שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד

מטרת ניסוי זה היא להעריך את יעילותם של אנטיביוטיקה נגד ביופילמים של pseudomonas Aerogen, בתנאים המייצגים זיהומים כרוניים בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס, תוך שימוש בתווך ליחה מלאכותי מוגדר. ביופילמים חיידקיים גודלים בלוחות מיקרוטיטר של 24 בארות.

לאחר מכן, הביופילמים נחשפים לאנטיביוטיקה. בשלב הבא, תרביות שעובדו באנטיביוטיקה מפורקות באמצעות cellulase ומודגרו עם צבע מטבולי srin, אשר מוסמך מסיני לכספר על ידי תאים חיים. על ידי מדידת הבליעה של הבארות, ניתן לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי של תאי הביופילם (B-S-M-I-C) כדי לכמת את הרגישות לאנטיביוטיקה בתנאים דמויי פיזיולוגיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קביעת ריכוזים עיכובים מינימליים המבוססים על תרבית פלנקטונית, הוא שהחיידקים גדלים במצע ייעודי המכיל את כל רכיבי הליחה, ובכך מקדמים היווצרות של ביופילם. ביופילמים אלו עמידים הרבה יותר לאנטיביוטיקה. להכנת המצע, הכין תחילה שני בקבוקים המכילים 250 milliliters של מים סטריליים בבקבוק הראשון.

הוסף בהדרגה את הבחישה ולאחר מכן הוסף ארבעה גרם של DNA מזרע דגים ל-250 milliliters של מים סטריליים. ערבב את התמיסה בטמפרטורת החדר ואפשר ל-DNA להתמוסס בבקבוק השני. הוסף בהדרגה חמישה גרם של מוצין מסוג 2 מקיבה של חזיר וערבב.

לאחר שהתמיסות של ה-DNA והמוצין מוכנות, המיסו את החומצות האמינויות ב-100 מיליליטר של מים סטריליים, למעט L tyrosine ו-L cysteine, אותן יש להמיס ב-25 מיליליטר של מים או ב-25 מיליליטר של potassium hydroxide בריכוז 0.5 molar, בהתאמה. לאחר מכן, המיסו 5.9 מיליגרם של DTPA, חמישה גרם של sodium chloride ו-2.2 גרם של potassium chloride ב-100 מיליליטר של מים. ערבבו את כל התמיסות השונות בבקבוק של ליטר אחד, הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסות חלמון ביצה, והשלימו את התערובת למשקל של 850 מיליליטר באמצעות מים.

בעזרת Tris בריכוז של מולרי אחד, כוון את ה-pH ל-6.9 והשלם את הנפח הסופי לליטר אחד באמצעות מים. כדי לעקר את המצע, סנן אותו באמצעות משאבת ואקום דו-דיאפרגמה מדגם ME של חברת Vacuum ויחידת סינון Stericup של Millipore עם פיה של 45 מילימטר וגודל נקבים של 0.2 מיקרון. ניתן לבצע את תהליך הסינון לאורך יומיים. ניתן לשמור את מצע A SM בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.

התחילו בדילול של תרביות לילה של *Pseudomonas arosa* במצע LB כדי להגיע לערך OD של 0.05. לאחר מכן, דללו את החיידקים שוב ביחס של 1:100 בצלחת עם מצע SM, על ידי העברה של 1.8 מיליליטר של תרבית חיידקים מדוללת ל-21 בארות בצלחת תרביות רקמה בעלת 24 בארות. העבירו את אותו הנפח של מצע SM לשלוש הבארות שנותרו, שישמשו כביקורות שליליות (blanks). אטמו את הצלחת בעלת 24 הבארות, וכדי לאפשר את היווצרות הביופילם, הניחו אותה בתנאים מיקרו-אנרוביים, אותם ניתן להשיג באמצעות ערכות CMPGen ליצירת גז בתוך צנצנות אנרוביות גדולות.

דגרו את התרבית במנער המכוון ל-75 RPM למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שלושה ימים, הביופילמים יופיעו כמסה ג'לטינית המכילה תאי חיידקים ולא ניתן יהיה להפרידם באמצעות פיפטינג. ברגע שהביופילמים נוצרו, הוסיפו 200 µL של אנטיביוטיקה בריכוזים מדוללים סדרתית לכל באער. הקפידו להכין לפחות ארבע חזרות עבור כל ריכוז תרופה הנבדק, והשאירו ארבע באערים המכילים ביופילמים ללא טיפול, כדי שיוכלו לשמש כביקורות שליליות.

לאחר מכן, דגרו את הפלטות למשך 24 שעות נוספות בעקבות הדגירה עם האנטיביוטיקה. השתמשו ב-100 µL למבב של cellulase המדולל ל-100 mg/mL בבופר ציטראט לפירוק הביופילמים; דגרו את הפלטות על מנער שמוגדר ל-150 RPM בתנאי אירובי ב-37 °C למשך שעה אחת. לאחר דגירה זו, ניתן להשתמש בפיפוט ידני כדי לפרק את הביופילמים הלאה אם נראים גושי תאים במצע.

בשלב הבא, הוסף 100 µL של rezin לכל באר כדי לכמת את חיות התאים ששוחררו מהביופלמים, והדגר את התאים למשך שעה עד שעתיים. בטמפרטורה של 37 °C, רק תאים חיים מסוגלים להמיר מטבולית את צבע ה-zarin הכחול לצורתו הפלואורסצנטית הוורודה. לאחר ההדגרה, העבר את הדגימות לצלחת 96 בארות ומדוד את הפלואורסצנציה של הבארות באמצעות אורך גל עירור של 540 nm ואורך גל פליטה של 590 nm.

על מנת לכמת את חיוניות החיידקים ואת הרגישות לתרופות, ראשית, הפחיתו את פלואורסצנציית הרקע של בקרת הריק מהבארים האחרות. לאחר מכן, חשבו את אחוז העכבה על ידי חלוקת הפלואורסצנציה הממוצעת עבור כל ריכוז בפלואורסצנציה הממוצעת של הבקרות שלא טופלו, והכפלה ב-100. ה-B-S-M-Y-C מוגדר כריכוז האנטיביוטיקה הגורם לעכבה של 90% של הפעילות המטבולית, כפי שמוצג במיקרוגרפים אלקטרוניים אלה; תאים הגדלים בביופילמים שונים באופןconsiderable מחיידקים הגדלים בתרביות פלנקטוניות.

בפרט, כמויות גדולות של מטריקס חוץ-תאי המוצג בצהוב מקיפות את התאים בביופילם המוצג בירוק, אך לא במושבות פלנקטוניות. בנוסף, חיידקים בביופילמים הם בדרך כלל עמידים יותר לאנטיביוטיקה בניסוי זה. ריכוז העכבה המינימלי של tobramycin עבור תרבית פלנקטונית של pseudomonas aerogen המוצגת בכחול נקבע כ-4 µg/mL בקירוב.

בניגוד לכך, כפי שמוצג בצבע אדום, 100% מהחיידקים בביופילמים שרדו ריכוז של עד 512 micrograms per milliliter של אנטיביוטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן תרבית החיידקים במצע ליחה מלאכותי מוגדר. כמו כן, אתם תהיו מסוגלים לבצע בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה כדי לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי הדרוש לעיכוב צמיחה חיידקית בסביבה המדמה באופן מציאותי יותר את הריאה בסיסטיק פיברוזיס.