הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע
21 ביוני 2012
איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין פיברובלסטים עובריים של עכבר המתאימים לגידול של תאי גזע עובריים אנושיים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. הדבר מושג תחילה על ידי הפרדת כל עובר והסרת הראש והאיברים האדומים. לאחר מכן, הרקמה נקטעת לבסוף ומעובדת בעיכול אנזימטי.
לאחר מכן זורעים את התאים, שלושה עד ארבעה עוברים לכל בקבוק, ומגדילים אותם. לבסוף, משתמשים ב-myths המנוטרלים להכנת המדיום המותנה. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-e LSA כדי להראות את הריכוז האופטימלי של active בתוך מדיום מותנה התומך בצמיחה לא מובחנת של תאי גזע פלוריפוטנטיים.
באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בהתחלה, מכיוון שההליך חייב להיות סטנדרטי כדי להפיק פיברובלסטים מעוברים של עכבר באיכות גבוהה, אשר יאפשרו צמיחה לא מובחנת הן של תאי גזע עובריים אנושיים והן של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הבידוד והניתוח של העובר קשים ללמידה, מאחר שהטיפול בעובר העכבר דורש מיומנויות ידניות מסוימות. את הפרוצדורה תדגים ד"ר Justina Suk, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי, יחד עם סטודנטית לתואר שני, Caterina Dres.
לאחר הקרבת עכברה ההרה ביום ה-13 או ה-14 לאחר ההזדווגות והוצאת קרני הרחם, שטפו אותן קצרה ב-70% ethanol והניחו אותן בתוך מבחנה מסוג Falcon המכילה PBS, תוך שמירה על תנאים אספטיים תחת מMetaxyonycha לתרביות רקמה. הניחו את קרני הרחם בתוך צלחת פטרי והפרידו כל עובר מהשלייה ומהשק העוברי. הסירו את הראש ואת האיברים האדומים, שטפו את חלקי העובר שנותרו ב-PBS והניחו אותם בצReplacing לחת פטרי נקייה באמצעות להב תער סטרילי.
לבסוף, קצצו את הרקמה עד שיהיה ניתן להעביר אותה באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של 0.05% trypsin in EDTA ו-100 K units של DNase לכל עובר. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לשפופרת פלקון של 50 mL והדגירו אותה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר כל חמש דקות של דגירה, הפרידו את התאים באמצעות פיפטור יסודי למעלה ולמטה. נטרלו את ה-trypsin על ידי הוספת נפח אחד בערך של meth.Medium שהוכן טרי. סבבו את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות נמוכה.
הסר בזהירות את הנוזל העליון ושחזר את המשקע בתווך meth חמים. הכן מבחנות מצופים ב-0.2% gelatin והדגש אותן למשך שעתיים לפחות. בטמפרטורת החדר, זרע תאים מכשלושה עד ארבעה עוברים לתוך כל מבחנה מצופה ב-0.2% gelatin. הפיברובלסטים הם התאים היחידים בעלי היכולת להיצמד למבחנות המצופות ב-gelatin.
לאחר כ-24 שעות, כאשר התאים מגיעים ל-80 עד 90% קונפלואנציה, הקפיאו חלק מהתאים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לשימוש עתידי, הרחיבו את התאים הנותרים למעברים P3 או P4. כדי להכין תאי מאכיל (feeder cells) באמצעות מעברי P3 או P4, התחילו בציפוי של בקבוקי T150 ב-0.2% ג'לטין והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות.
דללו mitomycin C ב-PBS וסננו באמצעות מסנן מזרק. שאבו את המצע מהתאים ושטפו אותם ב-PBS ללא סידן או מגנזיום. הנחו 20 מיליליטר של מצע המכיל 10 micrograms per milliliter של mitomycin C על התאים והדגירו למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius.
בשלב הבא, שטפו את התאים פעמיים עם PBS ובצעו טריפסין. לאחר הדגירה, השעיו את התאים במצע meth, לאחר מכן סבבו את התאים בצנטריפוגה והשעיו אותם מחדש במצע meth חם. זרעו את התאים בצפיפות של 56,000 תאים לסנטימטר רבוע בבקבוקי T150 והדגירו אותם למשך הלילה; ביום שאחרי זריעת תאי ה-meth.
החליפו את מצע התרבית במצע HESC שאינו מותנה (unconditioned medium), מועשר ב-4 ng/mL טריים של FGF2, והכניסו לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר 24 שעות, אספו את המצע המותנה מהבקבוקונים והחליפו אותו במצע HESC טרי. אחסנו את המצע שנאסף בטמפרטורה של 20- °C.
חזור על האיסוף למשך שישה ימים נוספים לאחר האיסוף השישי. אוחד את כל המדיום וסנן אותו. לאחר מכן, אחסן אותו באליקווטים של 50 milliliter בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.
כדי למדוד את ה-active in a, במדיום מותנה (conditioned medium), יש להביא את כל הדגימות והריאגנטים לטמפרטורת החדר. יש לדלל את הנוגדן active in a ב-PBS עם 1% BSA ולהוסיף 100 µl לבארות של מיקרופלייטה. יש להדגיר למשך הלילה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
שטוף את הבארות שלוש פעמים עם PBST. לאחר מכן, חסום את הבארות למשך שעה בטמפרטורת החדר. בינתיים, הכן עקום סטנדרט פעיל, הכולל שבעה דילולות ודגימה ריקה (blank), תוך שימוש בטווח עבודה של 0.25 עד 32 nanograms per milliliter.
הוסיפו כפילויות של התמיסות הסטנדרטיות והדגימות לבארות והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBST. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני מביוטינילי והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBST והוסיפו streptavidin HRP. לאחר ערבוב והוספת substrate, עטפו את הדפנות להגנה מאור והדגרימו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 100 µL של תמיסת עצירה (stop solution) לכל בארה וערבבו בעדינות.
לבסוף, הגדירו את קורא המיקרו-פלטה ל-50 nanometers עם תיקון אורך גל ב-40 nanometers או 70 nanometers, וקבעו את הצפיפות האופטית עבור כל באער המוצג. להלן המורפולוגיה הטיפוסית של h ESCs לא מובחנות, שגודלו בנוכחות תאי מאכלסים (feeder cells), במצע מותנה ובמצע מוגדר. בדוגמאות אלו, HI PSCs גודלו בנוכחות תאי מאכלסים.
תמונות אלו מראות את המורפולוגיה של תאי myths ותאי מאכיל (feeder cells) מנוטרלים המשמשים להכנת מצע מותנה (conditioned medium). באופן כללי, התאים צריכים להגיע למצב של התמזגות (confluence) 24 שעות לאחר הבידוד ולהיות מוכנים להקפאה או להתרחבות. עם זאת, לעיתים עשויים להיות נדרשים יומיים עד שלושה ימים עד לקבלת תרביות ממוזגות.
יש להכין את המדיום המותנה מתאים במעבר ארבע ולא מאוחר מכך. דבר זה חיוני מכיוון שתאי מקור ראשוניים יכולים להתרבות רק למשך ארבעה עד חמישה מעברים לפני תחילת תהליך ההזדקנות (senescence). הציטוקין הפעיל ב-a נחשב לאחד הגורמים הקריטיים ביותר המופרשים על ידי תאי מאכיל (feeder cells) לתמיכה בצמיחה לא מובחנת של תאים פלוריפוטנטיים.
מדידת רמת הפעילות בתוך מדיום מותנה, כפי שמוצג כאן, היא בדיקה כמותית נוחה לניטור איכות ה-mets. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע בידוד של פיברובלסטים עובריים של עכבר תוך שעה עד שעתיים, אם הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לגדל את בעלי החיים מראש ולהכין ולהוביל באוטוקלב את כל המכשירים מראש.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוצדורה להכנת פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) המתאימים לתרבית של תאי גזע עובריים אנושיים ותאי גזע רב-עוצמה מושריים. הוא מדגיש את החשיבות של שימוש בזן עכבר מתאים ובריכוזים אופטימליים של גורמים ספציפיים לשמירה על הרב-עוצמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות לתרבית תאים
- התפתחות עוברית
רקע
- פיברובלסטים עובריים של עכבר חיוניים לתמיכה בתרביות של תאי גזע.
- זנים ספציפיים של עכברים, כגון CF-1, מניבים MEFs באיכות גבוהה יותר.
- מדיום מותנה חייב להכיל גורמים מרכזיים כגון Activin A לקבלת תוצאות אופטימליות.
- סטנדרטיזציה של הפרוטוקולים חיונית לשחזור התוצאות.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה לבידוד MEFs באיכות גבוהה.
- תמיכה בצמיחה לא מובחנת של תאי גזע עובריים ואנדוציתיים רב-עוצמה אנושיים.
- הדגמת השלבים הקריטיים המעורבים בתהליך הבידוד.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הבדיקה והכנתו של עוברים של עכבר.
- עיכול רקמה לצורך בידוד פיברובלסטים.
- תרבית של MEFs בבקבוקים מצופים בג'לטין.
- הכנת מצע גידול מותאם (conditioned medium) לתרבית תאי גזע.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של MEFs התומכים בצמיחת תאי גזע פלוריפוטנטיים.
- זיהוי תנאים אופטימליים לשמירה על חיוניות התאים ופלוריפוטנטיות.
- הדגמת חשיבותם של גורמי גדילה ספציפיים במצע התרבית.
- מתן הנחיה ויזואלית לתהליכי הבידוד והתרבית.
מסקנות
- פיברובלסטים של עובר עכבר (MEFs) באיכות גבוהה חיוניים למחקר יעיל בתאי גזע.
- פרוטוקולים סטנדרטיים משפרים את השחזוריות במחקרי תאי גזע.
- הדגמות חזותיות יכולות לסייע בהכשרת חוקרים חדשים בטכניקות אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
הקמה של מערכות תאי מאכילה (feeder cells) אמינות היא קריטית לשמירה על פלוריפוטנטיות בתרביות של תאי גזע אנושיים, ומשפיעה ישירות על תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות בשלבי הגילוי המוקדמים. הכנה סטנדרטית של פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) והתווך המותנה שלהם מאפשרת תנאי תרבית הניתנים לשחזור, ובכך מפחיתה את השונות בבדיקות המבוססות על תאי גזע. דבר זה תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבטחת הפרשה עקבית של גורמי גדילה, ובמיוחד Activin A, הקשור למסלולי פלוריפוטנטיות מרכזיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של רגולטורים של פלוריפוטנטיות כגון OCT4, SOX2 ו-NANOG באמצעות מערכות תרבית תלויות-תאי מאכיל (feeder-dependent).
- ערך תפעולי: מספק מקור סטנדרטי של תאי מאכיל התומך בתחזוקה עקבית של תאי גזע לצורך סריקת מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: הערכת איכות של מצע מותנה באמצעות Activin A ELISA מאפשרת ניטור כמותי של תפקוד תאי המזין (feeder cells).
- ערך תפעולי: מאפשר עקביות בין סדרות ייצור שונות בתנאי תרבית של תאי גזע, ובכך משפר את השחזוריות של הבדיקות לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול רלוונטי למחלה על ידי שמירה על יציבות גנטית ואפיגנטית של hESCs ו-hiPSCs במהלך הרחבה.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור בר-הרחבה של תאים פלוריפוטנטיים למחקרי דיפרנציאציה ובדיקות יעילות פרה-קליניות.
שילוב תהליכים וזרימות עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת תהליך מקדימה הניתן לשחזור ליצירת שכבות תאי מאכיל (feeder layers) התואמות לתאי גזע, דבר התומך ביישומים המשכיים של תיקוף מטרה וזיהוי מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי ויסות של מסלולי פלוריפוטנטיות באמצעות תרבית משותפת מבוקרת של תאי מאכיל (feeder cells).
- סריקה: מספקת מצעים תאיים סטנדרטיים המפחיתים רעשים במבחני סריקה של תרכובות המערבים מודלים המופקים מתאי גזע.
- אנליטיקה: כימות של Activin A בתווך מותנה (conditioned medium) מספק סמן ביולוגי מדיד לשחרור מנת תאי מאכיל ולבקרת תהליך.
- מחקר תרגומי: שומר על נאמנות תאית משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים על ידי מניעת התמיינות ספונטנית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך הניתן לשימוש חוזר של בנקאות תאים והתניה, הישים על פני מספר פרויקטים של תאי גזע.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתוצאות החיזוי בניסויי תאי גזע על ידי מזעור השונות הקשורה לתאי המזינים (feeder cells).
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבים מוגדרים לבידוד, השבתה והכנה של MEF.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות המשך (go/no-go) בקידום פרויקטים של תאי גזע על ידי הבטחת אמינות מערכת התרבית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר הקצאת משאבים מותאמת סיכון על ידי הפחתת שיעורי הכישלון בתחזוקת תאי גזע.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה אספטית של רקמות וטיפול בעוברים.
- תלוי בגישה לעכברי נקבה בהריון מתואם ובמתקנים לבידוד עוברים.
- מחייב כלי תרבית מצופים בג'לטין ו-mitomycin C לשם השבתת תאי מאכלה (feeder cells).
- דורש תשתית ELISA לכימות של Activin A במדיום מותנה.
- מוגבל על ידי יכולת ההתרבות הסופית של MEFs ראשוניים (בדרך כלל P3–P4).
