Name: תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למדו לתעד תגובות נוירוני קולטני ריח בעכברים באמצעות טכניקת יניקת פיפטה. שיטה זו מאפשרת הקלטת זרמי קולטנים ופוטנציאלי פעולה בו-זמנית לחקר עיבוד ריחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH DC009613, תכנית מדע הגבולות האנושית ומוראלית טיפול מלגה (לJR).

1. הגדרת ההקלטה חדר ההקלטה הוא רכוב על המיקרוסקופ ניקון TE2000U אקליפס הפוך עם אופטיקה לעומת השלב בו מצויד על שולחן אוויר וחשמל מוגן באמצעות כלוב פאראדיי. חדר הקלטת פרספקס מורכב משני חלקים מופרדים באופן חלקי על ידי מחסום והודבק על גבי זכוכית silanized. בחלקו האחד של החדר משמש ליישב את התאים ואילו השני משמש לגירוי חשיפה במהלך ההקלטה המוקדמת כדי למזער את החשיפה של התיישב אך עדיין אינם בשימוש תאים לodorant. הגדרת ההקלטה מורכבת מפיפטה שאיבה (ראה בהמשך) עלתה בבעל פיפטה pelleted והאלקטרודה קרקע. פיפטה היניקה תמוקם באמצעות micromanipulator. פתרוני תמריצים מיושמים באמצעות צינור מרובע זכוכית משולשת חבית, עם כל צינור מרובע להיות 0.7 מ"מ x 0.7 מ"מ. הזכוכית משולשת החבית הייתה קשורה למערכת ממונעת מהירה צעד זלוף רכוב על מניפולטור (Sutter SF-77B, וורנר מכשירים) ונכנסו לחדר ההקלטה בזווית של 45 מעלות ~. סוף כוס החבית המשולשת היה משופע בזווית של 45 מעלות שוב כאלה שהפנים הסופיים (פתיחה) של הזכוכית משולשת החבית היו אנכיים, כדי לאפשר מיקום קרוב של פיפטה. האלקטרודה פיפטה יניקה מלאה פתרון סטנדרטי יונקי רינגר והאלקטרודה הקרקע מחוברת לheadstage 1 GΩ של מגבר מהדק תיקון (PC-501A, וורנר מכשירים) במצב מהדק מתח. האות האנלוגית מהמגבר (נמוך לעבור סינון בשעת 5 קילוהרץ) מוצגת באוסצילוסקופ דיגיטלי לנטר את האות בזמן אמת וגם מחוברת ל8-מוט Bessel מסנן (קרוהן-הייט) שבו האות נמוכה לעבור סינון בתדר 50 רץ. שני האותות (נמוך לעבור סינון בkHz 5 ו 50 הרץ) מוזנים לתוך / D ממיר (MKII קיימברידג' האלקטרונית עיצוב המייקר 1401) אשר מחובר למחשב נתונים לרכישה. הנתונים נרשם באמצעות האותות 3 ACQuisition תוכנה (עיצוב אלקטרוני קיימברידג') בתדר דגימה של 10 קילוהרץ. האות מוקלטת בשני התדרים השונים כדי להקליט את הקולטן הנוכחי יחד עם פוטנציאל פעולה על גבי זו ולאחר מכן הקולט הנוכחי בלבד (ראה איור. 2) 1. מערכת זלוף משמשת כדי לעבור במהירות בין פתרון רינגר (שליטה) וגירויי odorant או כל פתרון של קומפוזיציה רצויה והוא נשלט על ידי 3 תוכנת המחשב ואותות. הפתרונים כלולים ב60 מיליליטר מזרקים וקצב הזרימה נשלט על ידי וסת זרימת עירוי רפואי בדרגה. בדרך כלל, קצב הזרימה מוגדר 1 מ"ל / דקה. השאיבה בפיפטה ההקלטה נשלטת באופן הבא: יציאת הצד של בעל פיפטה מחוברת לקו נפט אשר בתורו מחובר למאגר נפט הגובה מתכוונן. העלאה או הורדת המאגר מבטיחה שלחץ פיפטה ולכן זרימת רינגר דרך קצה עמ 'ipette הוא מינימאלי ומעט חיובי. שאיבה או לחץ נוספת יכולה להיות מיושמת באמצעות צינורית מחוברת למרחב האווירי של המאגר בשופר בקצה השני למצוץ גוף התא של orn מבודד בקצה פיפטה ההקלטה. הניסויים מבוצעים על 37 מעלות צלזיוס, כדי לדמות את המצב הפיזיולוגי המולד של התא באופן הדוק. הטמפרטורה נשלטת על ידי עובר את הפתרונים דרך הסקת מחוייט אשר מורכבת מנגדים קרמיים שדרך צינורות נירוסטה המכילים את הפתרונים שהם עברו 10. הטמפרטורה היא פיקוח באמצעות מדחום תרמי (פלוק). 2. פתרונות הפתרון של רינגר יונקים (מ"מ): 140 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0.01 EDTA, 10 HEPES, 10 גלוקוז. PH הותאם ל 7.5 עם NaOH. 10% תמיסה מדוללת של רינגר שמשה למדידה לצומת נוכחית. Odoraפתרוני nt: Acetophenone וeugenol הוכנו יומי בתמיסה של רינגר 20 ממניות DMSO מ"מ. 3. ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זכוכית ורוסיליקט unfilamented נימים בחולץ סאטר P-97 micropipette ולמשוך micropipette עם להתחדד ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פיפטה לבעל micropipette מחוייט רכוב על מיקרוסקופ Eclipse E200 ניקון אשר בתורו המצויד בreticle בעינית וסכין יהלום מטלטלין רכובים על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד על קצה פיפטה תחת 20x האובייקטיבי ובאמצעות reticle כמדריך; עדינות הסופר פיפטה בזווית של 90 מעלות באמצעות סכין יהלום מחוייט בי פיפטה היא רחבה 10 מיקרומטר (קוטר חיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את סכין יהלום נוסף לקראת הקצה ובהדרגה תפעיל לחץ על הקצה עם סכין היהלום. קצה פיפטה צריך לשבור נקי בנקודה שבה היה לשייף. </li></ol> לחלופין צעדים 3.1 ל3.4 ניתן לשלב וpipettes ניתן משך עם ממדים רצויים ישירות ללא צורך לחתוך את קצה פיפטה, למרות שזה יכול להוכיח קשה יותר למשוך אמין pipettes בקוטר כה גדול עצה וקצוות נחתכו באופן מדויק. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אובייקטיבי 40X, לפטר ללטש קצה פיפטה לקוטר פנימי של 5 מיקרומטר באמצעות חוט חשמלי מחומם. פעם סיים, micropipette מוכן לשמש להקלטה מזרמי ORNs עכבר. התנגדות פיפטה הפתוחה צריכה להיות סביב 1 MΩ כאשר התמלא רינגר. </li></ol> 4. בידוד של תאי עצב קולטני ריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר בעקבות הנחיות ותקנות מוסדיות. הסר את ראשו, מקלף את העור שמעל הגולגולת ומדיאלית חוצה את הראש לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את 2 hemi-הראשים תחת stereomicroscope לנתח, לשלוף את מחיצת האף ולהסיר את turbinates הריח. מניח את כל הרקמות בצלחת פטרי עם ג גלוקוזontaining פתרון Ringer של יונקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל אפיתל ההרחה את הסחוס הבסיסי משתי turbinates ולהעביר את הרקמה לתוך צינור המכיל אפנדורף רינגר μl 250. אנו משתמשים ברקמה מ2 turbinates כדי לקבל את הצפיפות הנכונה של תאים לגודל של חדר ההקלטה שלנו. אחסן את הרקמה שנותרה ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור אפנדורף מכיל אפיתל ההרחה פעמים לזמן קצר ל1 שניות במהירות בינונית. צעד זה מוביל לניתוק מכאני של ORNs מהאפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פתרון רינגר המכיל את ORNs ניתק בתא ההקלטה. הסר פיסות גדולות של רקמה גם בהווה בהשעיה באמצעות מלקחיים עדינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן ORNs להתפשר על 20 דקות לפני תחילת superfusion הרציף עם צלצול ולהמשיך להקלטות. </li></ol> 5. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את האלקטרודה היניקה המחוברת לקו השמן לתוך תא ההקלטה וregulאכלתי את הגובה של מאגר הנפט להקים לחץ חיובי מעט בקצה פיפטה. ניתן לעשות זאת על ידי התבוננות פסולת תא למשל מתרחקת (לחץ חיובי) או לכיוון (לחץ שלילי) פיפטה. נסה שלא לזהם את קצה פיפטה בפסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את חדר ההקלטה לorn מבודד שיכול להיות מוכר על ידי המורפולוגיה דו הקוטבית הטיפוסית שלה באמצעות הגדלה של 20-40X. העבר את החוט הרושם לקרבה של גוף תא orn. מתחיל למצוץ בעדינות, כך שהגוף נכנס לתא קצה פיפטה. לאט ובזהירות ימשיך לחול יניקה עד שגוף התא כולו נשאב אל קצה פיפטה היניקה, עוזב דנדריט והריסים נחשפו לפתרון האמבטיה. לקבלת תמונות של ORNs ינק וצורות פיפטה לראות 7,11. ודא שברגע שאין יניקה מוחלת, orn לא זז פנימה או החוצה של פיפטה. אם כך, להתאים את הגובה של מאגר הנפט בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימושmicromanipulators, להעביר את צינורית השאיבה מהמקטע המכיל את ORNs התיישב לסעיף ההקלטה של ​​קאמרי. זהירות למקם את פיפטה היניקה מול הצינור 3-הקנים להחלפת פתרון. פיפטה היניקה צריכה להיות ממוקמת קרוב מספיק לפתיחת הצינור 3-הקנים כך שorn חשוף לזרימה למינרית וכך להימנע ממערבולת ערבוב ולהשיג תמורה מהירה פתרון. חילופי הפתרון מושגים על ידי דריכת הממשק בין זרמים מקבילים של פתרון זורם על פני קצה פיפטה היניקה. כמובן הזמן של חילופי הפתרון הוא בדרך כלל סביב 20 מילישניות, נמדדו מהצומת הנוכחית עורר על ידי דריכת התא בין פתרונות של הרכב יוני שונה (ראה איור. 2). פתרונות מועברים על ידי כוח הכביד. </li></ol> &lt;כיתת תוחלת = "pdflinebreak"&gt; 6. נציג תוצאות <img alt="איור 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg"> איור 1). A נוירונים קולטניים דו קוטבי בנורת חוש הריח. B) מכונות מעבר אותות בסופו של דבר מובילות לריסים מעוררי גל נוכחי. שלילת הקוטביות התפתחה מפעילה דור פוטנציאל פעולה בגוף התא. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg"> תרשים 2 מציג את המהירות ואמינות של חילופי פתרון. פיפטה הוגברה מרגיל לצלצול דילול של 10% עבור 100 אלפית נוכחי הצומת כתוצאה מהריכוז יוני השונה נרשם. עקבות השחורות היא השדזעם של 5 ניסויים, אדום להתחקות SD שלה. השינוי הקטן בSD במהלך חילופי הפתרון מוכיח אמינות של חילופי פתרון ממשפט למשפט וחוסר הרעש עודף בזרם או פתרון. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg"> איור 3 מציג תשובת eugenol מושרה מorn באמצעות טכניקת פיפטה יניקה. Orn נחשף לeugenol מיקרומטר 100 עבור 1 שני כפי שצוין על ידי הבר מעל ההקלטה. באיור. 3A (עקבות שחורות) הנוכחי הקולט היה מסונן ברוחב פס 0-50 הרץ כדי להציג את הקולטן הנוכחי רק איור.. 3B מציג את אותה קלטת, מסוננת עכשיו ברוחב הפס הרחב של 0-5000 רץ (אדום זכר) גם כדי להציג פוטנציאל פעולה (APS, מסומנת בחיצים). ההבלעה מציגה את אותו זכר בזמנים הרחיבו כדי להמחיש בצורה ברורה יותר נקודתי גישה בתחילת התגובה. <img alt="איור 4." sr files src="/files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg"> איור 4. משפחת מנת תגובה של orn eugenol-מגיב (). Eugenol שמש בריכוזים הנעים בין 0.3 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר, משך הגירוי היה 1 של עקבות וסוננו ב0-50 רץ. עלייה הדרגתית בריכוז odorant הובילה לתגובה גדולה יותר ומהירה יותר, שגם הסתיימה בקצב איטי יותר לאחר חשיפת odorant הופסקה. ORNs יכול להציג דפוס תגובת oscillatory במהלך גירויים ארוכים בריכוזי odorant ביניים (איור 4 ב). הנה acetephenone (3 מיקרומטר) orn היענות היה מגורה במשך 8 שניות. לאחר שיא תגובה מהירה וחולפת בתחילת גירוי סדרה של תגובות קטנות יותר, חוזרות ונשנות הם נצפו. רוחב פס ההקלטה היה 0-50 רץ.

<ol><li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology%3A+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li>
<li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects%3A+differences+and+commonalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+retinal+rods+to+single+photons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li>
<li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).</li>
<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-dependent+Ca2%2B+extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li>
<li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13(1999).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2%2B+concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לי מה לחשוף.

<p class="jove_content"&gt; טכניקת יניקת פיפטה היא שיטת אלקטרו שמשמש להקלטה נוכחי ריח המושרה האיטיים הקולטן ואת פוטנציאל הפעולה פאזית המהיר מorn בו זמנית. מאז קרום הפלזמה של התא לא נסדק, שיטה זו מותירה סביבה באין מפריע התאית להבטיח שתגובות odorant אינן משתנית בשל שינויים של ריכוזי cytoplasmic יון או הדילול של גורמים תאיים. תאים ניתן להקליט מתקופות ארוכות (עד 4 שעות בצפרדע וh 1 בעכבר). יתרון נוסף של שיטה זו הוא, שכן גוף התא נמצא בפיפטה ההקלטה, שהגירוי מועבר רק לחלקו הקודקוד של orn, כלומר ריסים וידית הדנדריטים (כמו במקרה של<em&gt; In vivo</em&gt;...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של החומר </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> קטלוג / מספר דגם </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שולחן אוויר </td><td> ציוד </td><td> ניופורט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> משאבת אוויר </td><td> ציוד </td><td> ניופורט </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> פיפטה פולר </td><td> ציוד </td><td> סאטר </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> ורוסיליקט זכוכית </td><td> ציוד </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> ניקון אקליפס מיקרוסקופ ההפוך </td><td> ציוד </td><td> ניקון </td><td> TE2000U </td><td> מצויד במנורה כספית, GFP מסנן ויעדים 20X 5X ולפחות </td></tr><tr><td> המגבר PC-501A </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> סכין יהלום </td><td> ציוד </td><td> מחוייט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitizer Mikro1401 / D </td><td> ציוד </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> יחידת סינון 3382 </td><td> ציוד </td><td> קרון הייט תאגיד </td><td></td><td></td></tr><tr><td> לאותת </td><td> תוכנה </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Molded Ag / AgCl גלולה </td><td> ציוד </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> בעל פיפטה </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td> 64-0997 </td><td> מותאם אישית שונה כדי להתאים headstage </td></tr><tr><td> חדר הקלטה </td><td> ציוד </td><td> מחוייט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator MP85-1028 </td><td> ציוד </td><td> מכשיר סאטר </td><td> Micromanipulator MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> שמן מינרלים </td><td> פתרון </td><td> סיגמא </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> TDS אוסצילוסקופ 1001 </td><td> ציוד </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שפופרת זכוכית המרובעת של שלושה עם הקנה </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td> 64-0119 </td><td> מזהה מ&quot;מ 0.6, 5 סנטימטרים ארוכים </td></tr><tr><td> שסתום </td><td> ציוד </td><td> החברה לי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8.2 </td><td> ציוד </td><td> אוטומציה מדעית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צעד מהיר זלוף SF-77B </td><td> ציוד </td><td> וורנר </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

בעלי חיים לטעום הסביבה הריחנית סביבם דרך מערכות chemosensory ממוקמות בחלל האף. אותות Chemosensory להשפיע התנהגויות מורכבות כגון בחירת אוכל, טורף, conspecific והכרת בן זוג ורמזים חברתיים רלוונטיים אחרים. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) ממוקמים בחלק הגבה של חלל האף המוטבע באפיתל ההרחה. הנוירונים דו קוטביים אלו שולחים אקסון לנורת חוש הריח (ראה איור. 1, Reisert &amp; זאו 1, שפורסם במקור בכתב העת של פיזיולוגיה כללית) ולהרחיב דנדריט אחת לגבול אפיתל ממקום שבי להקרין ריסים לליחה המכסה את חוש הריח האפיתל. הריסים מכילים מנגנון העברת האותות שסופו של דבר מוביל לגירוי זרם זרם דרך ערוצי ריסי transduction, ערוץ מחזורי נוקלאוטיד-מגודר (CNG) וCa 2 +-Cl פעיל - ערוץ (1 איור). Depola התפתחrization מפעיל דור פוטנציאל פעולה בגוף התא 2-4. בסרטון זה אנו מתארים את השימוש של &quot;טכניקת יניקת פיפטה&quot; לרשום תגובות odorant מושרים מORNs. שיטה זו פותחה במקור כדי להקליט מphotoreceptors המוט 5 וריאנט של שיטה זו ניתן למצוא בjove.com השונה כדי להקליט מphotoreceptors קונוס העכבר 6. טכניקת יניקת פיפטה מאוחר יותר הותאם גם להקליט מORNs 7,8. בקצרה, לאחר הניתוק של האפיתל ההרחה ובידוד תא, גוף התא כולו של orn נשאב לתוך קצה פיפטה הקלטה. דנדריט והריסים יישארו חשוף לפתרון אמבטיה ובכך נגיש לשינויי פתרון שיאפשר odorant למשל או יישום חוסם תרופתי. בתצורה זו, אין לו גישה לסביבה התאית היא צברה (לא מהדק מתח כל תאים) והמתח התאי נותר חופשי להשתנות. כל זהows ההקלטה סימולטני של זרם הקולט האיטי שמקורו בריסים ופוטנציאל פעולה מהיר שנורה על ידי גוף התא 9. ההבדל בקינטיקה בין שני אותות אלה מאפשר להם להיות מופרדים באמצעות גדרות מסננות שונות. טכניקה זו ניתן להשתמש בכל סוג פרא או עכבר נוקאאוט או להקליט באופן סלקטיבי מORNs שגם מבטא GFP לתייג תת ספציפי של ORNs, למשל מבטא קולט odorant נתון או ערוץ יון.

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

בעלי חיים דוגמים את הסביבה הריחנית שסביבם באמצעות מערכות כימיות-חושיות הממוקמות בחלל האף. אותות כימיים-חושיים משפיעים על תהליכים מורכבים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט תגובות המושרה על ידי חומרי ריח מנוירוני קולטני ריח של עכבר. הדבר משיג תחילה על ידי דיסקציה של אפיתל הריח ובידוד נוירוני קולטני הריח של העכבר. השלב השני הוא הצבת נוירוני קולטני הריח המבודדים בתא הקלטה המותקן על מיקרוסקופ הפוך.מיקרו-מניפולטורים מחזיקים את אלקטרודת ההקלטה ואת משנה התמיסה. לאחר מכן, שאבו נוירון קולטן ריח מזוהה לתוך קצה של אלקטרודת פיפטה לשאיבה. השלב הסופי הוא מיקום הפיפטה, כאשר התא השאוב נמצא בקצה שלה, מול משנה תמיסה כדי לחשוף את הנוירון לחומרי ריח.בסופו של דבר, שיטת ההקלטה באמצעות פיפטת יניקה (suction pipette) משמשת לחקירת תפקודן של נוירוני קולטני ריח. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טכניקת voltage clamp של תא שלם, הוא שהיא מאפשרת משכי הקלטה ארוכים תוך שימוש בהחלפות תמיסה מהירות ומדויקות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן צורת פיפטת ההקלטה היא חשובה, והצבת תאי השקע (socket cells) באופן יציב בקצה הפיפטה היא מיומנות שקשה ללמוד.התחילו את הפרוצדורה על ידי משיכה של מיקרו-פיפט בעזרת קפילרית זכוכית בורוסיליקט למינציה של UNFI במכשיר למשיכת מיקרו-פיפטים עם טaper ארוך. לאחר מכן, העבירו את הפיפט למחזיק מיקרו-פיפטים בהתאמה אישית המותקן על מיקרוסקופ אנכי. במיקרוסקופ מותקנת עדשה המגדילה (redle) בעין וסכין יהלום נייד המותקן על השולחן.בשלב הבא, צפו בקצה הפיפטה תחת עדשה עם הגדלה של 20 x. השתמשו במיקום ה-redle כמדריך. חרצו בעדינות את הפיפטה בזווית של 90 מעלות באמצעות סכין יהלום מותאמת אישית בקוטר חיצוני של הפיפטה בגודל 10 micrometers.הזיזו את סכין היהלום קדימה לכיוון הקצה. הפילו עליה לחץ בהדרגה. קצה הפיפטה אמור להישבר בצורה נקייה בנקודה שבה בוצע השריטה.לאחר מכן, תחת עדשה של 40x, בצעו ליטוש באש (fire polish) לקצה הפפטה עד לקבלת קוטר פנימי של 5 µm באמצעות פילמנט מחומם חשמלית. עם סיום התהליך, המיקרו-פפטה מוכנה לשימוש להקלטת זרמים מתאי ה-orns של העכבר. בשלב הבא, הקריבו עכבר והסִירו את ראשו.לאחר מכן, קלפו את העור המכסה את הגולגולת, ובשלב הבא בצעו חיתוך של הראש לאורך קו האמצע. לאחר מכן, העבירו את שני חצאי הראש למיקרוסקופ סטריאו לניתוח. הסירו את מחיצת האף ואת הקונכיות האפית (olfactory turbinates).הניחו את הרקמה בתוך צלחת פטרי עם תמיסת רינגר למлекоים המכילה גלוקוז. לאחר מכן, קלפו את אפיתל רכיב הריח מהסחוס שמתחתיו משתי קונכיות אף. העבירו את הרקמה לשפופרת אפינדורף המכילה 250 µL של תמיסת רינגר.לאחר מכן, אחסנו את הרקמה שנותרה בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius לשימוש מאוחר יותר. השתמשו ב-vortex למשך שניתה קצרה של שניה אחת במהירות בינונית על מבחורת ה-EOR המכילה את אפיתל ריריות האף. שלב זה מוביל לפירוק מכני של ה-NS מהאפיתל.בשלב הבא, העבירו את תמיסת הרינגר המכילה את ה-ORN המופרדים לתא ההקלטה המותקן על המיקרוסקופ, והסמירה חתיכות רקמה גדולות מהתמיה באמצעות פינצטה עדינה. המתינו 20 דקות להתיישבות ה-ORN לפני תחילת הפרופוזיה הרציפה בתמיסת רינגר והמשך להקלטות בפרוטוקול זה; מלאו את הפיפטה בתמיסת רינגר. הניחו את הפיפטה במחזיק הפיפטות וחברו את המחזיק לרأس ה-head stage של מגבר ה-patch clamp.בשלב הבא, חברו את קו השמן לפתח הצד של מחזיק הפ pipette. לאחר מכן, הורידו את ה-pipette אל תוך תא ההקלטה. ווסתו את גובה מאגר השמן כדי ליצור לחץ חיובי קל בקצה ה-pipette.ניתן לבצע זאת על ידי התבוננות בשאריות התאים הנעות הרחק מהפיפט או לעברו. השתדלו לא לזהם את קצה הפיפט בשאריות תאים. לאחר מכן, סרקו את תא ההקלטה כדי למצוא ORN מבודד, אותו ניתן לזהות לפי המורפולוגיה הביפולרית האופיינית לו, באמצעות הגדלה של 20 עד 40 x.לאחר מכן, העבירו את אלקטרודת ההקלטה לסמיכות לגוף התא של ה-ORN. שאבו בעדינות את קו האוויר המחובר למאגר השמן, כך שגוף התא יחדור לקצה הפפית. המשיכו להפעיל שאיבה בזהירות ובאיטיות עד שכל גוף התא יישאב לתוך קצה פפית השאיבה, כאשר הדנדריט והסיליה נותרים חשופים לתמיסת הרחצה.העבירו את פיפטת השאיבה מהחלק המכיל את ה-ORNs ששקעו אל חלק ההקלטה של התא. מקמו בזהירות את פיפטת השאיבה מול הצינור בעל שלושת התעלים לצורך החלפת תמיסות. יש למקם את פיפטת השאיבה בקרבה מספיקה לפתח של הצינור בעל שלושת התעלים, כך שה-ORN יהיה חשוף לזרימה למינרית ובכך יימנעו מערבולות ערבוב. כדי לבצע החלפת תמיסה, העבירו את הגבול בין זרמי התמיסה המקבילים הזורמים מהצינור בעל שלושת התעלים של מחליף התמיסות על פני קצה פיפטת השאיבה, כדי לנטר את האיכות והאמינות של החלפת התמיסות.ניתן למדוד את זרם החיבור המתעורר מהעברת התא בין תמיסות בעלות הרכב יוני שונה. מהלך הזמן של החלפת התמיסות הוא בדרך כלל כ-20 מילישניות. כאשר נוירון קולטן ריח מועבר לתמיסת חומרי ריח, ניתן לעורר כאן תגובה המופעלת על ידי חומרי ריח.ORN נחשף למאה מיקרו-מולר eugenol למשך שנייה אחת, כפי שמוסמן על ידי הפס מעל ההקלטה. בלוח העליון, זרם הרצפטור סונן ברוחב פס של 0 עד 50 הרץ כדי להציג את זרם הרצפטור בלבד. הלוח התחתון מציג את אותה הקלטה מסוננת ברוחב פס רחב של 0 עד 5,000 הרץ, כדי להציג גם את פוטנציאלי הפעולה. כאן מוצגות תגובות המנה של ORN המגיב ל-eugenol. eugenol שימש בריכוזים הנעים בין 0.3 מיקרו-מולר למאה מיקרו-מולר.משך הגירוי היה שנייה אחת, והעקבות סוננו בתדר של 0 עד 50 hertz. עלייה הדרגתית בריכוז הריח הובילה לתגובה גדולה ומהירה יותר בעלייה, אשר גם הסתיימה באיטיות רבה יותר. לאחר הפסקת החשיפה לריח, ORNS עשויים להפגין דפוס תגובה תנודתי במהלך גירויים ממושכים בריכוזי ריח בינוניים.כאן, נוירון רשת ריח (ORN) המגיב לאצטופנון עבר גרייה במשך שמונה שניות. לאחר תגובה שיא מהירה וחולפת בתחילת הגרייה, נצפתה סדרה של תגובות חוזרות קטנות יותר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטיפל בנוירוני קולטני ריח בזהירות ולהיות סבלניים מאוד.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

סרטון זה מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית של נוירונים חושי ריח (OSNs) בעכברים באמצעות טכניקת מהדק טלאי מחורר. אפיתל הריח, המכיל OSN עם קולטני ריח מתויגים פלואורופור, מבודד מעכבר ומאובטח בתא הקלטה. פיפטת הקלטה מהודקת לידית הדנדריטית של OSN, וניסטטין בתוך הפיפטה מנקב את הממברנה כדי ליצור קישוריות חשמלית עם התא. לבסוף, פיפטה נוספת משמשת להעברת ממריץ ריח, והפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא המתוקן נרשמת.

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים

סרטון הפרוטוקול מתאר הקמת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירוני החישה של איבר הוומרונסאל (VNO) בעכברים. פרוסת VNO קורונלית עם נוירונים חושיים המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוקמת במערך הקלטה. תא עצב מסומן מתוקן עם פיפטת הקלטה בתצורה של תא שלם לרישום אלקטרופיזיולוגי בתגובה לגירויים כימיים.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

בסרטון זה, זבוב דרוזופילה חי מותקן בצינור למחקרים אלקטרופיזיולוגיים. אלקטרודות ממוקמות בבסיס הסנסילום כדי לרשום תגובות עצביות ספציפיות לפרומונים עם נוירוני קולטן הריח של הזבוב.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של Drosophila Sensilla בתגובה לריחות נדיפים

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

פשפשי מיטה מסתמכים על נוירונים של קולטני ריח השוכנים ברגישות הריח של האנטנות שלהם כדי לזהות סמיוכימיקלים בסביבה. תוך שימוש בהקלטת סנסילום יחידה, אנו מדגימים שיטה להערכת תגובת פשפש המיטה לסמיוכימיקלים ולחקור את תהליך הקידוד הכרוך בכך.

שימוש יחיד Sensillum הקלטה לזיהוי תגובות חוש הריח Neuron של באגס במיטה לSemiochemicals

אפיון הפונקציה של קולטני odorant מגישה חלק חיוני בתהליך deorphanization. אנו מתארים שיטה למדוד את ההפעלה של רצפטורים odorant בזמן אמת באמצעות וזמינותו של המחנה.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להציג odorants של התנודתיות נמוכה להקלטת single-sensillum מ נוירונים קולטן תסיסנית חוש הריח המגיבים שרשרת פרומונים ארוכים שרשרת.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ<em&gt; תסיסנית</em&gt; Trichoid Sensilla בתגובה ריחות של תנודתיות נמוכה

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח היא שיטה רגישה, איתנה ותו לאופתית להערכת רגישות חוש הריח בדגים ימיים. הוא מתעד קלט חושי ראשי והוא אינו תלוי במליתיות חיצונית.

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט

למדו לתעד תגובות נוירוני קולטני ריח בעכברים באמצעות טכניקת יניקת פיפטה. שיטה זו מאפשרת הקלטת זרמי קולטנים ופוטנציאלי פעולה בו-זמנית לחקר עיבוד ריחות.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

גלה סרטונים נוספים