Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

מיקרוסקופיה רב-פוטונית של רקמה מקובעת מוגבלת בדרך כלל לעומקי חדירה רדודים של כמה מאות מיקרון בלבד. לאחרונה הדגמנו את השימוש הראשון במיקרוסקופיה רב-פוטונית בעומק של מספר מילימטרים בתוך איברי עכבר מקובעים, תוך שימוש בהבהרה אופטית עם תמיסה של benzo alcohol ו-benzoyl benzoate. בהדגמה הראשונית שלנו, הטכניקה דיגמה פלואורסצנציה טבעית של הרקמה.

עם זאת, קיים עניין גובר בשימוש בשיטות להבהרה אופטית (optical clearing) ברקמות המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP. כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופיה רב-פוטונית של רקמת מוח מבהירה, תוך שימוש באותו תמיסת benzo alcohol השומרת על הפלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי צהוב המבוטא על ידי הירך. מקדם אחד במוח עכבר. הדמיה ברזולוציה גבוהה של איבר שלם של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית מתאפשרת על ידי הבהרה אופטית של האיבר לפני ההדמיה ללא הבהרה. Multiphoton.

דימות של המוח מוגבל לעומק של 300 מיקרון מתחת לפני השטח של הרקמה, וזאת בשל השפעות של פיזור אור הנובעות מההבדלים במדדי השבירה של המים והחלבונים המרכיבים את רקמת המוח. כדי להתגבר על מגבלה זו, האיבר עובר התייבשות והמים מוחלפים בנוזל בעל מדד שבירה דומה לזה של החלבונים המרכיבים את הרקמה. תהליך זה של הבהרה אופטית (optical clearing) מסייע להפחית משמעותית את פיזור האור, ובכך מאפשר דימות טוב יותר בעומקים רבים יותר מתחת לפני השטח של הרקמה.

תמונות מתוך מחקרם של Batta et al מדגימות כיצד ניתן ליישם טכניקה זו לצפייה בהיסטולוגיה של איברים שונים בעכבר באמצעות פלואורסצנציה פנימית ויצירת הרמוניקה שנייה. תמונה ראשונה זו היא של אשכים של עכבר, שצולמה בעומק של 1.4 millimeters מתחת לפני השטח של הרקמה. תכונת הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופיית פוטונים מרובים מאפשרת לנו לבצע זום ולקבל מבט ברור על תאי זרע בודדים המתגבשים בתוך הפרוביולי seminiferous tubulars.

כפי שניתן לראות כאן בצד ימין, אנו מציגים תמונה של ריאת עכבר, שצולמה אף היא בעומק של 1.4 מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה. תמונה זו מהווה הדגמה של דימיוג מולטי-פוטון בערוצים כפולים, שבה רכיבי האלאסטין מסומנים באדום והקולגן מסומן בירוק; בהגדלה, ניתן להבחין בקלות בסיבים בודדים. לבסוף, אנו מציגים תמונות ברזולוציה גבוהה של האזורים הפנימיים של מוח העכבר, שצולמו בעומק של 850 מיקרון מתחת לפני השטח של הרקמה. באמצעות הגדלה של הנאוקורטקס וההיפוקמפוס במוח, ניתן לראות בבירור אסטרוציטים בודדים וגופי תאי עצב.

עם זאת, כאשר מנקים אופטית איברים העשויים להכיל חלבונים פלואורסצנטיים כגון YFP, פרוטוקול הניקוי האופטי של badra כלל לא משמר את האות הפלואורסצנטי של חלבונים אלו. הפרוטוקול המוצג כאן הוא דרך חדשנית לביצוע ניקוי אופטי והדמיה של איבר שלם של מוח עכבר תוך שימור האות הפלואורסצנטי של YFP ובנוירונים; נמצא כי ייבוש המוח באמצעות סדרה מדורגת של אתנול וניקוי עם תמיסה של 1:2 של benzo alcohol benzoate, הידועה גם כ-BAB, מפחית את הנזק לחלבונים הפלואורסצנטיים ומשמר את אותם. לצורך הדמיה רב-פוטונית, עכברי YFP נשקלים תחילה ולאחר מכן הרדמתיים באמצעות הזרקה תוך-peritoneale של ketamine xylazine.

יש לוודא את מישור ההרדמה לפני תחילת הניתוח. יש לבדוק את בעל החיים בכל חמש דקות כדי לראות אם הוא מגיב ללחיצה חזקה על בהו הבוהן או על הזנב. אם בעל החיים מגיב, נדרש מנה משלימה של ketamine xylazine.

לאחר ההרדמה, העכברים מקובעים על מיטת ניתוח על ידי הדבקת כל גפה באמצעות סרט הדבקה למעבדה, כך שהעכבר נמצא בתנוחה גבנית החושפת את בית החזה לניתוח. לתחילת הפעולה, מבוצע חתך מתחת לתהליך החרב (xiphoid process) כדי לבצע חיתוך לאורך בסיס כלוב הצלעות, תוך שימוש במספריים ופינצטה להרחקת העור בזמן ביצוע החיתוך; לאחר מכן מבוצעים שני חתכים משני צידי העצם הסטרנום (sternum) של העכבר כדי ליצור כיס רקמה המוחזק הרחק מחלל החזה באמצעות המוסטט, כך שהלב נשאר חשוף. לאחר מכן, מחט בכילור 23 מוחדרת לחדר השמאלי של הלב, וביצוע חתך קטן בדופן השריר של העלייה הימנית מאפשר לדם לצאת. מיד לאחר חיתוך העלייה הימנית, מתחילה פרפוזיה עם phosphate buffered saline בטמפרטורה של 4 °C עד שאין דם נוסף שמתנקז מהעלייה הימנית.

במהלך הפרפוזיה, נעשה שימוש במשאבה סיסטולית המכוונת לעוצמת דחיפה השולחת את הנוזל למרחק של 1.5 עד שני אינצ'ים מקצה המחט. לאחר ניקוז כל הדם, מחליפים את חומר הפרפוזיה לתמיסת פאראפורמאלדהיד 4% בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, עד שגוף העכבר הופך לקשיח ונוקשה באופן ניכר. לאחר הפרפוזיה, מוציאים את העכבר משולחן הניתוח ומבצעים עקירה של הראש כדי להתחיל בחילוץ המוח באמצעות פינצטה ומספרי איריס.

את הגולגולת מסירים בחלקים קטנים, החל מהחלק האחורי של הגולגולת והתקדמות קדימה. מבצעים חיתוכים קטנים בכל שני עד ארבעה מילימטרים בעזרת מספריים לרוחב הגולגולת, בעוד שבאמצעות פינצטה מושכים בזהירות את העצם הרחק מהמוח בחלקים קטנים; פעולה זו חוזרת עד שכל השטח העליון של המוח נחשף. לאחר מכן מוציאים את המוח מהגולגולת באמצעות שפכטל כירורגי ומעבירים אותו למבחנה מזכוכית עם 4%paraform aldehyde לקיבוע למשך שש שעות.

בעוד שבדגמה זו אנו מתמקדים בעיקר בדימות של מוח עכבר המבטא YFP, נבצע שקיפות אופטית גם לרגל אחורית של עכבר ולסגמנט של מעי דק, כדי להדגים בצורה המיטבית את יכולות השקיפות של פרוצדורה זו. לאחר קיבוע משני, המוח ורקמות נוספות נשטפים פעמיים ב-PBS. דגימות הרקמה עוברות לאחר מכן דהידרציה בטמפרטורת החדר באמצעות סדרת דגירה באתנול בריכוזים של 50%, 70%, 90% ו-100% אתנול.

כל דגירה נמשכת שעתיים, ולאחר מכן מבוצעת דגירה שנייה ב-100% ethanol למשך 12 שעות כדי להוציא ביעילות את המים מהרקמה המקובעת. לאחר הדהידרציה, שופכים החוצה את תמיסת ה-100% ethanol האחרונה וטובלים את דגימות הרקמה בתמיסה של יחס אחד-לאחד של ethanol ל-BAB למשך שעתיים, לפני הטבילה בתמיסת הבהרה של 100% BAB.

לאחר ההעברה ל-bab, המוח ודגימות רקמה אחרות יהפכו לשקופים באופן ניכר בתוך ארבע עד חמש שעות. כאן אנו מציגים סרטון time-lapse של שש השעות הראשונות של תהליך ההבהרה האופטית. הדילוג מסמן את הזמן שבו התמיסה של ethanol ל-BAB ביחס של אחד-לאחד הוחלפה בתמיסת 100%BAB.

בסיום שש שעות, כל האיברים מראים סימני שקיפות; לדוגמה, העצם ברגל האחורית של העכבר נראית כעת בבירור עבור תוצאות שקיפות מיטביות. יש להשאיר את המוח להשקיף במשך שישה ימים בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור חזק. ברגע שהמוח שקוף ומוכן לדימיון, הוא מקובע לתחתית פטריית הפטרי באמצעות דבק אקרילי מסוג Sano או דבק מהיר.

לאחר ייבוש הדבק, המוח מושרה ב-BAB והצלחת פטרי מונחת תחת העדשה לצורך דימות. לדימות אנו משתמשים במיקרוסקופ רב-פוטוני הכולל לייזר טיטניום-ספיר של חברת MI tie, הניתן לכיוונון בין 710 ל-990 ננומטר של אורך גל עירור. אורך גל העירור שבו אנו משתמשים ליצירת אותות YFP הוא 886 ננומטר.

לאחר מכן, האות הפלואורסצנטי השומח נלכד באמצעות עדשה אובייקטיבית NIK icon 5x המאפשרת דימוג של שדה ראייה רחב. האות הפלואורסצנטי השומח מסונן באמצעות מסנן band pass 5 35 50 ונאסף באמצעות מכפיל פוטונים בעל נצילות קוונטית גבוהה. התמונות מ-OMA Matsu מעובדות באמצעות תוכנת scan image ברזולוציה של 2048 על 2048 פיקסלים, בקצב סריקה של 2 מילישניות לשורה, כדי להפיק תמונות YFP ברזולוציה גבוהה.

עם השלמת הדימוי, המוצא את המוח מתוך צלחת ה-P two ומאחסים אותו ב-BAB תוך הגנה מאור לצורך דימויים עתידיים. התמונות והסרטונים המייצגים המוצגים כאן מדגימים את יכולת הדימוי הרב-פוטוני ברזולוציה גבוהה שהתאפשרה הודות להבהרה אופטית (optical clearing). דימוי של המוח השלם מאפשר לראות בבירור נוירונים המסומנים ב-YFP בשכבות השונות של ההיפוקמפוס והניאוקורטקס בעומק של עד שני מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה.

כאן אנו מציגים סרטון של ערימת תמונות בעובי 1.2 מילימטר של נתח מוח שלם, שנלקחה בעומק של 0.8 עד שני מילימטרים לתוך המוח כדי לחשוף את השכבות האנטומיות השונות של ההיפוקמפוס. להלן תמונה מייצגת של חיתוך קורונלי ברוחב 1.94 מילימטרים שחולץ מערימת התמונות בעומק שני מילימטרים, שבה סומנו השכבות השונות של ההיפוקמפוס. באמצעות הגדלה של הנאוקורטקס, ניתן להבחין בבירור באקסונים בודדים ובגופי תאי עצב של נוירונים פירמידליים בשכבה חמישה של הנאוקורטקס, עד לעומק של 1.02 מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה.

כאן אנו מציגים סדרת תמונות (stack) של נוירונים משכבה חמישית, שצולמה בעומק של 700 עד 1020 מיקרון מתחת לפני השטח של הרקמה. התמונה הבאה היא תמונה מייצגת מאותה סדרה, שצולמה בעומק של 774 מיקרון בתוך המוח. באמצעות אותה סדרת תמונות, בוצע שחזור תלת-ממדי של אזור הנוירונים באמצעות תוכנת Image J.

היכולת של רזולוציה גבוהה במיקרוסקופיית multi bot מאפשרת לנו להציג גם תמונות של נוירונים בודדים שלמים. כאן אנו מראים שחזור של נוירון משכבה חמישה של הנאוקורטקס, שבו תהליכים גנטיים של D נראים בבירור. בכך מסתיימת הצגתנו על הבהרה אופטית של מוח עכבר שלם המבטא YFP.

ביצוע טכניקה זו הוא פשוט יחסית, וכפי שהראינו, ניתן להשתמש בה כדי לצפות ולדגום אזורים ומבנים שונים רבים של המוח של העכבר. תודה שצפיתם ובהצלחה.