Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK
24 באפריל 2012
בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר K + (GIRK) ערוצים מתואר. Assay מנצל פוטנציאל רגישות קרום צבעי ניאון כדי למדוד פעילות GIRK הערוץ. טכניקה זו ניתנת להתאמה לשימוש על מספר שורות תאים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תרופות חדשות המווסתות תעלות grk. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של תאי A TT 20 בצלחת 96 הבאר. השלב השני הוא דילול תרכובות הבדיקה באמצעות מערכת הטיפול בלוחות הנוזלים של Verset.
לאחר מכן, תרכובות הבדיקה המדוללות מוחלות על התאים באמצעות הפסוק. השלב האחרון הוא להכניס את צלחת 96 הבארות לתוך קורא הלוחות הפלואורסצנטיים של Synergy, ולהזריק את תמיסות הבקרה והסומטוסטטין לבארות. בסופו של דבר, קורא הלוחות הפלואורסצנטיים משמש להצגת התרכובות המשנות את האות הפלואורסצנטי המושרה על ידי סומטוסטטין ובכך מווסתות את תעלות ה-Grk.
היתרון של הליך זה על פני שיטות קיימות כגון הקלטת מהדק תיקון, הוא שניתן לסנן במהירות מספר רב של תרכובות כדי לקבוע אם הן מווסתות ערוצי גרק. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בכאב מכיוון שניתן לזהות תרכובות המפעילות את תעלת Gerk, המובילות לעיכוב העברת FI nociceptive. 96 לוחות הבאר וציפוי התאים הוא מריבל ואסקז.
סטודנט במעבדה שלי התחל הליך זה על ידי גידול תאי יותרת המוח A TT 20 ב-DMEM בתוספת סרום סוס 10% ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2. שמור על התרבית על ידי תת-תרבית התאים כל חמישה עד שבעה ימים באמצעות הליך איזציה סטנדרטי. לאחר מכן מצפים את בארות הצלול השחור.
צלחת 96 באר תחתונה עם 50 מיקרוליטר פולי ליזין. הניחו לבארות להתייבש במשך 30 דקות בחממה. לאחר מכן הסר עודף צלחת פולי L ליזין את התאים בצלחת 96 הבאר המכילה 200 מיקרוליטר מדיה בצפיפות של 30,000 תאים לבאר.
לאחר מכן יש לאחסן את התאים בחממה למשך שלושה עד ארבעה ימים. השתמש במערך שאיפה כדי לשאוב לאט את מדיום התרבות מהתא חד-שכבתי, ולאחר מכן שטוף את התאים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת חיץ רגילה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת חיץ המכילה את הצבע הרגיש הפוטנציאלי של הממברנה לכל אחד.
ובכן דגרו על התאים למשך 40 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 40 דקות, הסר את תאי A TT 20 מהחממה ואפשר להם לחזור לטמפרטורת החדר, לשאוב מהמאגר הישן. לאחר מכן מרחו תמיסת חיץ טרייה המכילה את ה-MPD על התאים.
לאחר מכן, השתמש במערכת הטיפול בנוזלים כדי להחיל ריכוזים שונים של תרכובות הבדיקה ותמיסות בקרה על התאים. בצלחת 96 הבארות דגרו את התאים למשך חמש דקות עם תרכובות בדיקה למדידות הפלואורסצנטיות. בהליך זה, הכנס את צלחת 96 הבאר לקורא צלחות פלואורסצנטי סינרגטי ביוטכנולוגי.
השג את אות הרקע הפלואורסצנטי באורך גל הפרשה של 520 ננומטר ואורך גל משימה של 560 ננומטר. לאחר מכן, החל את ליגנדות G PCR R או פתרון בקרה על הבארות כדי להפעיל את תעלות ה-GIR באמצעות מערכת שני המזרקים Synergy. לאחר מכן אסוף את נקודות הנתונים במרווחים של עשר שניות על פני תקופת דגימה 302.
באורכי גל העירור והפליטה. חשב את גורם Z על מנת לקבוע את מהימנות הבדיקה. Z.גורמים בטווח של 0.5 עד 1.0 מצביעים על כך שאיכות הבדיקה מצוינת.
צלחות עם גורמי Z מתחת ל-0.5 אינן נכללות. מהניתוח נראים תרכובות המווסתות את האות הפלואורסצנטי נבדקות מחדש בנוכחות שני מילי-מולרי בריום כלוריד או 500 ננו טראפין Q כדי לאשר את ספציפיות תעלת האשלגן של מיישר פנימה המוצגת כאן היא אות פלואורסצנטי מייצג HLB 0 2 1 1 15 2 הנמדד לאורך זמן בתאי A TT 20 בתוספת סומטוסטטין או תמיסת בקרה. היחס בין עוצמת הפלואורסצנט בציר Y חושב על ידי חלוקת האות בנוכחות סומטוסטטין או תמיסת הבקרה באות הבסיס שנמדד לפני הוספת סומטוסטטין או תמיסת בקרה.
מוצג כאן הטיפול בתאי A TT 20 עם 500 ננו טוחנות. טראפין Q מעכב את הירידה בתיווך סומטוסטטין באות הפלואורסצנטי על ידי קשירת שניים וחסימת ערוצי G. ומוצג כאן הטיפול בתאי A TT 20 עם 20 פרופפנון מיקרו-מולרי, אשר גם מעכב את הירידה בתיווך סומטוסטטין באות הפלואורסצנטי לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות תרופות המווסתות ערוצי GRK באמצעות קורא צלחות פלורסנט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר הליך סריקה בזמן אמת לזיהוי תרופות המקימות עם תעלות K+ מסוג G protein-gated inward rectifier (GIRK). הבדיקה משתמשת בצבעים פלואורסצנטיים הרגישים לפוטנציאל ממברנה כדי למדוד את פעילות תעלות ה-GIRK, דבר ההופך אותה למתאימה עבור קווי תאים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פרמקולוגיה
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- תעלים מסוג GIRK ממלאים תפקיד מכריע בסיגנלינג נוירונלי.
- זיהוי של מודולטורים של תעלי GIRK עשוי להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשות.
- בדיקות בזמן אמת משפרות את היעילות של סריקת תרופות.
- צבעים פלואורסצנטיים מספקים מדד רגיש לפעילות התעלים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוצדורה לסריקת תרופות המודולות תעלות GIRK.
- שימוש בפורמט של סריקה רב-מסית (high-throughput) לבדיקת תרכובות מרובות.
- שיפור ההבנה של הפארמקולוגיה של תעלות GIRK.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעת תאי TT 20 בלוחית 96 באריות.
- שימוש במערכת הטיפול בנוזלים Verset לדילול תרכובות הבדיקה.
- החלת התרכובות המדוללות על התאים באמצעות ה-Verset.
- שימוש בקורא לוחות פלואורסצנטי Synergy two למדידת התגובות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי תרכובות המשנות אותות המונחים על ידי סומטוסטטין.
- הדגמת יכולת ההסתגלות של הבדיקה לקווי תאים שונים.
- מודולציה מוצלחת של פעילות תעלות GIRK על ידי התרכובות שנבדקו.
- תיקוף של יעילותו של קורא הלוחיות הפלואורסצנטי בסריקה.
מסקנות
- הבדיקה שפותחה מהווה כלי בעל ערך לגילוי תרופות המכוונות לתעלות GIRK.
- סריקה בזמן אמת עשויה להאיץ את הזיהוי של תרפיה פוטנציאלית.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון את ההשלכות הקליניות של התרכובות שזוהו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת זיהוי בסביבתיות גבוהה (high-throughput) של מודולטורים לערוצי GIRK, ובכך תומכת בתיקוף מטרות במחקרים של מדעי העצב וגילוי תרופות למערכת הקרדיווסקולרית. באמצעות אספקת קריאות פלואורסצנציה כמותיות בזמן אמת, היא מפחיתה את ההסתמכות על אלקטרופיזיולוגיה בעלת סביבתיות נמוכה ומאיצה את המעבר משלב הזיהוי הראשוני (hit) לשלב המועמד המוביל (lead). השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור השפעות התרכובות לפעילות תפקודית של הערוץ בהקשר תאי רלוונטי פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת אפנון תפקודי של תעלות GIRK בתגובה לליגנדים של GPCR.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה מהירה של ספריות תרכובות כדי לזהות מפעילים או מעכבים בעלי ספציפיות מכניסטית.
- ערך ניבוי: תומך בהורדת סיכונים של מטרה (target de-risking) על ידי אישור פעילות על המטרה באמצעות שינויים באות פלואורסצנציה המתואמים עם זרימה החוצה של K+.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: שימוש בצבעים הרגישים לפוטנציאל ממברנה (DiBAC4(3) או HLB 021-152) ליצירת אותות כמותיים בזמן אמת עם הפעלת GIRK.
- שחזוריות: חישוב Z-factor (טווח מצוין: 0.5–1.0) מבטיח את חוסנה של הבדיקה לצורך בחירת פגיעות (hits) ושחזוריות של קמפיין הסריקה.
- ניתנות להרחבה: תואם לפורמט של 96 בארות ולמערכות לטיפול בנוזלים (למשל Verset) עבור חלוקה אוטומטית של תרכובות וסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: המודולטורים שיזוהו עשויים להנחות אסטרטגיות טיפוליות לכאב נוירופתי, התמכרות והפרעות קצב לב באמצעות עיכוב עצבי המתווך על ידי GIRK.
- המשכיות תרגומית: קריאות פלואורסצנטיות מספקות גשר בין מעורבות המטרה (target engagement) לפלט תפקודי, ובכך תומכות בעיגון פנוטיפי פרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניstית: הספציפיות אומתה באמצעות מעכבים כגון barium chloride או Terapin Q כדי להבדיל בין השפעות המתווכות על ידי GIRK לבין פעילות חוץ-מטרה (off-target).
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מולקולות מובילות, ומאפשרת סריקה תפקודית של מודולטורים של GIRK לפני אופטימיזציה בשלבים הבאים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קישור הפעלת GPCR לשינויים בפלואורסצנציה התלויים ב-GIRK, ובכך מבהיר את המודולציה של המסלול.
- סריקה: מספק מוכנות של הבדיקה באמצעות טעינת צבע סטנדרטית, יישום תרכובות ומדידת פלואורסצנציה קינטית לאורך 300 שניות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של המשתנה התלוי (יחסי עוצמת פלואורסצנציה), המאפשרות השוואה של עוצמה (potency) ויעילות (efficacy) של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודות פרה-קליניות על ידי זיהוי תרכובות המשנות עירור עצבי באמצעות GIRK, הרלוונטי למודלים של כאב והתמכרות.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה הניתנת להתאמה עבור קווי תאים וליגנדים של GPCR, המקדמת שימוש חוזר במספר קמפיינים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בmodulation של המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בסריקת תרופות לתעלות יונים.
- ערך תפעולי: מציע סטנדרטיזציה, הדירות ונתונים קינטיים בזמן אמת שאינם ניתנים להשגה באמצעות בדיקות endpoint.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות לוולידציה פונקציונלית מוקדמת, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב חוסר ב-target engagement.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם-סיכון של תרכובות עם פעילות GIRK מאושרת לצורך קידומן לשלב אופטימיזציית מוביל (lead optimization).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים (תאי AT T20), טיפול בצבעים פלואורסצנטיים ותפעול של קורא לוחות קינטי.
- תלוי בקורא לוחות פלואורסצנטי בעל יכולת הזרקה (למשל, Synergy 2) ובהגדרות עירור/פליטה תואמות (520 nm/560 nm).
- מחייב סטנדרטיזציה של טעינת הצבע, זמני דגירה ותנאי באפר בין בארות ולוחות.
- התאמה לקווי תאים אחרים דורשת תיקוף של ביטוי GIRK ויעילות טעינת הצבע.
- מגבלה מעשית: יש לאשר את ספציפיות הבדיקה באמצעות מעכבים אורתוגונליים (למשל, Ba2+, Terapin Q) כדי לשלול שינויים בפלואורסצנציה שאינם מתווכים על ידי GIRK.
