תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד תגובות המושרות על ידי ריח מנוירונים של קולטני ריח של עכברים. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של אפיתל הריח ובידוד נוירוני קולטני הריח של העכבר. השלב השני הוא למקם את נוירוני קולטני הריח המבודדים בתא הקלטה המותקן על מיקרוסקופ הפוך.

מניפולטורים מיקרו מחזיקים את אלקטרודת ההקלטה ומחליף תמיסה. לאחר מכן, מצצו נוירון קולטן ריח מזוהה לקצה אלקטרודת פיפטה יניקה. השלב האחרון הוא למקם את הפיפטה עם התא הנשאב בקצהו מול מחליף תמיסות כדי לחשוף את הנוירון לריח.

בסופו של דבר, שיטת הקלטת פיפטת היניקה משמשת לחקירת תפקוד הנוירונים של קולטני הריח. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טכניקת מהדק מתח תא שלם הוא שהיא מאפשרת משכי הקלטה ארוכים באמצעות שינויי פתרון מהירים ומדויקים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שצורת פיפטת ההקלטה חשובה, וקשה ללמוד למקם את תאי השקע ביציבות בקצה הפיפטה.

התחל הליך זה על ידי משיכת מיקרו פיפטה עם נימי זכוכית סיליקט בו סיליקט מקונן UNFI במושך מיקרו פיפטה עם מתחדד ארוך. לאחר מכן העבירו את הפיפטה למחזיק מיקרו פיפטה בהתאמה אישית המותקן על מיקרוסקופ זקוף. למיקרוסקופ יש אדום בעינית וסכין יהלום ניידת המותקנת על הבמה.

לאחר מכן, התבונן בקצה הפיפטה מתחת למטרה 20x. השתמש באדום כמדריך. כתבו בעדינות את הפיפטה בזווית של 90 מעלות באמצעות סכין יהלום בהתאמה אישית בקוטר החיצוני של הפיפטה של 10 מיקרומטר.

הזיזו את סכין היהלום עוד יותר לכיוון הקצה. הפעל עליו לחץ בהדרגה. קצה הפיפטה צריך להישבר בצורה נקייה בנקודה שבה הוא נכתב.

לאחר מכן, תחת ליטוש אש אובייקטיבי של פי 40, יש ללטש את קצה הפיפטה לקוטר פנימי של חמישה מיקרומטר באמצעות חוט מחומם חשמלית. לאחר סיום, המיקרו פיפטה מוכנה לשימוש להקלטת זרמים מאורני העכבר. בשלב הבא, הקריבו עכבר והסירו את ראשו.

לאחר מכן מקלפים את העור המכסה את הגולגולת, ולאחר מכן חותכים את הראש לאורך קו האמצע. לאחר מכן, העבירו את שני ראשי Hemi למיקרוסקופ סטריאו מנתח. משוך את מחיצת האף והסר את טורבינות הריח.

מניחים את הרקמה בצלחת פטרי עם תמיסת צלצול יונקים המכילה גלוקוז. לאחר מכן, קלף את אפיתל הריח מהסחוס הבסיסי משתי טורבינות. מעבירים את הרקמה לתוך צינור עינור המכיל 250 מיקרוליטר רינגר.

לאחר מכן אחסן את הרקמה הנותרת בארבע מעלות צלזיוס למועד מאוחר יותר. השתמש במערבולת צינור ה-EOR המכיל את אפיתל הריח פעמיים לזמן קצר למשך שנייה אחת במהירות בינונית. שלב זה מוביל לניתוק מכני של ה- NS מהאפיתל.

לאחר מכן, הניחו את תמיסת הצלצול המכילה את האורנים המנותקים בתא ההקלטה המותקן על המיקרוסקופ, הסירו את פיסות הרקמה הגדולות בתרחיף באמצעות זוג מלקחיים עדינים. תן ל-ORN להתיישב במשך 20 דקות לפני תחילת הזלוף הרציף בתמיסת צלצול והמשך להקלטות בהליך זה, מלא את הפיפטה בתמיסת צלצול. הנח את הפיפטה במחזיק הפיפטה והצמד את המחזיק לתיקון clamp מגבר ראש tagה.

לאחר מכן, חבר את קו השמן ליציאת הצד של מחזיק הפיפטה. לאחר מכן הורד את הפיפטה לתא ההקלטה. לווסת את גובה מאגר השמן כדי ליצור לחץ חיובי מעט בקצה הפיפטה.

ניתן לעשות זאת על ידי התבוננות בפסולת התא המתרחקת מהפיפטה או לעברה. נסו לא לזהם את קצה הפיפטה בפסולת תאים. לאחר מכן, סרוק את תא ההקלטה לאיתור ORN מבודד, אותו ניתן לזהות על ידי המורפולוגיה הדו-קוטבית האופיינית שלו באמצעות הגדלה של פי 20 עד 40.

לאחר מכן העבר את אלקטרודת ההקלטה לקרבה לגוף התא ORN. מצצו בעדינות את חברת התעופה המחוברת למאגר הנפט כך שגוף התא ייכנס לקצה הפיפטה. המשיכו לשאוב בזהירות ובאיטיות עד שכל גוף התא נמשך לקצה פיפטת היניקה, ומשאיר את הדנדריט והריסים חשופים לתמיסת האמבטיה.

העבר את פיפטת היניקה מהקטע המכיל את האורנים המיושבים לקטע ההקלטה של החדר. הנח בזהירות את פיפטת היניקה מול צינור שלושת הקנים להחלפת תמיסה. יש למקם את פיפטת היניקה קרוב מספיק לפתח הצינור בעל שלושת הקנים כך שה-ORN ייחשף לזרימה למינרית ובכך להימנע מערבולת ערבוב כדי להשיג חילופי תמיסות, העבר את הגבול בין הזרמים המקבילים של תמיסה זורמת מצינור שלושת החביות של מחליף התמיסה על פני קצה פיפטת היניקה כדי לפקח על האיכות והאמינות של חילופי התמיסות.

ניתן למדוד את זרם הצומת המתעורר על ידי הזזת התא בין תמיסות בעלות הרכב יוני שונה. מהלך הזמן של החלפת הפתרון הוא בדרך כלל בסביבות 20 אלפיות השנייה. כאשר תא העצב של קולטן הריח נכנס לתמיסת ריח, ניתן לעורר כאן תגובה מעוררת ריח.

ORN נחשף למאה מיקרו טוחנות אאוגנול למשך שנייה אחת כפי שמצוין על ידי הסרגל מעל ההקלטה. בפאנל העליון, זרם הקולטן סונן ברוחב פס של אפס עד 50 הרץ כדי להציג את זרם הקולטן רק הפאנל התחתון מציג את אותה הקלטה מסוננת ברוחב הפס הרחב של אפס עד 5,000 הרץ כדי להציג גם את פוטנציאל הפעולה. להלן תגובות המינון של ORN מגיב לאאוגנול שימש בריכוזים שנעו בין 0.3 מיקרומולר למאה מיקרומולר.

משך הגירוי היה שנייה אחת, והעקבות סוננו מאפס עד 50 הרץ. עלייה הדרגתית בריכוז הריח הובילה לתגובת עלייה גדולה ומהירה יותר, שגם הסתיימה לאט יותר. לאחר הפסקת החשיפה לריח, ORNS יכולים להציג דפוס תגובה תנודתי במהלך גירויים ארוכים בריכוזי ריח ביניים.

כאן, ORN מגיב לאצטופנון עורר במשך שמונה שניות לאחר תגובת שיא מהירה וחולפת בתחילת הגירוי. נצפית סדרה של תגובות חוזרות קטנות יותר בעת ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לטפל בנוירונים של קולטני הריח בזהירות ולהיות סבלניים מאוד.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.