שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד
5 ביוני 2012
בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.
המטרה של ניסוי זה היא להעריך את יעילות האנטיביוטיקה נגד ביופילמים של פסאודומונס אירוג'ן, בתנאים, המייצגים זיהומים כרוניים בריאות הסיסטיק פיברוזיס תוך שימוש במדיום כיח מלאכותי מוגדר. ביופילמים חיידקיים גדלים בצלחות מיקרוטיטר של 24 באר.
לאחר מכן, הביופילמים נחשפים לאנטיביוטיקה. לאחר מכן, תרבויות המטופלות באנטיביוטיקה מופרעות באמצעות צלולאז ומושרשות עם צבע מטבולי סרין, אשר מצטמצם מכחול לורוד על ידי תאים חיים. על ידי מדידת הספיגה של הבארות, ניתן לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי של התאים החיידקיים בסל על מנת לכמת את הרגישות לאנטיביוטיקה בתנאים פיזיולוגיים כמעט.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על שיטות קיימות, כמו קביעת ריכוזים מעכבים מינימליים המבוססים על תרבית פלנקטונית, הוא שהחיידקים גדלים במדיום מיוחד המכיל את כל רכיבי הכיח, ובכך מקדמים היווצרות ביופילמים. ביופילמים אלו עמידים יותר לאנטיביוטיקה. כדי להכין את המדיום, ראשית הכינו שתי בקבוקים המכילים 250 מיליליטר מים סטריליים בבקבוק הראשון.
הוסיפו בהדרגה את התערובת ואז הוסיפו ארבעה גרם של DNA מזרע דגים ל-250 מיליליטר מים סטריליים. ערבבו את התמיסה בטמפרטורת החדר והניחו ל-DNA להתמוסס לבקבוק השני. הוסיפו בהדרגה חמישה גרם של מיוצין מסוג שתיים מבטן חזיר ותירבו.
לאחר שפתרונות ה-DNA והמיוצין מוכנים, המיסו את חומצות האמינו ב-100 מיליליטר מים סטריליים, למעט L טירוזין ו-L ציסטאין, אשר יש להמיסם ב-25 מיליליטר מים, או ב-25 מיליליטר של 0.5 מולרי מי חמצן אשלגן בהתאמה. לאחר מכן, הכינו 5.9 מיליגרם של DTPA, חמישה גרם של נתרן כלורי ו-2.2 גרם של אשלגן כלורי ב-100 מיליליטר מים. שלבו את כל הפתרונות השונים בבקבוק ליטר אחד, ואז הוסיפו חמישה מיליליטר של תחליב חלמון ביצה, והשלמו את התערובת עד 850 מיליליטר עם מים.
השתמשו בטריס מולארי אחד, התאמו את ה-pH ל-6.9 והביאו את הנפח הסופי לליטר אחד עם מים כדי לעקר את המדיום, סננו אותו באמצעות משאבת ואקום מותג ME שתי ממברנות, ופילטר עליון מיליבור עם צוואר של 45 מילימטר וגודל נקבובי של 0.2 מיקרון. ניתן לבצע את תהליך הסינון לאורך יומיים. ניתן לאחסן את מדיום ה-A SM בארבע מעלות צלזיוס עד חודש.
התחילו בדילול תרבית פסאודומונס ארוזה מן הלילה במדיום LB על מנת להשיג OD של 0.05. לאחר מכן, דיללו עוד את החיידקים באחד ל-100 במדיום SM בצלחת, 1.8 מיליליטר לבאר של תרבות חיידקים מדוללת ב-21 בארות של צלחת תרבית רקמות 24 באר, חלקו נפח זהה של מדיום SM בשלוש הבארות הנותרות, אשר ישמשו כשליטה שלילית ריקה. אבטחו את צלחת ה-24 באר עם ביופילם, וכדי לאפשר את היווצרות הביופילמים, הניחו אותה בתנאים של מיקרו ארובי, אותם ניתן להשיג באמצעות חבילות ייצור גז קמפיגן בצנצנות אנארוביות גדולות.
דגרו את התרבות על שייקר שהוגדר ל-75 RPM במשך שלושה ימים ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שלושה ימים, הביופילמים יופיעו כמסה ג'לטינית המכילה תאים חיידקיים ולא ניתן להפרידם על ידי פיפטה. לאחר שהביופילמים נוצרו, הוסיפו 200 מיקרוליטר לבאר של אנטיביוטיקה בריכוזים מדוללים באופן סדרתי. הקפידו להגדיר לפחות ארבעה העתקים לכל ריכוז תרופתי לבדיקה והשאירו ארבע בארות המכילות ביופילמים ללא טיפול, כך שניתן יהיה להשתמש בהם כשליטות שליליות.
לאחר מכן, דגרו את הצלחות הקודמות למשך 24 שעות נוספות לאחר הדגרה עם אנטיביוטיקה. השתמשו ב-100 מיקרוליטר לבאר של צלולאז שדולל ל-100 מיליגרם למיליליטר במאגר ציטרט כדי לפרק את הביופילמים, דגרו את הצלחות על שייקר שהוגדר ל-150 RPM בתנאים אירוביים ב-37
Overview
This study investigates the antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms using an artificial sputum medium that mimics conditions in the cystic fibrosis lung. The research highlights the differences in antibiotic resistance between biofilm and planktonic cultures.
Key Study Components
Area of Science
- Microbiology
- Antimicrobial resistance
- Biofilm research
Background
- Current methods for testing antibiotic susceptibility focus on planktonic bacteria.
- Pseudomonas aeruginosa is a common pathogen in cystic fibrosis patients.
- Biofilms are known to exhibit increased resistance to antibiotics.
- Artificial sputum medium can better simulate the cystic fibrosis lung environment.
Purpose of Study
- To assess the efficacy of antibiotics against Pseudomonas aeruginosa biofilms.
- To utilize a defined artificial sputum medium for more accurate testing conditions.
- To compare the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics in biofilm versus planktonic cultures.
Methods Used
- Biofilms were grown in 24-well microtiter plates under aerobic and microaerophilic conditions.
- Antibiotics were applied to the biofilms, followed by disruption using cellulase.
- Cell viability was assessed using a metabolic dye that indicates live cells.
- Fluorescence measurements were taken to determine antibiotic susceptibility.
Main Results
- Biofilms showed significantly higher resistance to antibiotics compared to planktonic cultures.
- The minimum inhibitory concentration for tobramycin was much higher in biofilms.
- Extracellular matrix presence was noted in biofilms, contributing to resistance.
- The study provides a reliable method for testing antibiotic efficacy in biofilm conditions.
Conclusions
- The artificial sputum medium is effective for studying biofilm antibiotic susceptibility.
- Biofilms present a unique challenge in treating chronic infections in cystic fibrosis.
- Future research should focus on overcoming biofilm-associated antibiotic resistance.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Preparation of Artificial Sputum Medium (ASM) for Biofilm Cultures
3:14
Determination of Biofilm Sessile Cell Minimum Inhibitory Concentration (BSMIC)
6:22
Results: Properties and Antibacterial Resistance of P. aeruginosa Biofilms or Planktonic Cultures
7:17
Conclusion
