Name: Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: למדו שיטת סקר פלואורסצנטית בזמן אמת לזיהוי תרופות המשנות פעילות של ערוצי GIRK בתאי AT20. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר של תרכובות לטיפול בכאב ומחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית בפרס אישי שירות הבריאות NS-071530.

1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול יותרת המוח AtT20 תאים במדיום שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) השלימו עם סרום סוס 10% ולשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התרבות התאים על ידי subculturing כל 5 עד 7 ימים באמצעות הליך trypsinization סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות את הבארות של התחתון, שחור בהיר, צלחות 96-50 גם עם μL של פולי-L-ליזין. אפשר בארות את לייבוש למשך 30 דקות בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת התאים את הצלחות 96-200 המכילים גם התקשורת μL בצפיפות של 30,000 תאים בכל טוב לאחסן את התאים בחממה של 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ההתקנה השאיפה, בהיקף של צנצנת 4 ליטר פקוק מחובר ואקום בצד אחד טיפ 200 פיפטה μL בקצה השני, לאט לאט לשאוב בינוני תרבות monolayer מן התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם μL 200 של פתרון חיץ רגיל (132 mM NaCl, KCl 5 מ&quot;מ, 1 מ &#39;M CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 מ&quot;מ דקסטרוז, 5 HEPES מ&quot;מ, ה-pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של פתרון מאגר המכיל את הפוטנציאל רגיש קרום צבע (MPD) DiBAC 4 (3) או HLB 021-152 (5 מיקרומטר) זה טוב דגירה התאים דקות 40 ב 37 ° C. </li></ol> 2. הכנת תרכובות בדיקה וטיפול Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול סדרתי של תרכובות הבדיקה (מניות = 10 מ&quot;מ DMSO) מספריית מתחם (בפורמט 96-היטב) באמצעות (ThermoFisher) Versette טיפול אוטומטי מערכת נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 96-ובכן, המכיל את AtT20 תאים, מן החממה ולאפשר הצלחת לחזור לטמפרטורת החדר. לשאוב את המאגר הישן וליישם פתרון חוצץ חדש המכיל את MPD אל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מערכת טיפול הנוזל להחיל ריכוזים שונים (10 ננומטר ל -10 מיקרומטר) של תרכובות הבדיקה (2-20 μL) ופתרונות שליטה (0.1% DMSO) (במאגר פתרון containing MPD) לצלחת 96-המכילה גם את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים דקות 5 עם תרכובות הבדיקה שקדמו המדידות ניאון. </li></ol> 3. הפעלת ערוצים GIRK, מדידה וניתוח פלורסנט ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת 96-היטב לקורא Biotek צלחת Synergy2 ניאון ולקבל את האות רקע פלורסנט באורכי גל עירור ופליטה של ​​520 ו 560 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ligands GPCR (= סומטוסטטין 200 מייל ימי או carbachol = 10 מיקרומטר) או פתרון שליטה (מאגר לבד) (20 μL) אל בארות (הנפח הכולל = 220 μL) להפעלת ערוצי GIRK באמצעות מערכת ההזרקה Synergy2. איסוף נקודות נתונים במרווחי זמן של 10 פני תקופה דגימה של 300 באורכי גל עירור ופליטה של ​​520 ו 560 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את הקורס בזמן שיא האמפליטודה של שינוי ניאון באמצעות Biotek Gen5 תוכנה לייצא את הנתונים ל-Excel לצורך ניתוח נוסף. </lאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את Z&#39;גורמים כדי לקבוע את המהימנות של assay. לוחות המשמשים לקביעת Z&#39;גורם מכיל 2 שורות כל אחד חיובי (ליגנד GPCR) והשלילי (מאגר לבד) שולטת. Z&#39;גורם מוגדר: Z &#39;= 1 - (P + 3σ 3σ N) / | P μ - μ N |, כאשר μ μ P &amp; N הן אמצעי שליטה חיובית אותות בקרה שליליות, ו σ P &amp; σ N הן סטיות תקן של שליטה חיובית אותות בקרה שליליות, בהתאמה 6. Z&#39;גורמי בטווח של 0.5-1.0 עולה כי איכות assay מצוין 6. צלחות עם גורמי Z&#39;מתחת 0.5 אינם נכללים בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכובות לווסת את האות ניאון הם נוספת שתבצע בנוכחות Ba 2 + או tertiapin-Q כדי לאשר פנימה מיישר K + הספציפיות הערוץ. </li></ol> 4. Representative תוצאות למשל האות הקרינה נמדדת באמצעות assay ערוץ GIRK מוצג באיור 2. תוספת של somatostatin ליגנד GPCR (200 ננומטר) ל AtT20 תאים הנגרם מהיר, הזמן תלוי ירידה האות HLB 021-152 ניאון (איור 2). לעומת זאת, התוספת של פתרון בקרת המיוצר עלייה מיידית קטנה הקרינה שעם הזמן חזר לקו הבסיס (איור 2). השוואה בין ערכים ניאון השיא ב 96-הזריק גם צלחות עם שליטה ופתרונות somatostatin נתן כמה Z&#39;גורמי בטווח של 0.5-0.7. עבור כימות נוספת, הרשומה השליטה היה מפחיתים את שיא somatostatin ואת התוצאה somatostatin רגיש האות ניתח (איור 2). Assay מספק שיטה מהירה לזיהוי תרופות לווסת ערוצי GIRK. לדוגמה, תרופות המעכבות את צ&#39;ה GIRKnnel צריך להפחית GPCR ליגנד בתיווך ירידה הקרינה על ידי מניעת K + בזרימת מן התאים. כפי שניתן לראות באיור 3, טיפול של התאים עם tertiapin-Q, רעלן זה חוסם ערוצי GIRK 7, המיוצר על עיכוב של שינוי somatostatin בתיווך ניאון. Propafenone, תרופה אנטי בקצב לא סדיר שחוסמת ערוצי GIRK בלב 8, גם עכבות שינוי ניאון (איור 4). Assay יכול גם להיות שימושי עבור זיהוי activators של ערוץ GIRK. עם זאת, היישום של אתנול (100 &amp; 200 מ&quot;מ), גרמה activator של ערוץ GIRK 2,3, לא חל שינוי משמעותי אות ניאון בהשוואה לשלוט פתרון (p&gt; 0.5). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. עיצוב ניסיוני של assay GIRK ערוץ ניאון. AtT20 תאים מודגרת במאגר המכיל membranדואר פוטנציאל רגיש צבע פלואורסצנטי (D). את מולקולות צבע להיכנס לתאים ולהפוך ניאון על קשירה חלבונים תאיים (פאנל למעלה). עקידת somatostatin (סום) כדי GPCR שלה מגרה את החלבון מדכא G (G i) גורם להפעלה של ערוץ GIRK (הפאנל התחתון). בזרימת הבאות של K + מחוץ לתאים גורמת קרום הפוטנציאל להיות שלילי יותר את מולקולות צבע כדי לצאת התאים. כתוצאה מכך את האות יורדת ניאון (הפאנל התחתון). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="איור 2"/> 2. איור נציג HLB 021-152 אות ניאון נמדד לאורך זמן את AtT20 תאים במהלך תוספת של somatostatin או פתרון שליטה. היחס בין עוצמת ניאון (F / F O) חושב על ידי חלוקת האות בנוכחות (ו) somatostatin (או פתרון שליטה) על ידי האות המחקר נמדד לפני (F O) מודעותdition של somatostatin (או פתרון שליטה). כל נקודה מייצגת ממוצע ± SE שהושגו 5-6 בארות. Somatostatin או פתרון שליטה נוסף בזמן אפס (↓). התוספת של פתרון בקרת גרם לעלייה חולפת קטן אות ניאון. זו תוצאה של שינוי הטמפרטורה הנגרמת על ידי הזרקה של הפתרון. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. טיפול של AtT20 תאים עם tertiapin-Q (500 ננומטר) מעכב את הירידה somatostatin בתיווך האות ניאון באמצעות קשירה וחסימת ערוצי GIRK. כל נקודה מייצגת ממוצע ± SE שהושגו 4-6 בארות. Somatostatin נוספה בזמן אפס (↓). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. טיפול של AtT20 תאים עם propafenone (20 מיקרומטר) גם מעכב ירידה somatostatin בתיווך באות ניאון. כל נקודה מייצגת ממוצע ± SE שהושגו 5-6 בארות. Somatostatin נוספה בזמן אפס (↓).

<ol><li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+potassium+channels%3A+their+structure%2C+function+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li>
<li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+%28GIRK%29+channels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li>
<li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li>
<li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li>
<li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay%3A+an+old+assay+with+a+new+look%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li>
<li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li>
<li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li>
<li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li>
<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

למרות הפוטנציאל רגישים קרום צבעי ניאון נעשה שימוש כדי לזהות תרופות אשר לווסת תעלות יונים 9,10, זהו הדו&quot;ח הראשון של בקשתם העצבית GIRK ערוץ גילוי תרופות. Assay ערוץ GIRK ניאון המובא כאן מספק שיטה מהירה, אמינה בזמן אמת להקרנה של ליגנד, מגודרת K + ערוצים. Assay ניתן לשנות לשימוש עם מגוון רחב של תאים, כולל תאים קווי הנציח (HEK293, צ &#39;ו, וכו&#39;) המבטאים אקסוגני רקומביננטי GIRK ערוץ 11 או שורות תאים משובטים (AtT20, PC-12) המבטאים ערוץ אנדוגני. ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> סוס סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-גם צלחות </td><td> קורנינג </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette המטפל נוזל אוטומטי </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 צלחת ניאון הקורא </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 ניתוח שלoftware </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד.

assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים girk

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G-חלבון סגורות פנימה מיישר K + (GIRK) ערוצים לתפקד כמתווכים הסלולר של מגוון רחב של הורמונים נוירוטרנסמיטורים באים לידי ביטוי השרירים, המוח, הלב ורקמות שלד 1,2 האנדוקרינית. ערוצי GIRK להיות מופעל בעקבות עקידת ligands (נוירוטרנסמיטורים, הורמונים, תרופות וכו &#39;) כדי פלזמה שלהם קרום הנכנס, G חלבונים מצמידים קולטנים (GPCRs). מחייב זה גורם לגירוי של חלבונים G (G I ו-G o) אשר לאחר מכן לאגד ולהפעיל את ערוץ GIRK. פעם אחת פתחתי את ערוץ GIRK מאפשר תנועה של K + מחוץ לתא גורמת קרום מנוחה הפוטנציאל להיות שלילי יותר. כתוצאה מכך, הפעלת GIRK ערוץ בנוירונים פוחתת היווצרות ספונטנית פוטנציאל פעולה מעכב שחרור של שליחים עצביים מעוררים. בלב, הפעלת ערוץ GIRK מעכב פעילות הקוצב ובכך להאט את קצב הלב. <p= &quot;jove_content&quot; הכיתה&gt; ערוצי GIRK לייצג מטרות חדשות לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות לטיפול בכאב נוירופתי, התמכרות לסמים, הפרעות בקצב הלב והפרעות אחרות 3. עם זאת, פרמקולוגיה של ערוצים אלה עדיין נודעת בעיקר. למרות מספר תרופות כולל נגד סוכני בקצב לא סדיר, תרופות אנטי פסיכוטיות וכן תרופות נוגדות דיכאון לחסום את הערוץ GIRK, עיכוב זה אינו סלקטיבי מתרחש בריכוזים גבוהים יחסית סמים 3. כאן אנו מתארים assay בזמן אמת ההקרנה לזיהוי מאפננים חדשים של ערוצי GIRK. ב assay זה, תאים עצביים AtT20, אשר הביעו את ערוצי GIRK, נטענים עם פוטנציאל רגיש צבעים קרום ניאון כגון bis-(1,3-dibutylbarbituric חומצה) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] או HLB 021-152 (איור 1 ). את מולקולות צבע להיות ספיגת הבאה ניאון חזק אל תוך התאים (איור 1). טיפולשל תאים עם ligands GPCR מגרה ערוצי GIRK לפתוח. כתוצאה K + בזרימת מחוץ לתא גורמת פוטנציאל הממברנה להיות שלילית יותר את האות ניאון כדי להקטין (איור 1). לכן, תרופות לווסת K + בזרימת דרך ערוץ GIRK ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו באמצעות הקורא הצלחת ניאון. שלא כמו אחרים ערוץ יון מבחני המיון, כגון ספיגת ספקטרומטריית אטומית 4 או 5 radiotracer ניתוח, assay ערוץ GIRK ניאון מספק בהליך מיון מהיר, בזמן אמת ולא יקר.

בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר K<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) ערוצים מתואר. Assay מנצל פוטנציאל רגישות קרום צבעי ניאון כדי למדוד פעילות GIRK הערוץ. טכניקה זו ניתנת להתאמה לשימוש על מספר שורות תאים.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

תעלות אשלגן (K+) מסוג inward rectifier המופעלות על ידי חלבון G (GIRK) משמשות כמתווכות תאיות עבור מגוון רחב של הורמונים ומוליכים עצביים, והן מבוטאות ב...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תרופות חדשות המודולות ערוצי grk. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעת תאי A TT 20 בתוך פלטה של 96 בארות. השלב השני הוא דילול תרכובות הבדיקה באמצעות מערכת Verset לטיפול בפלטות נוזלים.בשלב הבא, מתיקים את התרכובות הנבדקות המדוללות על התאים באמצעות ה-verset. השלב הסופי הוא להכניס את פלטת 96 הבארות לקורא הפלטות הפלואורסצנטי Synergy two, ולהזריק לבארות את תמיסות הביקורת ואת תמיסות הסומטוסטטין. לבסוף, נעשה שימוש בקורא הפלטות הפלואורסצנטי כדי להציג את התרכובות המשנות את האות הפלואורסצנטי המושרה על ידי סומטוסטטין, ובכך מווסתות את תעלולי ה-Grk.היתרון של הליך זה על פני שיטות קיימות, כגון רישום patch clamp, הוא שניתן לסנן במהירות מספר רב של תרכובות כדי לקבוע אם הן מווסתות ערוצי gerk. ההשלכות של טכניקה זוי לומדות לכיוון של טיפול בכאב, כיוון שניתן לזהות תרכובות המפעילות את ערוץ ה-Gerk, אשר מובילות לעיכוב של תמסורת nociceptive ב-FI. מדגימה את הליך הציפוי של פלטות 96 בארות וזריעת התאים היא Maribel Vasquez.סטודנט במעבדה שלי יתחיל את ההליך על ידי גידול תאי היפופיזה AT T 20 ב-DMEM מועשר ב-10% horse serum בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה עם 5% CO2. יש לתחזק את התרבית על ידי תת-תרבית (subculturing) של התאים מדי חמישה עד שבעה ימים תוך שימוש בפרוצדורת סטנדרטיזציה. לאחר מכן, יש לצפות את הבארות של הלוח השחור השקוף.פלטה של 96 בארות עם 50 µL של poly L lysine בתחתית. יש להניח לבארות להתייבש במשך 30 דקות באינקובטור. לאחר מכן, יש להסיר את עודפי ה-poly L lysine ולזרוע את התאים בפלטת 96 הבארות המכילה 200 µL של מצע גידול בצפיפות של 30,000 תאים לבער.לאחר מכן, אחסנו את התאים באינקובטור למשך שלושה עד ארבעה ימים. השתמשו במערכת שאיבה כדי לשאוב באיטיות את מצע הגידול משכבת התאים החד-שכבתית (monolayer), ולאחר מכן שטפו את התאים עם 200 µL של תמיסת בופר רגילה. לאחר מכן, הוסיפו לכל אחד 200 µL של תמיסת בופר המכילה צבע הרגיש לפוטנציאל הממברנה.דגרו את התאים למשך 40 דקות ב-37 °C. לאחר 40 דקות, הוציאו את תאי ה-A TT 20 מהאינקובטור והמתינו שיחזרו לטמפרטורת החדר, ושאבו את הבופר הישן. לאחר מכן, הוסיפו לתאים תמיסת בופר טרייה המכילה MPD.בשלב הבא, השתמשו במערכת לטיפול בנוזלים כדי להוסיף ריכוזים שונים של תרכובות הבדיקה ותמיסות ביקורת לתאים. בלוחית 96 הבארות, דגרו את התאים במשך חמש דקות עם תרכובות הבדיקה לצורך המדידות הפלואורסצנטיות. בהליך זה, הכניסו את לוחית 96 הבארות לקורא לוחות פלואורסצנטי מסוג biotech synergy two.מדדו את אות הרקע הפלואורסצנטי באורך גל עירור של 520 nanometers ובאורך גל פליטה של 560 nanometers. לאחר מכן, החילו את הליגנדים של G PCR R או את תמיסת הביקורת לבארות כדי להפעיל את תעלות ה-GIR באמצעות מערכת ההזרקה Synergy two. לאחר מכן, אספו את נקודות הנתונים במרווחי זמן של עשר שניות לאורך תקופת דגימה של 302 שניות.בארכי העגור של העירור והפליטה. חשבו את מקדם Z כדי לקבוע את מהימנות הבדיקה. מקדמי Z בטווח של 0.5 עד 1.0 מעידים על כך שאיכות הבדיקה מצוינת.פלטות עם ערכי Z factor נמוכים מ-0.5 מוחרגות. מהניתוח, תרכובות המווסתות את האות הפלואורסצנטי נבדקות שוב בנוכחות 2 mM של barium chloride או 500 nM של terapin Q כדי לאשר ספציפיות לתעלות אשלגן מסוג inward rectifier; מוצג כאן אות פלואורסצנטי מייצג של HLB 0 2 1 1 15 2 שנמדד לאורך זמן בתאי A TT 20 עם הוספה של somatostatin או תמיסת ביקורת. היחס של עוצמת הפלואורסצנציה בציר ה-Y חושב על ידי חלוקת האות בנוכחות somatostatin או תמיסת הביקורת באות הבסיס שנמדד לפני הוספת ה-somatostatin או תמיסת הביקורת.המוצג כאן הוא הטיפול בתאי A TT 20 באמצעות 500 nM של Terapin Q, המעכב את הירידה באות הפלואורסצנטי המתווכת על ידי סומטוסטטין דרך קישור וחסימה של ערוצי G. ומוצג כאן הטיפול בתאי A TT 20 באמצעות 20 µM של propafenone, שגם הוא מעכב את הירידה באות הפלואורסצנטי המתווכת על ידי סומטוסטטין. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים, במידה והיא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות תרופות המודולות ערוצי grk באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי.

a-fluorescent-screening-assay-for-identifying-modulators-girk

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר ') ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

מקור: Rugjee, K. N., et al. הקמת מערך תפוקה גבוהה לסינון מולקולות קטנות המווסתות איתות c-di-GMP ב-Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים את ההקרנה של מאפנני di-GMP מחזוריים באמצעות חיידקים מהונדסים גנטית המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשליטת מקדם רגיש ל-c-di-GMP. הקרינה נמדדת בצלחת מרובת בארות המכילה תרכובות בדיקה שונות. תרכובות המעכבות ייצור c-di-GMP מובילות להפחתת הקרינה. לאחר מכן הנתונים מנותחים כדי לזהות מודולטורים פוטנציאליים של איתות c-di-GMP בחיידקים.

סינון של מאפנני di-GMP מחזוריים באמצעות חיידקים המבטאים חלבון מדווח פלואורסצנטי 

סרטון זה מדגים את ההקרנה של תרכובות אימונומודולטוריות באמצעות בדיקה מבוססת פלורסנט. לימפוציטים T שמקורם בעכבר מהונדס עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מטופלים בתרכובות אלה. אותות ה-GFP המשופרים והמופחתים מאפשרים לזהות את ההשפעות הממריצות והמעכבות של התרכובות, בהתאמה.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

סרטון זה מדגים בדיקה תאית הכוללת תאי גליובלסטומה המבטאים קולטני כימוקין CXCR4. הבדיקה משתמשת בצבע רגיש לסידן כדי למדוד שינויים פלואורסצנטיים בעת אינטראקציה עם הסוכן, ומציעה תובנות לגבי דינמיקת איתות תאי.

בדיקה סלולרית לזיהוי סוכנים בעלי אינטראקציה CXCR4

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

כאן, אנו מציגים עבור הרומן הפער צומת תקשורת המערכת assay המיועד להקרנה תפוקה גבוהה של הפער להתכוונן צומת כימיקלים גילוי תרופות רעילות הערכת פרוטוקול.

Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

למדו שיטת סקר פלואורסצנטית בזמן אמת לזיהוי תרופות המשנות פעילות של ערוצי GIRK בתאי AT20. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר של תרכובות לטיפול בכאב ומחלות נוירולוגיות.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

גלה סרטונים נוספים