Name: הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למדו שיטה לצימוד ביוטין לחיישנים אופטיים מסיליקה באמצעות כימיה של אסטר NHS. השיטה שומרת על רגישות הגבוהה ומאפשרת אחסון ממושך ללא אובדן פעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

החוקרים בתודה להכיר פרופ &#39;אנדריאה ארמני באוניברסיטה של ​​דרום קליפורניה על התמיכה בתקופה זו פותח פרוטוקול. מימון הפיתוח הראשוני של העבודה זה סופק על ידי הקרן הלאומית למדע [085281 ו 1028440] לבין המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב NIH דרך ניו תוכנית של מנהל פרס ממציא [1DP2OD007391-01]. מידע נוסף זמין בכתובת <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ hunthk ~ /</a> .

<ol><li>Datar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantilever+Sensors%3A+Nanomechanical+Tools+for+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Cantilever Sensors: Nanomechanical Tools for Diagnostics.</a> MRS Bull. 34, 449-454 (2009).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biological+and+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li>
<li>Sundberg, F., Karlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+characterization+of+immune+responses+using+label-free+biacore+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and characterization of immune responses using label-free biacore immunoassays.</a> Immunology. 120, 46-47 (2007).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2008).</li>
<li>Bernards, M. T., Cheng, G., Zhang, Z., Chen, S. F., Jiang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonfouling+polymer+brushes+via+surface-initiated%2C+two-component+atom+transfer+radical+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nonfouling polymer brushes via surface-initiated, two-component atom transfer radical polymerization.</a> Macromolecules. 41, 4216-4219 (2008).</li>
<li>Fan, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+optical+biosensors+for+unlabeled+targets%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 620, 8-26 (2008).</li>
<li>Qavi, A. J., Washburn, A. L., Byeon, J. Y., Bailey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+technologies+for+quantitative+multiparameter+biological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free technologies for quantitative multiparameter biological analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 121-135 (2009).</li>
<li>Hunt, H. K., Soteropulos, C., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+Strategies+for+Microtoroidal+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation Strategies for Microtoroidal Optical Resonators.</a> Sensors. 10, 9317-9336 (2010).</li>
<li>Kalia, J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in Bioconjugation.</a> Curr. Org. Chem. 14, 138-147 (2010).</li>
<li>Matsko, A. B., Savchenkov, A. A., Strekalov, D., Ilchenko, V. S., Maleki, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Applications+of+Whispering-Gallery+Mode+Resonators+in+Photonics+and+Nonlinear+Optics%5BTitle%5D)+AND+%22IPN+Progress+Report%22%5BJournal%5D)">Review of Applications of Whispering-Gallery Mode Resonators in Photonics and Nonlinear Optics.</a> IPN Progress Report. , 42-162 (2005).</li>
<li>Armani, A. M., Kulkarni, R. P., Fraser, S. E., Flagan, R. C., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free%2C+single-molecule+detection+with+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free, single-molecule detection with optical microcavities.</a> Science. 317, 783-787 (2007).</li>
<li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+single+nanoparticle+detection+and+sizing+by+mode+splitting+in+an+ultrahigh-Q+microresonator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photon%22%5BJournal%5D)">On-chip single nanoparticle detection and sizing by mode splitting in an ultrahigh-Q microresonator.</a> Nat. Photon. 4, 122-122 (2010).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering+gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+microcavity+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li>
<li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

כפי שמתואר בפרוטוקולים, יצרנו פלטפורמה הדיור שבו להעביר סיליקה microspheres מרגליהן לאורך כל תהליך functionalization. פלטפורמה זו הדיור נוצר כפתרון זיהום פני השטח ואת הנזק כתוצאה microsphere לבוא במגע עם קירות מכולות שונים המשמשים בתהליך functionalization. הבנו את הקושי העיקרי נבע מן הזמן מצרף ועל ניתוק microspheres האדם מכלים שונים במהלך תהליך functionalization. קשה היה להימנע צחצוח microsphere נגד אובייקט בעת מעבר בנפרד עם פינצטה על ידי לחיצה על הגבעולים. על ידי ייצוב מעמדה של m...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> דיג </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS כיתה </td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> דיג </td><td> 8014-95-7 </td><td> רותחת </td></tr><tr><td> מי חמצן </td><td> דיג </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30 wt% </td></tr><tr><td> Aminopropyltrimethoxysilane </td><td> דיג </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> שירותי הבריאות, ביוטין EZ מקשר </td><td> לנקב </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> דיג </td><td> 67-68-5 </td><td> נטול מים </td></tr><tr><td> Fluorescein Isothiocyanate </td><td> לנקב </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> דיג </td><td> 7647-14-5 </td><td> אבקת להתרכז </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט מאגר </td><td> דיג </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> טקסס אדום - Avidin המצומד </td><td> לנקב </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> סיב אופטי </td><td> ניופורט </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> סיבים חשפנית </td><td> כלי סיבים מכירות </td><td> NN-175 </td><td> ללא ניק 175 אום חשפנית </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> דיג </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> סיבים חשופים קליבר </td><td> Ilsintech </td><td> CL-03A </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ זכוכית שקופיות </td><td> דיג </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> בקבוקוני פלסטיק פוליפרופילן </td><td> דיג </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 מ&quot;ל, צירים שווי </td></tr><tr><td> דוגרים Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> אבק תא ייבוש </td><td> דיג </td><td> 08-594 15 ב- </td><td></td></tr></tbody></table>

הוספת בדיקות ביולוגיות biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

על מנת ממשק עם סביבות ביולוגיים, פלטפורמות biosensor, כגון מערכת Biacore הפופולרי (מבוסס על משטח Plasmon תהודה (SPR) טכניקה), לעשות שימוש בטכניקות שונות שינוי פני השטח, זה יכול, למשל, למנוע עכירות פני השטח, לכוון את hydrophobicity / hydrophilicity של פני השטח, להתאים למגוון רחב של סביבות אלקטרוניים, לעתים קרובות ביותר, לגרום הספציפיות לקראת היעד של עניין. 1-5 טכניקות אלו להרחיב את הפונקציונליות של biosensors אחרת רגישים מאוד של העולם האמיתי יישומים בסביבות מורכבות, כגון כמו דם, שתן, וניתוח שפכים. 2,6-7 בעוד פלטפורמות biosensing מסחריים, כגון Biacore, יש להבין היטב, טכניקות סטנדרטיות לביצוע שינויים מסוג זה על פני השטח, טכניקות אלה לא תורגמו בצורה סטנדרטית אחרת תווית פלטפורמות biosensing בחינם, כמו לוחשים מצב גלריה (WGM) תהודה אופטי. 8-9 &lt;<html> / P&gt; תהודה WGM אופטיים מייצגים טכנולוגיה מבטיחה לביצוע ללא תווית זיהוי של מגוון רחב של מינים ב נמוך במיוחד בריכוזים 6,10-12 רגישות גבוהה של פלטפורמות אלה הוא תוצאה של אופטיקה גיאומטריות הייחודיות שלהם. WGM תהודה אופטי להגביל במחזור . אור, תדרים מסוימים תהודה אינטגרלי 13 כמו פלטפורמות SPR, בתחום האופטי אינו מוגבל לחלוטין למכשיר חיישן, אבל evanesces; זה &quot;זנב חלוף&quot; אז יכול לקיים אינטראקציה עם המין בתוך הסביבה. אינטראקציה זו גורמת מקדם השבירה יעילה של השדה האופטי לשנות, וכתוצאה מכך קל, אבל ניתן לגילוי, שינוי תדר התהודה של ההתקן. כי בתחום האופטי מסתובב, הוא יכול לתקשר עם הסביבה פעמים רבות, וכתוצאה מכך הגברה פנימית של האות, ואת רגישויות גבוהות מאוד לשינויים קלים בסביבה. 2,14-15 אוהל &quot;&gt; כדי לבצע איתור ממוקד בסביבות מורכבות, פלטפורמות אלה חייבים להיות יחד עם מולקולת בדיקה (בדרך כלל 1 1/2 של זוג מחייב, למשל נוגדנים / אנטיגנים) באמצעות שינוי פני השטח. 2 למרות תהודה WGM אופטיים יכול להיות מפוברק הגיאומטריות כמה מן מגוון רחב של מערכות גשמי, microsphere סיליקה היא הנפוצה ביותר. microspheres אלו מיוצרים בדרך כלל על קצה של סיב אופטי, המספק &quot;גזע&quot;, שבאמצעותה microspheres ניתן לטפל במהלך הניסויים functionalization זיהוי. משטח chemistries סיליקה רשאי להיות מיושם לצרף מולקולות בדיקה כדי השטח שלהם, עם זאת, טכניקות מסורתיות שנוצר על מצעים מישוריים הם בדרך כלל לא מספיק אלה תלת ממדי מבנים, כמו כל שינוי פני השטח של microspheres (אבק, זיהום, ליקויים פני השטח, ציפוי אחיד) יכולות להיות חמורות, השלכות שליליות על יכולת הגילוי שלהן. הנה, אנחנו מדגימים את הגישה קלילעבור functionalization את פני השטח של microsphere תהודה סיליקה WGM אופטי באמצעות סוכני צימוד silane לגשר על פני אורגניים ואיכות הסביבה הביולוגית, על ידי הצמדת ביוטין אל פני השטח סיליקה. 8,16 למרות שאנו משתמשים microsphere סיליקה תהודה WGM כמערכת חיישן בדוח זה, הפרוטוקולים הם כלליים וניתן להשתמש functionalize את פני השטח של כל מכשיר עם סיליקה ביוטין.

Biosensors ממשק עם סביבות מורכבות ביולוגיות ולבצע איתור ממוקד על ידי שילוב של חיישנים רגישים מאוד עם בדיקות ספציפיות ביותר המחוברים חיישן באמצעות שינוי פני השטח. הנה, אנחנו מדגימים functionalization פני השטח של חיישנים אופטיים עם סיליקה ביוטין באמצעות סוכני צימוד silane לגשר על חיישן את הסביבה הביולוגית.

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

כדי ליצור ממשק עם סביבות ביולוגיות, פלטפורמות של חיישנים ביולוגיים (biosensors), כגון מערכת ה-Biacore הנפוצה (המבוססת על תהודה של פלזמוני שטח (SPR)...

המטרה הכללית של הליך זה היא לצפות את פני השטח של המהודק האופטי מהמיקרוספירה הסיליקאית בביוטין באמצעות תהליך של חיבור קוולנטי, מבלי לפגוע ברגישות המכשיר. הדבר מבוצע באמצעות תהליך בן שלושה שלבים, המתחיל בהידרוקסילציה באמצעות פלזמת חמצן או חריטה ב-piha; לאחר ההידרוקסילציה מתבצעת פליטה באמצעות שיקוע אדים של חומר צימוד slan. לאחר מכן, הביוטין מוחדר באמצעות כימיה של NHS Ester כדי לקשר את שרשרת הצד הוולרית של הביוטין לאמצעים הראשוניים על פני השטח של המהודק.בסופו של דבר, שיטה זו יוצרת ביו-חיישן אופטי בעל רגישות וספציפיות גבוהות למולקולת מטרה, שניתן לשנותו עוד יותר באמצעות סימון פלואורסצנטי של סיליקה מסתיימת בממוצע, וכן באמצעות שיטת קומפלקסציית Ava tin biotin כדי ליצור פלטפורמת ביו-חיישן למגוון רחב של מטרות פוטנציאליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לפונקציונליזציה של פני השטח, כגון ספיגה פיזית, הוא שמולקולת הגש (probe) שלנו קשורה קוולנטית, מה שהופך את החיישנים שלנו ליציבים ואמינים יותר. המשמעות היא שניתן לאחסן אותם למשך פרקי זמן ממושכים יותר והם עדיין ישמרו על יכולת השימוש שלהם, וילמדו להישאר רגישים מאוד לאחר הפונקציונליזציה.בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקושי בשל המורכבות של טיפול במכשירים בגודל מיקרוני לאורך תהליך הפונקציונליזציה. טכניקת טיפול לקויה היא הדרך המהירה ביותר לפגוע בביצועים האופטיים של החיישן וליצור זיהום על פני השטח שלו. באמצעות מספריים, גזרו חתיכת קרטון בעובי one quarter inch למרובע של one inch על one inch.הדביקו זאת על גשמיות זכוכית סטנדרטית וחברו מקטע של אינץ' אחד של סרט דבק שקוף מגולגל לקרטון. פעולה זו יוצרת פלטפורמה שבאמצעותה ניתן להגביה את המיקרוספירה ולבודד אותה מהסביבה ההיקפית, ובכך נמנע נזק לפני השטח שלה בעת שימוש במספריים. גזרו מקטע של שלושה אינץ' של סיב אופטי מהסליל.בשלב הבא, השתמשו במקלף סיבים ללא חריצה (no nick fiber stripper) כדי להסיר את ציפוי הפולימר המגן מ-0.5 האינצ'ים האחרונים בקצה חתיכת הסיב הגזוזה, כך שיישאר רק ליבת הסיליקה. נקו את פני השטח משאריות פולימר באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe שהורטב במתנול, על ידי ניגוב עדין של הסיב. בעזרת חותך סיבים חשוףים (bare fiber cleaver), קצצו את הקצה שקולף כך שיישאר רק כמילימטר אחד של סיב חשוף בקצה הסיב. הניחו את הקצה החשוף של הסיב האופטי במסלולו של לייזר פחמן דו-חמצני (carbon dioxide laser), תוך הקפדה על כיוון אנכי. יישרו את הסיב כך שהקצה החשוף שלו פונה כלפי מטה.הפעילו את לייזר הדו-חמצן הפחמי (carbon dioxide laser) וכוונו אותו אל הפני של הקצה שקולף של הסיב האופטי. הלייזר ימיס את קצה הסיב שקולף לכדי כדור תוך שימוש בכ-3.5% מההספק במשך שתי שניות. בעזרת פינצטה, אחזו בזהירות בגבעול של המיקרו-כדור.חבר את הגבעול לגליל הסרט על גבי בית המיקרוספירה. ניתן לאחסן את תגית הזכוכית בצלחת פטרי, מה שמאפשר אחסון בטוח של המיקרוספירה במבחנת פוליפרופילן בנפח 60 milliliter עם מכסה צירים. הכן תמיסת פירנה על ידי הוספת three milliliters של מי חמצן למבחנה, ולאחריהן seven milliliters של חומצה גופרתית מעשנת.העבירו את למסלול הזכוכית המחזיק לפחות מיקרוספירה אחת אל הבקבוקון. המיקרוספירה צריכה להיות במגע עם הנוזל, אך הנוזל לא צריך לגעת בקרטון. התאימו את נפח התמיסה במידת הצורך.לאחר שהכדורים הושקעו בתמיסת הפיראנה למשך 15 דקות, הוצא בעדינות את שקף הזכוכית מהמבחנה והכנס אותו למבחנה מפלסטיק אחרת המכילה מים מזוקקים ד-יוניים. הנח את המבחנה על משטח ההטיה למשך חמש דקות בזווית של חמישה מעלות ובמהירות הטיה של 5 RPM. הוצא בעדינות את שקף הזכוכית מהמבחנה והנח אותו בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.כדי לייבש את השטח, מקם את שקופית הזכוכית המכילה לפחות מיקרוספירה אחת בתוך מכשיר ליישוש בוואקום. פתח את הבקבוק של חומר הצימוד, כגון A-P-T-M-S, והנח את הבקבוק הפתוח בתוך המייבש. החזר את המכסה על מייבש הוואקום וחבר את פתח היציאה לשואב או לקו ואקום של המעבדה.הפעל את משאבת הוואקום או את קו הוואקום ורוקן את המייבש בוואקום. ברגע שנוצר אטום וואקום בין המכסה לבסיס, התחל את תזמון התגובה. פעולה זו תשקיע את חומר הצימוד הסילילי על פני השטח כשכבה דקה.לאחר 15 דקות, כבה את הוואקום ופתח באיטיות את הפתח כדי להחדיר אוויר למייבש. עבור סוכן צימוד זה, 15 דקות מספיקות ליצירת שכבה אחת אחידה (monolayer) על פני השטח, בעוד שעבור סוכני צימוד אחרים ייתכן שיהיה צורך להתאים את הזמן. כשעה לפני הצמדת הביוטין, הכן תמיסה בריכוז 10 millimolar של en hydroxyl oxide biotin בתוך dimethyl sulfoxide אנמידרוס, בבקבוק פוליפרופילן בנפח 60 milliliter עם מכסה ציר.החלק הקשה ביותר בפרוטוקול זה הוא הטיפול במיקרוספירות ומניעת זיהום של פני השפירה כדי להבטיח הצלחה. בנוסף ליצירת מנגנון השקופיות להחזקת הספירות, את תמיסת הביוטין מעבירים לסוניקציה מראש כדי לפרק את החלקיקים שנותרו על הפני השטח. בצעו סוניקציה לתמיסה למשך שעה אחת כדי להמיס באופן מלא את אבקת ה-NHS biotin בממס.העבירו את השקופית הזכוכית המכילה את המיקרוספירה אל מבחנה פלסטית אחרת, כך שהמיקרוספירה תהיה בתחתית והגבעול בחלק העליון של המבחנה. בעזרת פיפט פלסטיק, העבירו נפח מתאים של תמיסת NHS biotin במורד דופן המבחנה, מאחורי השקופית, כך שהתמיס לא יבוא במגע עם המיקרוספירה בזמן הוספתו למבחנה. הוסיפו כמות מספקת של תמיסה כדי לכסות את פני השטח של המיקרוספירה.הנח את המבחנה המכילה כעת את ה-MICROSPHERE ואת תמיסת ה-NHS biotin וה-DMSO באינקובטור נדנדה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כאשר מהירות הסיבוב וזווית ההטיה הן 5 RPM וחמש מעלות, בהתאמה. הוצא בעדינות את השקף מהמבחנה והגלש אותו בעדינות לתוך מבחנה אחרת מלאה במים מזוקקים דה-יוניים. הנח את המבחנה על מגש ההטיה למשך 10 דקות נוספות באותה מהירות וזווית הטיה.כפי שנעשה קודם לכן, חזור על שלב זה פעמיים, בכל פעם עם מים טריים. פעולה זו מסייעת בהסרת DMSO עודף מהפני השטח ומסירה ביוטין שנספח פיזית אך לא השתבץ בפועל לפני השטח. הוצא את שקופית הזכוכית מהמבחנה והנח אותה בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות או עד להסרה מלאה של טיפות המים מפני השטח.המשיכו לביצוע סימון פלואורסצנטי של סיליקה עם קצה מסתיים, כפי שנדון בפרוטוקול לסימון פלואורסצנטי. סמנו את הסיליקה עם הקצה המסתיים בביוטין. ראשית, הכינו תמיסה של 10 µg/mL של Texas Red Aden בתוך phosphate buffered saline.העבירו את התמיסה לבקבוק פוליפרופילן בנפח 60 milliliter עם מכסה ציר, והחליקו בעדינות את זכוכית המיקרוסקופ המכילה מיקרוספירה עם קצה ביוטין לתוך התמיסה, כך שהמיקרוספירה תהיה מכוסה בקושי על ידי התמיסה. לאחר מכן, עטפו את הבקבוק בנייר אלומיניום והמתינו 30 דקות לתגובה בטמפרטורת החדר ובחושך. עודפי fluoro four מוסרים באמצעות שטיפה כפולה של המיקרוספירה בבופר PBS למשך 10 דקות בכל פעם.כפי שנעשה קודם לכן, מלאו מבחנה מפוליפרופילן בנפח 60 milliliter בתמיסת הבאפר והעבירו בעדינות את השקופית לתוך התמיסה. שימו לב לכך שהתמיסה תכסה רק את המיקרוספירה ולא את בית הקרטון.כסו את המבחנה בנייר אלומינום והניחו אותה על מגש הטיה (tilt tray) המכוון לזווית של חמישה מעלות ובמהירות של 5 RPM למשך 10 דקות. הוציאו בעדינות את שקופית הזכוכית מהמבחנה והחליקו אותה בעדינות לתוך מבחנה אחרת המלאה במים מזוקקים דה-יוניים ומכוסה בנייר אלומינום. הניחו את המבחנה על מגש ההטיה למשך 10 דקות נוספות באותה מהירות וזווית הטיה.חזרו על שלב זה פעמיים עם מים טריים בכל פעם. פעולה זו מסייעת בהסרת שאריות צבע מהמשטח. כשלב סופי, הוציאו בדרך כלל את פלטת הזכוכית מהמבחנה וייבשו בתנור המכוון ל-80 °C למשך 10 דקות לפני הצילום.אם פונקציונליזציית הפני השטח בוצעה כהלכה, היא אמורה להוביל לכיסוי דחוס ואחיד של מולקולות ביוטין על פני השטח, כפי שניתן לבחון באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בנוסף, פני השטח צריכים להישאר נקיים מפגמים וממזהמים לאחר הפונקציונליזציה כדי לשמור על רגישותם הגבוהה. במהלך ניסויי גילוי, כפי שמודגם במיקרוסקופיה אופטית המוצגת כאן, נראות דוגמאות של מיקרוספירות שעברו פונקציונליזציה נכונה.תמונות אלו מראות כי אין נזק פני השטח או זיהום כתוצאה מהפונקציונליזציה, וכי המיקרוספירות מראות כיסוי אחיד ועקבי של קבוצות am או קבוצות ביוטין. על פני השטח, אם המיקרוספירות לא עברו פונקציונליזציה נכונה, תמונות המיקרוספירות האופטיות יציגו זיהום של פני השטח, התגבשות או כיסוי שאינו אחיד ופגמים בולטים בפני השטח; הסדקים בפני השטח המוצגים כאן הם דוגמה נפוצה לזיהום פני השטח הנובע מהתגבשות של ריאגנטים על פני השטח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע פונקציונליזציה של פני השטח של כל רזונטור אופטי מסיליקה באמצעות ביוטין.מכיוון שזוהי שיטה כללית עבור התקני סיליקה, ניתן ליישם אותה באופן נרחב על סוגים רבים ושונים של פלטפורמות חיישני סיליקה. באמצעות פיתוחה של טכניקה זו, חוקרים בתחום הביופוטוניקה יוכלו לחקור בקלות רבה יותר שיטות חדשות ושילובים חדשים של חיישני גשושית ליצירת פלטפורמות ביו-חיישנים בעלות רגישות וספציפיות גבוהות.

attaching-biological-probes-to-silica-optical-biosensors-using-silane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

במאמר זה אנו מתארים כיצד נקבל סריג עקבות של מולקולות דנ"א בודדות משותקת על משטח באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מתארים שלבים מרכזיים לחישה ביולוגית על ידי שימוש בטרנזיסטורי אפקט שדה של ננו-חוטי פוליסיליקון, כולל הכנת המכשיר וקיבוע ואישור של בדיקה מולקולרית של DNA על פני הננו-חוטים, כמו גם תנאים לחישת DNA.

הכנת טרנזיסטור הסיליקון Nanowire שדה ותוצאה עבור יישומים כימיים biosensing

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדוד את הכח של אינטראקציות בין משטח אורגני מוגדר היטב או פפטידים או חומצות אמינו על ידי מדידות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). המידע המתקבל מהמדידה חשוב להבין טוב יותר את שלבי חומר פפטיד-אורגנית.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסנתז חומרים סיליקה bioinspired, לשתק אנזימים המצוי בו. סיליקה הוא מסונתז על ידי שילוב של סודיום סיליקט, אמין 'תוספת', אשר מנטרלים בקצב מבוקר. ניתן לשנות תכונות של חומר ותפקוד בחיי עיר אנזים הנייח או פוסט-סינתטי • חומצה תנאי של תוספים שעברו אנקפסולציה.

הכנת סיליקה פונקציונלי באמצעות שיטת Bioinspired

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

עבודה זו נועדה להקל על הפיתוח של טכניקות סטנדרטיות עבור הספגה או השתלה של תרכובות aminated על מצעי סיליקה, אשר מתוארים לעתים קרובות בהרחבה בספרות. כמויות ספציפיות של ממס, מצע, אמינים וערכים של פרמטרים ניסיוניים חשובים אחרים יידונו בפירוט.

מתודולוגיה סינתטית להכנת חומרים מרוכבים מבוססי אמין ספוג ומושתל ללכידת פחמן

למדו שיטה לצימוד ביוטין לחיישנים אופטיים מסיליקה באמצעות כימיה של אסטר NHS. השיטה שומרת על רגישות הגבוהה ומאפשרת אחסון ממושך ללא אובדן פעילות.

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

גלה סרטונים נוספים