות צריכים להיות בין 1600 ל-2000 ohms וערכי הקיבול צריכים להיות בין חמישה לשישה nanos עבור מערך של שמונה תאים. אם תא בודד אינו נמצא בטווח פרמטרים מקובל זה, אין להשתמש בו לאיסוף נתונים.בשלב הבא, נתקו את האלקטרודה מתושבת המערך כדי להכין את תאי ה-aros האינדיבידואליים. שאבו את המצע מהתאים ושטפו כל תא שלוש פעמים במים דה-יונזים סטריליים. כדי להתחיל בהכנת תאי ה-aros, הכינו תמיסת aros המכילה מצע RPMI כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.טפטפו 300 µL של מצע agros מומס לכל תא, וטפטפו את ה-agros שנותר למכסה של מבחנה בנפח 15 mL. כדי להעריך את התגבשות ה-agros, החזירו את כיסוי מערך ה-ISIS axxis והמתינו לגבש בטמפרטורת החדר כדי לבנות את הקנולה הרב-פעמית. השחיזו בעזרת כלי חיתוך באריים שתי קנולות בעלות קצה קהה במידה 14 gauge.בעזרת מקדח של 5/64 אינץ', סובבו את קצה המקדח בתוך כל פתח של הקנולה באמצעות מקדחה במהירות נמוכה, תוך וידוא שהמקדח חותך את כל הקצה הפנימי של כל פתח קנולה. כדי ליצור קצה חיתוך חד, קדחו שני חורים בפרספלקס בעזרת מקדח של 5/64 אינץ'. בעזרת מקדחה שולחנית, הכניסו כל קנולה במידה 14 שחודדה לאחד מהחורים, כך שכל אחת מהן תבלוט למרחק שווה מהפרספלקס.סטריליזציה של כלי הקנולה בכילייב 14 תתבצע על ידי שריפה קלה של קצוות הקנולה לפני חיתוך הבארים בתא ה-EIS. יש לצנן את הקנולה על ידי נגיעה באגרוס שבפקק של מבחנה בנפח 15 מיליליטר. אם טמפרטורת הקנולה לא תירד, האגרוס יימס במהלך חיתוך בארי התא, מה שיהפוך את הבארים למעוותות ופגומות.חיתוך הבארות מבלי לפגוע בשלמות ה-agros הוא ההיבט המאתגר ביותר בפרוצדורה זו. הדבר מחייב יישור מדויק של הקנולה ולחץ ואקום נמוך מאוד. יישרו את זוג הקנולות מעל שתי הנקודות הזהובות המקיפות את האלקטרודה המטרה בכל תא.החדירו את הקנולה בצורה אנכית ללא תנועה אופקית, ועצרו עם מגע עדין בין הקנולה לפני השטח של האלקטרודה. הוציאו בזהירות את הקנולה שוב ללא תנועה אופקית, באמצעות פיפטת פסטור סטרילית באורך חמישה אינץ' המחוברת ללחץ ואקום נמוך עם מלכודת ואקום. כדי לאסוף את פסולת ה-agros, שאבו בעדינות את פפקי ה-aros שנותרו על ידי כלי הקנולה.לאחר מכן, הוסף 300 µL של מצע RPMI מלא לפני השטח של כל תא בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות כדי להרוות את ה-aros. לאחר שתי דקות, שאב בעדינות את המצע מהפני השטח ומהבארות מבלי להפריע ל-aros. כל בארה מסוגלת להכיל נפח של 7 µL, כך שבכל תא תהיה בארה אחת עם 7 µL של תרחיף תאים.בהדגמה זו, נעשה שימוש בתאי jca T בריכוז של 2*10⁷ תאים למיליליטר. לאחר מכן, טענו 7 µL של חומר מושך כימואטקטי לבאר השנייה של התאים. עבור תאי JCA T, השתמשו ב-200 ng/mL של sdf one alpha המדולל במדיום לא מלא.RPMI משמש כחומר מושך כימי עבור טעינה של ביקורת שלילית. שבעה מיקרוליטרים של מצע גידול מלא בלבד לתוך הבאר השנייה. לאחר טעינת הבארות, יש לבחון כל תא של המערך באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שכל הבארות נחתכו ומולאו כראוי.על התאים להימצא בתוך גבולות הבארות. אם נצפים תאים בשתי הבארות או שהם מתפשטים מעבר לגבול בארת התאים, פירוש הדבר שנוצר מרווח מתחת ל-aros. שימו לב כי נתונים מבארות שלא הוכנו כראוי אינם ניתנים לפירוש מהימן.כדי להתחיל באיסוף הנתונים, הניחו את האלקטרודה במחזיק המערך. חברו מחדש את רפידות הזהב במערך האלקטרודות לפיני הפוגו (pogo pins) בעלי הקפיצים של המחזיק, ולחצו על setup בתוכנת ISIS theta. הבארות שחווברו כראוי יסומנו בירוק.אם הבאריים אדומים, פירוש הדבר שהם אינם מחוברים, ויש למקם מחדש את האלקטרודה במחזיק המערך באמצעות התפריט הנפתח. בלוח התוכנה, בחרו eight W one semicolon. דבר זה מצביע על תצורת המערך.Eight.בפאנל הבקרה של התוכנה, בחרו אלקטרודה אחת בבאר וסמנו "בדיקה" (check) כדי לקבוע את ערכי ההתנגדות והקיבול הראשוניים. עבור כל באר, בחרו מספר תדרים כדי למדוד את ההתנגדות במספר תדרים שונים. איסוף נתונים ממספר תדרים מאפשר ניתוח של הקיבול, העכבה וההתנגדות.ניתן לבחור בין התאמה אישית של התדרים לבין שימוש בסט של תדרים מומלצים. הגדרות רכישת התדרים המרובים הסטנדרטיות יסספו נתונים ב-11 תדרים קבועים מראש בקצב של שמונה בארות לדקה. ניתן להגדיר באופן מותאם אישית גם את מרווח הזמן בין המדידות.ניתן להגדיר את משך הניסוי הכולל בלוח הבקרה הימני. לחלופין, ניתן להפסיק את הניסוי באופן ידני על ידי לחיצה על finish. ברגע שהתאים יפיקו התנגדות המעידה על הגעתם לאלקטרודה, לחץ על start כדי להתחיל באיסוף הנתונים.למרות שניתן לייצא את הנתונים ל-excel, התוכנה EISs 1600 R הנלווית למערכת EISs theta היא השיטה היעילה ביותר לניתוח נתוני EISs taxes. סרגל כלי ניתוח הנתונים של התוכנה מכיל את כפתורי הבחירה Z, R ו-C. אלו קובעים האם עכבה, התנגדות או קיבוליות, בהתאמה, יופיעו על הציר האנכי מול הציר ה-X, המייצג את הזמן שחלף. נתוני EISs taxes מוצגים בצורה היעילה ביותר כהתנגדות לאורך זמן בתדר של 4,000 hertz.תנודות מהירות בהתנגדות או תופעות זמניות קצרות (micro transients) הן עדות לתנועה תאית על פני האלקטרודה המגבילה או מכופפת את נקודות הנתונים, כך שלא כל הנקודות נרשמות. שימוש בציר סיגמואידי (s-axis) אינו מומלץ כיוון שהוא יבצע מיצוע של התופעות הזמניות הקצרות מתוך הנתונים. לאחר יצירת הגרף, ניתן לייצא אותו באמצעות תוכנת ISIS 1600 R על ידי בחירה ב-"export graph" מתפריט הקבצים (file menu) ושמירתו כקובץ JPEG או קובץ תמונה.תאי T מסוג J CAT אנושיים נחשפו למדרג של SDF one alpha כדי לעורר תנועה, או ל-RPMI 1640 כביקורת שלילית. ההתנגדות הנורמלית ב-4,000 hertz מוצגת כאן. כימוטקסיס תאי מודגם על ידי עלייה בהתנגדות ב-4,000 hertz בעוד תאי T מסוג J CAT אנושיים נעים בתגובה ל-SDF one alpha.הגעתם של תאים לאלקטרודת המטרה מודגשת על ידי הופעת תנודות מהירות בהתנגדות הנקראות מיקרו-טרנזיאנטים (micro transients). העלייה בהתנגדות פרופורציונלית למספר התאים החוצים את האלקטרודה. תוצאה שלילית מתאפיינת בהתנגדות יציבה או בירידה קלה בהתנגדות בתדר של 4,000 hertz.דבר זה נצפה כאשר התאים נחשפו ל-RPMI 1640. היעדר מיקרו-טרנסיאנט (micro transient) הוא סימן נוסף להיעדר תנועה של תאים באלקטרודה. בנוסף להליך בסיסי זה, ניתן לבצע התאמות נוספות כדי להשתמש ב-Esys, Texas למעקב אחר תנועה תאית בנוכחות נוגדנים מונוקלונליים ספציפיים לחומר מושך כימי (chemo attractant), משנים פרמצבטיים או רעלים.

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

סרטון זה מציג כימוטקסיס בנמטודה C. elegans ומציג פרוטוקול לדוגמה הבודק סלידה כימוטקטית מנחושת גופרתית.

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

מוצג כאן הוא הפרוטוקול עבור סיסאי chemotaxis סיטו, מכשיר מיקרופלויד שפותח לאחרונה המאפשר מחקרים של התנהגות מיקרוביאלית ישירות בסביבה.

ב סיטו Chemotaxis אסאי לבחון התנהגות מיקרוביאלית במערכות אקולוגיות מימיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת למידה אסוציאטיבית על ידי ביצוע התניה קלאסית באורגניזם המודל C. elegans. הפרדיגמה מבוססת על זיווג ריכוז המלח בסביבה עם נוכחות או היעדר מזון, מה שמשנה את הכימוטקסיס שלהם לכיוון המלח או הרחק ממנו.

מדידת למידה אסוציאטיבית בכימוטקסיס של הנמטודה Caenorhabditis elegans

מחקרים Chemotaxis חיידקית שימוש מיקרופלואידיקה - ראיון

למד מדידת כימוטקסיס תאי בזמן אמת באמצעות מערכת ECIS/Taxis. השיטה מנצלת חיישני עכבה חשמליים לעקוב אחרי תנועת תאים לכיוון אלקטרודת היעד דרך שכבת אגרוז.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

גלה סרטונים נוספים