Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוציה גבוהה של כל המוח של עכבר מביע YFP.

מיקרוסקופיה מולטיפוטונית של רקמה קבועה מוגבלת בדרך כלל לעומקי חדירה רדודים של כמה מאות מיקרונים בלבד. לאחרונה הדגמנו את השימוש הראשון במיקרוסקופיה מולטיפוטונית בעומק של כמה מילימטרים לאיברי עכבר קבועים באמצעות ניקוי אופטי עם תמיסה של אלכוהול בנזו ובנזואיל בנזואט. ההדגמה הראשונית שלנו, הטכניקה דימתה פלואורסצנטיות של רקמות פנימיות.

עם זאת, יש עניין הולך וגובר בשימוש בשיטות ניקוי אופטי עם רקמות המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP. כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופיה מולטיפוטונית של רקמת מוח מנוקה עם אותה תמיסת אלכוהול בנזו המשמרת את הקרינה של חלבון פלואורסצנטי צהוב המתבטא בירך. מקדם אחד במוח העכבר הדמיית איבר שלם ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון מתאפשרת על ידי ניקוי אופטי של האיבר לפני הדמיה ללא ניקוי. מולטיפוטון.

הדמיה של המוח מוגבלת ל-300 מיקרון מתחת לפני השטח של הרקמה עקב השפעות פיזור הדגשות הנוצרות על ידי ההבדלים במדדי השבירה של מים וחלבונים המרכיבים את רקמת המוח. כדי להתגבר על מגבלה זו, האיבר מיובש והמים מוחלפים בנוזל בעל מקדם שבירה דומה לחלבונים המרכיבים את הרקמה. תהליך זה של ניקוי אופטי עוזר להפחית מאוד את פיזור האור כדי להציע הדמיה טובה יותר מתחת לפני השטח של הרקמה.

תמונות מבאטה ואחרים מדגימות כיצד ניתן ליישם טכניקה זו כדי להציג את ההיסטולוגיה של איברי עכבר שונים באמצעות פלואורסצנציה פנימית ודור הרמוני שני. תמונה ראשונה זו היא של אשך העכבר, שצולם 1.4 מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה. תכונת הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופיה מרובת פוטונים מאפשרת לנו להתקרב ולקבל מבט ברור על תאי הזרע הבודדים הנוצרים בצינורות הזרע.

כפי שניתן לראות בקצה הימני כאן, אנו מראים תמונה של ריאת העכבר, שגם היא צולמה 1.4 מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה. תמונה זו היא הדגמה של הדמיה רב-פוטונית דו-ערוצית שבה רכיבי האלסטין מסומנים באדום בעוד הקולגן מסומן בירוק, ניתן להבחין בקלות ב-oli בודדים. לבסוף, אנו מראים תמונות ברזולוציה גבוהה של האזורים הפנימיים של מוח העכבר שלוקחים 850 מיקרון מתחת לפני השטח של הרקמה על ידי התקרבות לניאו-קורטקס וההיפוקמפוס של המוח, ניתן לראות בבירור אסטרוציטים בודדים וגופי תאי עצב.

עם זאת, כאשר איברים מנוקים אופטית שיכולים להכיל חלבונים פלואורסצנטיים כגון YFP, פרוטוקול הניקוי האופטי של badra כלל אינו משמר את האות הפלואורסצנטי של חלבונים פלואורסצנטיים אלה. הפרוטוקול המוצג כאן הוא דרך חדשה לבצע ניקוי אופטי של איבר שלם והדמיה של נקע עכבר תוך שמירה על האות הפלואורסצנטי של YFP ונוירונים המייבשים את המוח באמצעות סדרה מדורגת אתנול וניקוי עם תמיסה אחת או שתיים של בנזו אלכוהול בנזואט, הידוע גם בשם BAB נמצא כמפחית את הנזק לחלבונים הפלואורסצנטיים ושומר על האות הפלואורסצנטי שלהם. לצורך הדמיה מרובת פוטונים, עכברי YFP נשקלים תחילה ולאחר מכן מורדמים בהזרקה תוך-צפקית של קטמין קסילזין.

יש לאשר לוחית הרדמה כירורגית לפני שתמשיך לניתוח. יש לבדוק את החיה כל חמש דקות כדי לראות אם היא מגיבה לצביטה מוצקה בבוהן או בזנב. אם בעל החיים מגיב, נדרשת מנה משלימה של קטמין קסילזין.

לאחר ההרדמה, העכברים נשארים על ידי הדבקת כל איבר למיטת ניתוח באמצעות סרט מעבדה כך שהעכבר נמצא במצב שכיבה וחושף את חזהו לניתוח כדי להתחיל, נעשה חתך מתחת לתהליך ה-xiphoid על מנת לבצע חתך לאורך בסיס כלוב הצלעות באמצעות מספריים ופינצטה כדי למשוך את העור לאחור בזמן ביצוע החיתוך, לאחר מכן מורכבים שני חתכים משני צידי עצם החזה של העכבר כדי ליצור דש של רקמה המוחזק הרחק מחלל החזה באמצעות המוסטט כדי להשאיר את הלב חשוף. לאחר מכן, מחט בקוטר 23 מוחדרת לחדר השמאלי של הלב, ומבצעים חתך קטן בדופן השריר של הפרוזדור הימני כדי לאפשר לדם לברוח. מיד לאחר חיתוך הפרוזדור הימני, מתחיל זלוף עם ארבע מעלות צלזיוס פוספט מלוחים עד שלא מתנקז יותר דם מהאטריום הימני.

במהלך הזלוף, נעשה שימוש במשאבה אפיסטולית ומכוונת לעוצמת שאיבה הפולטת נוזל במרחק של 1.5 עד שני סנטימטרים מקצה המחט. לאחר ניקוז כל הדם, מדיום הזלוף מועבר לתמיסת אלדהיד פרפורמית של 4% בארבע מעלות צלזיוס עד שגוף העכבר הופך נוקשה ונוקשה באופן ניכר. לאחר הזלוף, העכבר מוציא ממיטת הניתוח ועורף את ראשו כדי להתחיל בכריתת המוח באמצעות מלקחיים ומספריים לקשתית.

הגולגולת מוסרת בחלקים קטנים המתחילים מהחלק האחורי של הגולגולת ומתקדמים. חתכים קטנים נעשים כל שניים עד ארבעה מילימטרים עם המספריים על פני הגולגולת ואילו המלקחיים משמשים למשיכת העצם בזהירות מהמוח בחלקים קטנים, זה נעשה עד שכל המשטח העליון של המוח נחשף. לאחר מכן מוציאים את המוח מהגולגולת באמצעות מרית כירורגית ומניחים אותו לקחת בקבוקון זכוכית של 4% אלדהיד פרפורם לקיבוע למשך שש שעות.

בעוד שאנו מתמקדים בעיקר בהדמיה של מוח עכבר המבטא YFP עבור הדגמה זו, אנו גם ננקה אופטית עכבר, רגל אחורית וחתך מעי דק כדי להראות בצורה הטובה ביותר את יכולות הניקוי של הליך זה. לאחר הקיבוע, המוח ורקמות אחרות נשטפים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן דגימות הרקמה מיובשות בטמפרטורת החדר על ידי סדרה של דגירות אתנול בריכוזים של 50%70%90% ו-100% אתנול.

כל דגירה נמשכת שעתיים ולאחר מכן שנייה. דגירה של 100% אתנול של 12 שעות מתבצעת כדי לחלץ ביעילות את המים מהרקמה הקבועה. לאחר ההתייבשות, תמיסת האתנול האחרונה של 100% נשפכת החוצה ודגימות הרקמה טובלות בתמיסה אחד לאחד של אתנול ל-BAB למשך שעתיים לפני שהן טובלות בתמיסת ניקוי 100% BAB.

ברגע שנכנסים ל-bab, דגימות המוח ורקמות אחרות יהפכו לשקופות באופן ניכר תוך ארבע עד חמש שעות. כאן אנו מציגים סרטון דולג זמן של שש השעות הראשונות של תהליך הקלירינג האופטי. הדילוג מסמן את הזמן שבו הפתרון אחד לאחד של אתנול ל-BAB הוחלף בתמיסת 100% BAB.

בתום שש שעות, כל האיברים מראים סימני שקיפות, למשל, העצם ברגל האחורית של העכבר נראית כעת בבירור לתוצאות הניקוי הטובות ביותר. יש להשאיר את המוח להתנקות במשך שישה ימים בטמפרטורת החדר כשהוא מוגן מאור בהיר. לאחר שהמוח מתנקה ומוכן להדמיה, הוא מודבק לתחתית צלחת הפטרי שלך באמצעות אקריליק סנו או דבק סופר.

לאחר שהדבק מתייבש, המוח יוצא ב-BAB וצלחת הפטרי מונחת תחת המטרה להדמיה. לצורך הדמיה, אנו משתמשים במיקרוסקופ רב-פוטוני המשלב לייזר ספיר טיטניום קשירה MI המתכוונן בין אורך גל עירור של 710 עד 990 ננומטר. אורך גל העירור שאנו משתמשים בו ליצירת אותות YFP הוא 886 ננומטר.

לאחר מכן, האות הפלואורסצנטי הרפלקטיבי נלכד באמצעות סמל NIK פי חמישה אובייקט המאפשר הדמיית שדה ראייה גדול. האות הפלואורסצנטי הרפלקטיבי מסונן באמצעות מסנן מעבר של 5 35 50 פס ונאסף באמצעות תיקיית יעילות קוונטית גבוהה. מכפיל שניים מתמונות OMA Matsu מעובד באמצעות תוכנת סריקת תמונה ברזולוציה של 2048 על 2048 פיקסלים באמצעות קצב סריקה של שתי אלפיות השנייה לשורה כדי ליצור תמונות YFP ברזולוציה גבוהה.

לאחר השלמת ההדמיה, המוח מוסר מצלחת P 2 ומאוחסן ב-BAB ומוגן מפני אור להדמיה עתידית. התמונות והסרטונים המייצגים המוצגים כאן מדגימים את יכולת ההדמיה הרב-פוטונית ברזולוציה גבוהה המתאפשרת על ידי ניקוי אופטי. הדמיית מוח שלמה מאפשרת לנוירונים של תווית YFP בשכבות השונות של ההיפוקמפוס והניאו-קורטקס להיראות בבירור עד לעומק של שני מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה.

כאן אנו מראים סרטון של ערימת תמונות בגודל 1.2 מילימטר של נקע בכל הפה, שצולמה 0.8 עד שני מילימטרים לתוך המוח כדי לחשוף את השכבות האנטומיות השונות של ההיפוקמפוס. להלן תמונה מייצגת של חתך עטרה בגודל 1.94 מילימטר שנקרא לברגמן שנלקח מהתמונה בעומק שני מילימטרים שתקועה בה סומנו השכבות השונות של ההיפוקמפוס. על ידי התקרבות לניאו-קורטקס, ניתן להבחין בבירור בין האקסונים הבודדים וגופי תאי העצב של שכבה חמש של הניאו-קורטקס עד 1.02 מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה.

כאן אנו מראים תמונה תקועה של נוירונים בשכבה חמש שצולמו בין 700 ל-1020 מיקרון מתחת לפני השטח של הרקמה. להלן תמונה מייצגת מאותה ערימה שנלקחה 774 מיקרון לתוך המוח. באמצעות אותה ערימת תמונות, בוצע שחזור תלת מימדי של אזור הנוירון באמצעות תוכנת Image J.

יכולת הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופיה מרובת בוטים מאפשרת לנו גם להציג תמונות של נוירונים בודדים שלמים. כאן אנו מראים שחזור של נוירון שכבה חמש של הניאו-קורטקס בו נראים בבירור תהליכים גנטיים D. זה מסכם את המצגת שלנו של ניקוי אופטי, נקע עכבר שלם המבטא YFP.

ביצוע טכניקה זו הוא פשוט יחסית וכפי שהראנו, ניתן להשתמש בו כדי להציג ולצלם אזורים ומבנים רבים ושונים של נקע העכבר. תודה על הצפייה ובהצלחה.