Name: ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: למדו להביע ולטהר חלבון CFTR ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות תיוג GFP. שיטה זו מאפשרת ייצור כמויות מיליגרם של חלבון קרום אוקריוטי לחקר סיסטיק פיברוזיס ופיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סיסטיק פיברוזיס קרן (CFF) למימון עבודה זו דרך CFTR Consortium שלה מבנה 3D (מספר מענק FORD08XX0). אנו מכירים את התרומה הענקית של כל עמיתינו בתוך Consortium לעבודה זו, בעיקר בעיצוב של הגנים CFTR. כמו כן, אנו מכירים את תרומתם שלא תסולא בפז של בני הזוג. ג&#39;יימס Birtley (NCSR Demokritos, יוון), מארק יאנג (אוניברסיטת קרדיף, אנגליה) ודוד דרו (אימפריאל קולג&#39;, לונדון, בריטניה) בשלבים המוקדמים של העבודה. אנחנו במיוחד להודות לד&quot;ר אינה Urbatsch (טקסס טק. אוניברסיטת Lubbock) לקריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

מאמר זה מספק שיטה ביטוי של חלבון CFTR Murine בתאי שמרים, שאמור להקל על מחקר על סיסטיק פיברוזיס. המטרה היא לקשר את הנייר עם שחרורו של Murine CFTR מבנה ה-DNA, אשר יהיה זמין דרך סיסטיק פיברוזיס קרן ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Orthologs אחר צריך להיות זמין במועד מאוחר יותר. טרנספורמציה של תאים שמרים עם וקטור המכיל CFTR היא פשוטה, אך חשוב למסך המושבות המבטאים רמות גבוהות של CFTR. רמות הביטוי משתנים עשוי לנבוע ממספר גורמים, אבל מספר העותקים של התא לכל פלסמיד כנראה אחראית במידה לא מבוטלת של וריאציה. השלבים הקריטיים המתוארים כאן אמור לאפשר ייצור של CFTR-לבטא בתאי שמרים CFTR, המכילים ממברנות microsomal. לאחר השינוי, הצמיחה, קציר תמוגה של תאים שמרים כבר שולט, purification של החלבון צריך להיות אפשרי, באיור 3 נתנו דוגמה של טוהר, כי צריך להיות בר השגה במקרה זה כאמת מידה שימושי. אין בכוונתנו בכתב היד הזה כדי לספק מתודולוגיה מפורטת טיהור של החלבון. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים טיהור במורד הזרם ספציפיים במערכת ביטוי S.cerevisae, כגון תמוגה התא וטיהור גופיפון, ואלה נכללו בפירוט כתב היד הזה. יש לציין, עם זאת, כי מלבד שתי השיטות בהן השתמשנו, שיטות חלופיות תא שמרים שיבוש יכול להיות מועסק, כגון שימוש של תא הלחץ הצרפתי. חלבון רקומביננטי יש TeV-cleavable בטרמינל C-GFP מושלם המאפשר לחלבון להיות במעקב אחרי הגיוס (איור 4). שמרים יש חלבון 70kDa פנימי (כנראה succinate dehydrogenase 12), מאיר, בתנאים זהים 11, וזה יכול לספק בין שימושיכיול סטנדרטי NAL את רמות הביטוי היחסיות של CFTR של תמציות תאים או microsomes שלמים (איור 3). ברור מהנתונים שמוצג בתרשים 4, כי העיתוי של קצירת התא לאחר אינדוקציה עם גלקטוז הוא קריטי. תשואות ירידה CFTR בתלילות לאחר שעות על 16 האינדוקציה, כך שיש כמעט בכל CFTR להבחין בתאי שמרים לאחר 24 שעות של אינדוקציה. תשואה של חלבונים מטוהרים הוא על חלבון 1 2mg-CFTR לכל תרבות fermenter 15 ליטר. השחזור ניתן להעריך גם על 70% של חלבון CFTR-GFP הכולל עד שלב גופיפון, והתאוששות על 25% מטוהרים חלבון. אפיון של ס &#39; cerevisiae, הביע CFTR היא מתמשכת. כפי שניתן לראות באיור. 4, מיקום של חלבונים בתוך התא יכול להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אמנם רוב הקרינה נמצא סביב בפריפריה של התא כמו 10 הצפויה, כמה חלבון מציג לוקליזציה punctate, או, אורק בתוך קרום הפלזמה אשר יכול להיות בגלל CFTR מיחזור דרך מסלול Golgi / endosomal בסוף 14 או אולי במורד הזרם של תא נביטה של שלפוחית ​​התחבורה של ER 4. טיפול PNGaseF, אנזים deglycosylates חלבונים, הראה שינוי מינימלי ההגירה של הלהקה חלבון CFTR על SDS-PAGE, רומז כי הוא unglycosylated, או שיש לו glycosylation מינימלי 15. ניסויים המדינה זירחון של חלבון נמצאים בעיצומם. בכמה חומרי ניקוי שנבדקו עד כה, חלבונים מטוהרים מציג פעילות ATPase (כי הוא עצור על ידי מעכבי CFTR ספציפי 16) במחירים דומים לאלה שפורסמו בעבר 2,15. מדידה של פעילות הערוץ CFTR ידרוש הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים, שפירושה צעד לטיהור הסופי חומר ניקוי בעל ריכוז גבוה יחסית קריטי micelle (CMC) 17. שמרים microsomes containinגרם CFTR ניתן solublised עם חומרי ניקוי המועסקים בדרך כלל מספר 18, כולל חומרי ניקוי כגון dodecyl maltoside 2, אשר נחשבים בדרך כלל להיות &quot;מתונה&quot;. אולם חומרי ניקוי CMC עליון הוכיחו להיות יעיל עבור solubilsation, עד כה, טוען כי חילופי לתוך חומרי ניקוי אלה יש לשקול בשלב מאוחר בתוכנית כלשהי טיהור.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> לא קטלוג </td></tr><tr><td> FGY217 זן S.cerevisiae, עם המחיקה pep4 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> השלם את התערובת ללא תוספת אורציל </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> בקטריולוגית אגר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-גלקטוז </td><td> דיג </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> דיג </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> מרק </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido, בוטאן (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl פלואוריד (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidine hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) </td><td> דיג </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> טריס-HCl </td><td> דיג </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-סורביטול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> N-dodecyl-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler פלוס סטנדרטים חלבון prestained </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep טריס, גלאי שיפוע ג&#39;ל 4-20% </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> כתם כחול מיידית Coomassie </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> חרוזי זכוכית, מולבן </td><td> סיגמא </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל מעוקרות פלקון צינורות </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlעקרות פקק הברגה בקבוקונים </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250 מ&quot;ל סטרילי Erlenmeyer צלוחיות המבולבלות </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer סטרילי 2L מבולבל צלוחיות </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> Microfuge צינורות 2ml </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μM מזרק מסנן </td><td> סארטוריוס </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultracentrifuge צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> צנטריפוגות צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> צנטריפוגות סירים 1 ליטר </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital רועד חממה עם בקרת טמפרטורה </td><td> ניו ברונסוויק מדעי </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision RT מיקרוסקופ שיקום </td><td> יישומי חזון </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop צנטריפוגות </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Benchtop microfuge </td><td> דיג </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> וורטקס מערבל </td><td> כוכב Labs </td><td></td></tr><tr><td> טייפון סורק טריו </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 הדמיה המערכת </td><td> פוג&#39;י </td><td></td></tr><tr><td> Fermenter כלי 20l ואת יחידת הבקרה </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> הסלולרי משבש מערכות מתמיד </td><td> קבועים מערכות </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater משבש סלולרי </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> מיני beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> אופטימה L-100 ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) הוא ערוץ כלוריד, כי כאשר מוטציה, יכול להצמיח סיסטיק פיברוזיס ב humans.There ולכן עניין רב חלבון זה, אבל המאמצים ללמוד את המבנה שלה ואת הפעילות כבר הקשו על ידי קושי להביע וטיהור כמות מספקת של חלבון 1-3. כמו הרבה חלבונים &quot;קשה&quot; קרום האיקריוטים, ביטוי באורגניזם בצמיחה מהירה רצוי, אבל מאתגר, וגם את השמרים ס cerevisiae, עד כה התקבלו סכומים נמוכים והשפלה מהיר של חלבון רקומביננטי נצפתה 4-9. חלבונים המעורבים בעיבוד של CFTR רקומביננטי בשמרים תוארו 6-9. בדו&quot;ח זה אנו מתארים מתודולוגיה ביטוי CFTR בשמרים וטיהור שלה בכמויות משמעותיות. הפרוטוקול מתאר כיצד הבעיות proteolysis קודמות ניתן להתגבר וכיצד רמות הביטוי שלCFTR ניתן לשפר באופן משמעותי את הצמיחה על ידי שינוי תנאי התא על ידי שליטה בתנאי אינדוקציה, בתקופת זמן מסוימת לפני קצירת התא. את reagants הקשורות לפרוטוקול זה (Murine CFTR-לבטא בתאי שמרים או פלסמידים שמרים) יופץ באמצעות פיברוזיס סיסטיק ארה&quot;ב קרן, אשר מימנה את המחקר. מאמר המתאר את עיצוב וסינתזה של CFTR לבנות המועסקים דו&quot;ח זה יפורסם בנפרד (Urbatsch, י,. Thibodeau, פ ואח&#39;, לא פורסם). במאמר זה נסביר תחילת השיטה שלנו עם המעבר של התאים שמרים עם CFTR לבנות - השמרים המכיל פלסמיד (איור 1). יש לבנות את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רצף התמזגו כדי CFTR בתחנה הסופית C-שלה מלווה את המערכת שפותחה על ידי דרו et al. (2008) 10. GFP מאפשר ביטוי וטיהור של CFTR להיות אחריו בקלות יחסית. Protoc יופיטר דמיינוגימורים ol לאחר הכנת microsomes מן בתאי שמרים, אם כי אנו כוללים מספר הצעות טיהור של חלבון מן microsomes את. לקוראים מומלץ להוסיף שינויים משלהם הליך טיהור גופיפון, תלוי את הניסויים הסופיים להתבצע עם חלבון ו ציוד המקומית לרשותם. שמרים לידי ביטוי חלבון CFTR יכול להיות מטוהרים באופן חלקי מתכת באמצעות יונים זיקה כרומטוגרפיה, באמצעות תג פנימי לטיהור polyhistidine. כרומטוגרפיה לאחר בגודל הדרה מניב חלבון נראה&gt; 90% טהור, נשפט על ידי SDS-PAGE ו-Coomassie מכתים של ג&#39;ל.

ניסיונות להביע סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; יש, עד כה, הניב כמויות נמוכות יחסית של חלבון. זה פרוטוקול של חומרים כימיים הקשורים מופץ באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס צריך לאפשר הכנת כמויות מיליגרם של זה &quot;קשה&quot; חלבון הקרום האיקריוטים.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

הווסת של מוליכות קרומית בסיסטיק פיברוזיס (CFTR) הוא תעלת כלוריד, אשר כאשר היא מוטציה, עלולה להוביל לסיסטיק פיברוזיס ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבטא כמויות של מיליגרמים של חלבון CFTR ב-Charmy Visier. זאת על ידי בחירה ראשונית של מושבות TRANSFORMANT לניסויי גידול וביטוי בתרביות תאים של 50 מיליליטר. לאחר מכן, מזהים את התאים ואת המושבות המבטאות CFTR.לאחר מכן, המושבות בעלות ביטוי ה-CFTR הגבוה ביותר גדלו בתרבית בפרמנטור בנפח של 15 ליטר. לבסוף, הופקו ליזיס של התאים ומיקרוזומים המכילים CFTR. בסופו של דבר, התוצאות מראות ביטוי ומיצוי של CFTR המחובר ל-GFP באמצעות פלואורסצנציית Ingel ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לביטוי של CFTR הוא שהיא משתמשת במאחס אוקריוטי פשוט, זול, מהיר וקל לגידול. היא כוללת תג של חלבון פלואורסצנטי ירוק המאפשר ניטור מהיר של רמות הביטוי. ולבסוף, שלבי הביולוגיה המולקולרית ממוזערים בפרוצדורה זו.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של סיסטיק פיברוזיס, כגון התכונות הביופיזיות של חלבון ה-CFTR. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסיסטיק פיברוזיס כיוון שהיא עשויה להוביל לסריקות תרופות חדשות המבוססות על החלבון המזוקק. קטגוריות חדשות של תרופות עשויות לנבוע מתרופות אלו, אשר מקיימות אינטראקציה ישירה עם החלבון.הפגם העיקרי בסיסטיק פיברוזיס צריך להיות ספציפי יותר ובעל פוטנציאל לאפקטים פליאוטרופיים מעטים יותר. יתרה מכך, טיהור של כמויות גדולות של החלבון הוא חשוב להשגת מבנה ברזולוציה גבוהה עבור ה-CFTR. תכנון תרופות המבוסס על מבנה החלבון אמור לשפר תרופות קיימות ולהוביל פוטנציאלית לגילוי תרופות חדשות.פרסום מאמר זה והסרטון הנלווה לו מקושרים לשחרור DNA או תאים שעברו טרנספורמציה באמצעות ה-Cystic Fibrosis Foundation. אם ברצונך להשיג חומרים אלו, אנא פנה ל-Elizabeth Joof ב-Cystic Fibrosis Foundation. יהיה עליך להשלים הסכם העברת חומרים (MTA).שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי השימוש בתג A GFP לביטוי של חלבוני ממברנה, כפי שהוצגה על ידי דייוויד דרו ועמיתיו ב-Imperial College London. אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים בשלב הטרנספורמציה. יעילות הטרנספורמציה עשויה להיות נמוכה, ומועד קציר התאים הוא קריטי כדי להשיג רמות ביטוי טובות.קיבלנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו במהלך ביקור של David Drew וצוותו במעבדה שלנו. הם ביצעו מחקרים מבניים על חלבונים מממברנה שהם הביעו וניקו משמרים באמצעות מערכת זו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן טרנספורמציה של תאים, צמיחת תאים לאחר אינדוקציה ובידוד מיקרוסומים הם תהליכים מורכבים, כפי שמופיע בפרסום המקושר לשחרור של ריאגנט.הסרטון יעזור גם בסטנדרטיזציה של הפרוטוקול כדי שמעבדות שונות יוכלו להשוות את תוצאותיהן. מי שידגימו את ההליך הן Tracy Remington ו-Natasha Kant, שתיהן סטודנטיות לתואר שני במעבדה שלנו. Liam o Ryan, המחבר השותף השני במאמר, נמצא כעת בניו זילנד ולא יכול היה להשתתף בהדגמה. לאחר טרנספורמציה של זן שמרים FGY 2 1 7 עם פלסמיד של שמרים המקודד לגן C-F-T-R-G-F-P eight hiss, בחרו חמש עד 10 מושבות מופרדות היטב מלוח הטרנספורמציה.העבירו כל מושבה לשפופרת Falcon סטרילית נפרדת בנפח 50 milliliter המכילה תשעה milliliters של מצע yeast nitrogen base או מצע YNB ומיליליטר אחד של glucose. גדלו את התרביות למשך לילה, כ-16 שעות, ב-250 RPM וב-30 degrees Celsius באינקובטור עם ניעור אורביטלי כדי להכין מאגרי גליצרול עבור כל אחת מהמושבות שנסרקו. הוסיפו באופן אספטי 0.8 milliliters מהתרביות של הלילה ל-0.2 milliliters של גליצרול סטרילי בתוך מבחנות עם פקק הברגה מסומנות.ערבבו קצרות במיקסר (Vortex) ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. דללו את שאר תרביות הלילה לנפח סופי של 50 milliliters ב-YMB עם 250 microliters של תמיסת גלוקוז. גדלו את התרביות בבקבוקי ארלנמאייר עם דפנות פנימיות (baffled flasks) בנפח של 250 milliliters, עד להגעה ל-OD 600 של 0.7 עד 0.8, במהירות של 250 RPM ובטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור עם ניעור אורביטלי. גרו את התרביות על ידי הוספה של 5 milliliters של תמיסת גלקטוז לכל בקבוק. הפחיתו את טמפרטורת האינקובטור ל-25 מעלות צלזיוס והמשיכו בגידול למשך 16 שעות במהלך הלילה.העבירו את התרביות למבחנות פלקון של 50 milliliter. אספו את התאים על ידי סרקיגציה במהירות של 3,500 times G בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך 10 דקות בצנטריפוגה שולחנית בזמן שהיא פועלת. הכינו מבחנות מיקרו-צנטריפוגה עם מכסה הברגה של שניים milliliters המכילות כ-300 microliters של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה והניחו אותן על קרח.שפכו את העל-נוזלים (supernatants) ותלו את כל משקע ב-800 µL של תמיסת ריסוס תאים (cell Resus suspension buffer) או CRB מקוררת על קרח עם מעכבי פרוטאז. העבירו את התליים למבחנות מיקרו centrifuge ושמרו אותם על קרח. העבירו את התאים לתוך mini bead beater והפעילו למשך שלוש דקות.הניחו את המבחנות במיקרו-צנטריפוגה שולחנית וסובבו ב-3,500 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך חמש דקות. העבירו את העל-נוזלים המכילים את הממברנות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נקיות והניחו על קרח. אספו את הממברנות הגולמיות על ידי סבוב במהירות מקסימלית בטמפרטורה של 4°C במיקרו-צנטריפוגה שולחנית למשך שעתיים.שפכו את הנוזל העליון והשעיו כל משקע ב-50 µL של בופר CFTR קר בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה נקיות. ערבבו 15 µL מכל תרחף עם 15 µL של צבע טעינה בריכוז פי 2 באמצעות פיפטור.אין להרתיח את הדגימות, שכן הדבר יגרום ל-CFTR ולחלבוני ממברנה אחרים ליצור אגרגטים שאינם מסימים ב-SDS, וכן יגרום לדנטורציה של תג ה-GFP. טענו את הדגימות וכן סולם חלבונים צבוע מראש על ג'ל עם גרדיאנט גליצין של 4% עד 20%, והריצו אותו ב-150 וולט למשך 40 דקות. לאחר ביצוע פלואורסצנציה בתוך הג'ל (in-gel fluorescence) כדי לזהות את התאים בעלי רמת הביטוי הגבוהה ביותר, ואימות הביטוי באמצעות צביעת Coomassie, בצעו מריחה של שורת התאים בעלת הביטוי הגבוה ביותר מתוך מאגר הגליצרול שלהם על צלחת YNBA טרייה, והדגירו ב-30 degrees Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים.אחסנו את המצע למשך עד שבועיים בטמפרטורה של 4 °C כדי להכין תרביות מקדימות עבור הפרמנטור. השתמשו בלולאה סטרילית כדי לגרד שטח של סמימטר רבוע של תאים ממעט A-Y-N-B-A והוסיפו ל-45 milliliters של YMB ול-5 milliliters של מצע גלוקוז כדי להגיע ל-OD 600 של כ-0.1. גדלו את התרביות ב-250 RPM ובטמפרטורה של 30 °C באינקובטור עם ניעור אורביטלי עד שה-OD 600 מגיע ל-1.חלק את התרבית בין שני בקבוקי ארלנמאייר עם דפנות (baffled flasks) בנפח של שני ליטרים, שכל אחד מהם מכיל 450 milliliters של מצע YMB ו-25 milliliters של גלוקוז. גדל את המצע למשך לילה במהירות של 250 RPM בטמפרטורה של 30 degrees Celsius באינקובטור עם ניעור אורביטלי עד שה-OD 600 מגיע ל-1.2. להכנת הפרמנטור, הכן 11.2 liters של YNB והוסף 8.28 grams נוספים של YNB ו-0.95 grams של תוספת dropout כדי לפצות על הוספת הגליצרול בזמן האינדוקציה.לאחר מכן, הוסיפו באופן אספטי 11.2 ליטרים של YNB ו-75 מיליליטרים של מצע גלוקוז למכל פרמנטור סטרילי בנפח 20 ליטרים, וכווןנו את טמפרטורת העבודה ל-30 °C. לאחר מכן, הוסיפו באופן אספטי את תרביות ההקדמה (pre cultures) לפרמנטור. הגדירו את מהירות הערבוב לכ-800 RPM וכוונו את זרימת האוויר הדחוס לכ-15 dm³ per minute.כאשר התרבית מגיעה ל-OD 600 של 1.2, בצע השראה על ידי הוספה אספטית של 1.5 ליטרים של מצע גלקטוז ו-1.2 ליטרים של גליצרין. הפחת את הטמפרטורה ל-25 °C ואפשר לתרבית לגדול במשך 16 שעות באמצעות משאבה פריסטלטית. העבר את התרבית למבחנות צנטריפוגה מקוררות בנפח של ליטר אחד על קרח.יש לקצור את התאים על ידי סנטריפוגציה למשך 30 דקות ב-3,500 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש להשעות מחדש את התאים ב-150 milliliters של micro zone Resus suspension buffer קר בקרח או MRB עם מעכבי פרוטאז ו-1 millimolar DTT. מנקודה זו ואילך, יש לבצע את כל העבודה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השתמש במכשיר לפירוק תאים כדי ללייס את התאים.לאחר מכן, העבירו את הליזאטים למבחנות פלקון בנפח 50 milliliters והשקיפו את שיירי התאים באמצעות סבוב בצנטריפוגה ב-3,500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות. כדי להסיר מיטוכונדריה, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות צנטריפוגה מקוררות, וסובבו ב-14,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, לאיסוף מיקרוסומים, העבירו את הנוזל העליון למבחנות אולטרה-צנטריפוגה מקוררות וסובבו ב-200,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 90 דקות.שפכו בזהירות והסירו את הנוזל העליון והוסיפו שתי מיליליטר (2 mL) של באפר CFTR קר מאוד עם מעכבי פרוטאז ו-1 mM DTT לכל מבחנה. באמצעות מברשת צבע, השביו בעדינות את המשקעים. לאחר מכן, מלאו כל מבחנה בבאפר CFTR וערבבו במכשיר וורטקס. סבבו את התו suspension בצנטריפוגה במהירות של 100,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 60 דקות.שפכו את העליון (supnatant) והשתמשו במברשת צבע כדי לחזור על תהליך השסעוף (resuspension) בשני מיליליטר של CFTR buffer קר בקרח עם מעכבי פרוטאז ו-1 mM DTT. שאבו את המיקרוסומים שנשסעפו, ולאחר מכן התאימו את הנפח הסופי ל-50 מיליליטר באמצעות CFTR buffer וערבבו היטב. השאירו מנה (aliquot) של מיליליטר אחד עבור SDS page ואחסנו את המיקרוסומים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד מיצוי ה-CFTR מהמיקרוסומים.יש לעיין בפרוטוקול הכתוב. טרנספורמציה של שמרים עם הפלסמיד המכיל את CFTR אינה יעילה ב-100%. סריקה מייצגת בקנה מידה קטן של ביטוי CFTR במושבות נבחרות מניסוי טרנספורמציה תניב בערך מושבה אחת מתוך ארבע המבטאת את החלבון המוצג.להלן תוצאות מסריקה של חמש מושבות שנבחרו מתוך צלחת. מושבה אחת מראה רמה חזקה של ביטוי של חלבון היתוך C-F-T-R-G-F-P. רמות הפלואורסצנציה של C-F-T-R-G-F-P ישתנו במידה ניכרת בין ניסויים, כאשר מושבה ארבע מראה פלואורסצנציה הגבוהה לפחות פי 10 מהפס הפלואורסצנציה העצמי בכ-70 kilodaltons.אפילו עם רמת ביטוי גבוהה של C-F-T-R-G-F-P כפי שמוצג בצד שמאל, לא סביר שפס C-F-T-R-G-F-P יהיה ניתן לזיהוי בתמצית התאים על ידי צביעת kumasi כפי שניתן לראות בצד ימין. דמות זו מראה את נוכחותו של C-F-T-R-G-F-P בתוך מיקרוסומים. תוצאות ניסוי זה חשובות לא רק להערכת יעילות השראת הביטוי, אלא גם כדי לוודא שהמיקרוסומים הוכנו בקפידה ושהפרוטאוליזה מומעטה למינימום.כפי שמוצג כאן. גידול של תאים מעבר ל-16 שעות יוביל לירידה בביטוי של CFTR. הדבר נובע ככל הנראה מתחלופה של החלבון, אולי כתוצאה מהסדרת יתר של מנגנוני בקרת איכות החלבונים בשמרים.לפיכך, מומלץ לנטר את רמות הביטוי של CFTR לאחר האינדוקציה, באמצעות פלואורסצנציה בתוך ג'ל (in-gel fluorescence) ודימוי פלואורסצנטי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנטר את גדילת התאים באמצעות מדידות OD 600. יש לנסות את כל השלבים בקנה מידה קטן תחילה לפני הגדלת הנפחים, ולבדוק את ביטוי החלבון כפונקציה של הזמן לאחר האינדוקציה, שכן הזמן האופטימלי לקצירת התאים עשוי להשתנות בין מעבדה למעבדה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבטא כמויות של מיליגרמים של חלבון ה-CFTR בשמרים מסוג Scro Visier. בעקבות נוהל זה, ניתן לטהר את חלבון ה-CFTR מהמיקרוסומים של השמרים לצורך אפיון ביוכימי וביופיזיקלי נוסף. לאחר פיתוחה על ידי David Drew ועמיתיו, סללה טכניקה זו את הדרך לביטוי טוב יותר של חלבוני ממברנה אוקריוטיים.אנו מקווים שעבודה זו תשפיע על המחקר של סיסטיק פיברוזיס על ידי מתן אפשרות למעבדות ברחבי העולם להפיק CFTR באמצעות מערכת ביטוי זולה ופשוטה. עבודה זו לא הייתה אפשרית ללא התמיכה של ה-Cystic Fibrosis Foundation וכמובן, ללא עמיתינו ב-CFTR three dimensional Structure Consortium. זכרו כי עבודה עם כל אורגניזם רקומביננטי היא תחת רגולציה הדוקה, ויש לאשר את נהלי הטיפול והסילוק על ידי הגוף הרגולטורי המתאים לפני תחילת כל עבודה.

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות...

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

ביטוי וטיהור של רגולטור פיברוזיס הטרנסממברני סיסטיק המוליכות (CFTR) Heterologous אתגרים משמעותיים וגורמים מגבילים בפיתוח הטיפולים תרופתיים לסיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לבידוד של כמויות מיליגרם של CFTR מתאימות ללימודים תפקודיים ומבניים.

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

שתואר כאן הוא הליך מהיר ויעיל לכינון מחדש פונקציונלי של מטוהר wild-type וחלבון CFTR מוטציה המשמרת את פעילות לערוץ כלוריד הזה, שהוא פגום בסיסטיק פיברוזיס. זרימת יודיד מproteoliposomes מחדש בתיווכו של CFTR מאפשרת לימודים של פעילות ערוץ ואת ההשפעות של מולקולות קטנות.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

למדו להביע ולטהר חלבון CFTR ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות תיוג GFP. שיטה זו מאפשרת ייצור כמויות מיליגרם של חלבון קרום אוקריוטי לחקר סיסטיק פיברוזיס ופיתוח תרופות.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

גלה סרטונים נוספים