Name: אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: למדו לבודד ולאפיין תאי ECFC מדם טבורי אנושי לחקר ביולוגיית כלי דם ורפואה רגנרטיבית. השיטה כוללת ניתוח פוטנציאל התמדה קלונלית ויכולת יצירת כלי דם בתוך גוף חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד&quot;ר Yoder הוא יועץ טכנולוגיות EndGenitor, Inc וחבר מועצת המנהלים של Rimedion Technologies, Inc

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של המשוערים ובתאים אנדותל חשוב לזהות את ECFCs חרוצים וישרי דרך המסוגלים clonally ו סדרתי מחדש ציפוי בתרבות להצמיח עמיד ופונקציונלי כלי דם להשתלה in vivo. דם אדם חבל הטבור הוא מועשר ECFCs וריכוז אלה ירידות במחזור תאים עם הזדקנות או מחלה 10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ECFC עשוי לשחק תפקידים חשובים תיקון התחדשות כלי הדם או במצבים של פגיעה וסקולרית, אוטם שריר הלב, או רטינופתיה 17-19. <p class="jove_content" style=...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> נתרן הזרקת הפרין, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> ערבוב צינורית </td><td> מארסק רפואי </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> מוגדר FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE אקספרס </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> עכברוש סוג אני קולגן </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FCR חסום </td><td> Miltenyi ביוטק </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC conjugaטד </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, FITC מצומדות </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, מצומדות FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE מצומדות </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE מצומדות </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE מצומדות </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> גב &#39;IgG 1, נוגדן K, FITC מצומדות </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> גב &#39;IgG 1, נוגדן K, מצומדות PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> גב &#39;IgG 2 א, נוגדן K, FITC מצומדות </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> נגד אדם CD31 </td><td> Dako </td><td> שיבוט JC70 / </td></tr><tr><td> נגד mousדואר CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0.22-מיקרומטר מערכת סינון אבק </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית, 17.4N </td><td> דיג </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה Antimycotic </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> העובר שור בסרום (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC אבץ מקבע </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox מגיב ירוק </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> שיבוט צילינדרים, סטריליים </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

צפיות ארוכת שנים של יצירת כלי דם חדשים באמצעות אנגיוגנזה, vasculogenesis, ו arteriogenesis נבדקו לאחרונה 1. הנוכחות של מחזורי ובתאים אנדותל (EPCs) זוהו לראשונה על ידי אסהאךה ואח&#39; בדם למבוגרים היקפי האדם. בשנת 1997 2 להביא עירוי של השערות ואסטרטגיות חדשות התחדשות תיקון כלי הדם. EPCs הם מרכיבים נדירים אבל נורמלי של מחזורי הדם בבית לאתרים של היווצרות כלי דם או שיפוץ כלי הדם, ולאפשר גם vasculogenesis אנגיוגנזה לאחר הלידה, או arteriogenesis בעיקר באמצעות גירוי paracrine החומה כלי הקיים נובע תאים 3. סמן לא ספציפי לזהות EPC זוהה, וכיום המדינה השדה הוא להבין כי סוגי תאים רבים, כולל גזע hematopoietic proangiogenic ו ובתאים, מחזורי תאים angiogenic, Tie2 + ומונוציטים, cel אבי מיאלואידיתls, מקרופאגים הקשורים הגידול, מקרופאגים משופעלים מסוג M2 להשתתף מגרה את תהליך angiogenic במגוון רחב של מערכות מודל פרה בעלי חיים והן בבני אדם במדינות רבות המחלה 4, 5. בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) הם תאים נדירים במחזור אנדותל קיימא המאופיינים פוטנציאל חזק שגשוג משובט, המושבה משני שלישוני היכולת להרכיב על replating, ואת היכולת ליצור כלי מהותי ב vivo גבי השתלת לעכברים immunodeficient 6-8. בעוד ECFCs היו מבודדים בהצלחה מדם היקפי של נושאים בוגרים בריאים, חבל הטבור דם (CB) של תינוקות בריאים, והקיר כלי של מספר רב של כלי עורקי וורידי אדם 6-9, CB הוא בעל התדירות הגבוהה ביותר של ECFCs 7 כי התצוגה את הפוטנציאל הכי חזקים שגשוג משובט וצורה כלי דם עמיד תפקודית 8 vivo, 10-13. בעוד גזירתECFC מדם היקפי מבוגר הוצגה 14, 15, כאן נתאר את מתודולוגיות הגזירה, שיבוט ההרחבה, במבחנה, כמו גם אפיון vivo של ECFCs מן הטבור CB האדם.

בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) מסתובבים לתאי אנדותל עם פוטנציאל חזק שגשוג משובט המוצגים מהותי<em&gt; In vivo</emכלי&gt; יצירת היכולת. אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים תוצאה אנדותל הנגזרות CB חשוב לזהות ולבודד<em&gt; בתום לב</em&gt; ECFCs עבור יישומים קליניים פוטנציאל בתיקון רקמות שניזוקו.

תפיסות רב-שנתיות בנוגע להיווצרות כלי דם חדשים באמצעות אנגיוגנזה (Angiogenesis), וסקולוגנזה (Vasculogenesis) וארטריוגנזה (Arteriogenesis) נסקרו לאחרונה1. נוכחותם של...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להסביר כיצד לגזור תאי endothelial colony forming cells או e CFCs מדם חבל טבורי אנושי. הדבר מבוצע תחילה על ידי זריעה של תאים חד גרעיים מדם חבל הטבור, ולאחר מכן על ידי שיבוט והרחבה של צמיחות מושבות של E CFCs. השלב השני הוא לאפיין את התאים in vitro באמצעות טכניקת בדיקה חדשנית לתא בודד לבחינת פוטנציאל פרוליפראטיבי קלונאלי.לבסוף, התאים מאופיינים בבדיקה להיווצרות כלי דם in vivo, באמצעות ייצור והשתלה של ג'לים המכילים E CFCs בעכברי nod skid. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההיווצרות in vivo של כלי דם חדשים (de novo) מלאים בדם של המארח באמצעות צביעת h and e של השתלים התאיים המכילים ECFC. היתרון המרכזי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות הוא שהן מאפשרות לבחון את הפוטנציאל הפרוליפראטיבי של תאי אנדותל ברמת התא הבודד.ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו למציאת כלים אבחנתיים וטיפוליים למחלות כגון מחלת העורקים הפריפריאלית או PAD, מכיוון שטכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את הפוטנציאל הפרוליפרטיבי והקיבולת הגנית של התאים האנדותליאליים של המטופל. לפני תחילת הפרוצדורה, הוסיפו מיליליטר אחד של קולגן מזנב חולדה, סוג one, לכל באר בצלחת תרבית רקמות בעלת שש בארות, ולאחר מכן דגרו את הצלחת למשך לילה. ביום הפרוצדורה, חלקו את דם השערה למנות של 15 מיליליטר לתוך מבחנות צנטריפוגה קוניות של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיליליטר של PBS לכל מבחנה ושאבו את התערובת מעלה ומטה באמצעות פיפטה מספר פעמים.בשלב הבא, שאבו 15 מיליליטר של fial PA למטרתה, הניחו את קצה הפ pipette בתחתית המבחנה של הדם המדולל והוסיפו בזהירות את ה-alpac; סבבבבבו את המבחנות במשך 30 דקות ב-740 ×g בטמפרטורת החדר, ללא הגדרת בלם ההאטה. לאחר הפרדת התאים, השתמשו בפיפטת העברה כדי להוציא את השכבה העכורה של תאי מונונוקלאריים בעלי צפיפות נמוכה הממוקמת בממשק שבין ה-fial peak לבין הפלזמה המדוללת. העבירו את התאים שנאספו למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של מצע E GM two, וצנטריפוגו את התאים המונונוקלאריים למשך 10 דקות ב-515 ×g בטמפרטורת החדר עם הגדרת בלם האטה גבוהה; שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו.לאחר שטיפת התאים השקועים עם EGM two פעמיים, השעה אותם, את התאים חד-גרעיניים, ב-EGM two בריכוז של 1.25 times 10 to the seventh תאים למיליליטר. כעת, העבר בפיפט ארבעה מיליליטרים של תרחף התאים החד-גרעיניים לכל באר בלוח המצופה בקולגן והדגר את התאים עד להיווצרות מושבות ביום הראשון. לאחר ההדגרה, הסר באיטיות את המצע המנוצしたもの מהבארים באמצעות פיפט, מבלי להפריע לתאים בעלי ההיצמדות הרפויה.לאחר מכן, הוסיפו בזהירות ארבעה מיליליטר של E GM two לבארים והחזירו את הפלטה לאינקובטור. מושבות מופיעות בדרך כלל בין הימים 5 ל-14, יום לפני הפרוצדורה. ב-50 microliters של קולגן מזנב חולדה.הוסיפו אחת לכל באר בלוח 96 באערים כפי שנעשה קודם לכן, והדגירו את הלוח למשך הלילה ביום הפרוצדורה. התחילו בשטיפה כפולה עם PBS של תאים שעברו מעברים (passaging) פעמיים עד שלוש בלבד. לאחר שאיבת השטיפה האחרונה של PBS, הניחו צילינדר שיבוט סטרילי מצופה ג'ל מסביב לכל מושבה, תוך הצמדה חזקה של כל צילינדר ללוח באמצעות פינצטה סטרילית.הוסיפו שתי עד שלוש טיפות של triple E express חמים לכל גליל שיבוט (cloning cylinder) והדגירו את הגלילים למשך שלוש עד חמש דקות עד שהתאים יתחילו להיפרד. לאחר שהתאים החלו להיפרד, הוסיפו בקירוב 250 µL של מצע EGM two למרכז הגליל ובצעו פיפטאג מעלה ומטה כדי ליצור סספנזיה של תאים בודדים. כעת העבירו את סספנזיית התאים הבודדים מכל גליל שיבוט בנפרד למבחנה מיקרו-צנטריפוגית אינדיבידואלית.הדביקו את התאים בלוחית בעלת שש בארות באמצעות לנטיווירוסים המבטאים EGFP ואספו את התאים המבטאים EGFP באמצעות ציטומטריה פלורסצנטית. לאחר מכן, הדגרירו את התאים החיוביים ל-EGFP ו-EGM Two בלוחיות מצופות קולגן. כאשר ה-E CFCs מוכנים, אספו אותם באמצעות TrypLE Express כפי שהודגם כעת, וסספנדו מחדש את התאים במצע EGM Two לריכוז סופי של כ-10⁶ תאים למילליליטר.לאחר מכן, באמצעות מיין תאים (flow sorter) בקצב זרימה נמוך של 20 תאים לשנייה, מיין תא ECFC בודד חיובי ל-EGP לכל באער בתוך פלטת 96 באערים מצופה קולגן שהוכנה מראש; התאם את הנפח הסופי של כל באער עם EGM two לכ-200 microliters לבאער. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך כדי לוודא שכל באער מכיל תא אחד בלבד. דגרי את הפלטה למשך שבועיים, כולל שתי החלפות מדיום, עד ליום ה-14 של התרבית.שטפו כל באר עם 100 µL של PBS לפני קיבוע התאים באמצעות 100 µL של 4% paraformaldehyde למשך 30 דקות. עבור CFCs שאינם מבטאים EGFP, הוסיפו cyt reagent, צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק, לאחר הקיבוע ב-paraformaldehyde והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לכמת באופן חזותי את מספר התאים האנדותליאליים שהתרחבו; כפי שמוצג כאן, בארים עם מספר תאים אנדותליאליים של 2 עד 50 נחשבים לצברי תאים אנדותליאליים.בארים המכילות 51 עד 2000 תאים נחשבות ל-e CFCs בעלי פוטנציאל פרוליפרטיבי נמוך, ובארים עם 2001 תאים ומעלה נחשבות ל-e CFCs בעלי פוטנציאל פרוליפרטיבי גבוה. לאחר ניתוק התאים באמצעות triple E express כפי שבוצע קודם לכן, קבעו את מספר התאים החיים בתרבית התאים באמצעות המוציטומטר וצבע trypan blue. העבירו 2.4 מיליון תאים חיים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר, ולאחר מכן השקיפו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה.ערבבו היטב את הרכיבים עבור מטריצת הג'ל ולאחר מכן התאימו את ה-pH ל-7.4 באמצעות נתרבן (sodium hydroxide), תוך שמירה על התמיסה על קרח. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע ב-360 µL של e GM two חמים. לאחר מכן, הוסיפו 840 µL של תמיסת מטריצת הג'ל לתאים וערבבו את התמיסה בזהירות עד שהתאים מושעים לחלוטין בג'ל. העבירו ת сусפנזיה של ג'ל תאי זה בנפח של 1 mL לבאר אחת של פלטת תרבית רקמות בעלת 12 בארות, והדגירו את הפלטה עד להספגת (פולימריזציה) הג'ל.לאחר מכן, לפני דגירה למשך לילה, כסו בעדינות את הג'ל ב-2 mL של EGM-2 חמים. למחרת, ומיד לפני ההשתלה, השתמשו במספרי איריס כדי לחלק את הג'ל לשני חלקים שווים והחזירו את חלקי הג'ל לאותה באר תרבית המכילה מצע EGM-2. לאחר אישור ההרדמה באמצעות צביטה בבהונות, גלחו את הבטן התחתונה של עכבר nude, skid הרדום בן חמישה עד שישה שבועות, ונקו ביסודיות את אזור הניתוח באמצעות פדים של אלכוהול ובטדין בתנועות סיבוביות.בשלב הבא, השתמשו במספרי איריס חדים וסטריליים כדי לבצע חתך של כ-5 מילימטרים ברביע התחתון של הבטן, ובכך תחשפו את החלל התת-עורי שבין העור לשריר הבטן. בצעו דיסקציה קהה של שכבת העור מהשריר הבטני בשני אזורים שונים של הבטן כדי ליצור כיסים ברוחב 15 עד 20 מילימטרים, כאשר אחד מוביל כלפי מעלה לרביע העליון של הבטן והשני לאזור אחר בבטן. לאחר מכן, הרימו את שכבת העור בסמיכות לחתך.החדירו חצי חלק מהג'ל לתוך כיס בטני אחד וחצי חלק נוסף מהג'ל לתוך הכיס הבטני השני. לאחר החדרת הג'לים, סגרו כל חתך בשתי עד שלוש תפרים באמצעות חוט תפר פוליפרופילן 5-0 על מחט חותכת. סמנו את כרטיסי הכלובים ובצעו ניטור לאחר הניתוח ומתן משככי כאבים בהתאם לדרישות המוסדיות ודרישות הפרוטוקול.לאחר הקרבת בעל החיים ביום ה-14 להשתלה, נגב את בטנו של העכבר עם פדי אלכוהול וחתך את העור לאורך קו החיתוך המקורי. לאחר מכן, הסר מקרי עור מהמיקום המשוער של הג'לים. בצע חיתוכים היקפיים סביב הג'לים כדי להוציא כל שתל, ולאחר מכן העבר את השתלים שהוצאו למקבע אבץ.באמצעות טכניקת הפקה זו של ECFC, צפינו בצמיחה של התפתחות מושבות ראשוניות כבר ביום החמישי. שימו לב למורפולוגיית ה-"cobblestone" (ריצוף) של תרביות ECFC אלו ביום החמישי, כפי שמצוין על ידי ראשי החיצים. מושבות שהתרחבו מבטאות אנטיגנים אנדותליאליים, אך אינן מבטאות אנטיגנים המטופואטיים.כפי שמוצג בהערכה פנוטיפית מייצגת זו in vitro של תאי אנדותל ותאי המטופואטיים, אימונופנוטיפיה גילתה כי e CFCs מבטאים אנטיגנים אנדותליאליים כגון CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four, ו-NRP two, אך לא ביטאו אנטיגנים המטופואטיים, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR four או CD 1 33. באופן משמעותי, כפי שמוצג בגרף עמודות זה, מושבות מורחבות מציגות היררכיה מלאה של פוטנציאל פרוליפרטיבי קלונאלי ברמת התא הבודד, הנעה בין צבירי תאים של 2 עד 50 תאים ועד למושבות של יותר מ-200 תאים. מיקרוגרפים אלו של מושבות שצבעו ב-cyt, צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק, התקבלו לאחר ש-E CFCs המופקים מדם שרובי תורשתי תורבקו ברמת התא הבודד למשך 14 ימים.יתרה מכך, ה-CFCs יוצרים כלי דם אנושיים המוזנים בתאי דם אדומים של המארח כאשר הם מושתלים בעכברים עם חסר חיסוני. בצביעה זו של H&amp;E של שתלי ג'ל CELLULARIZE המכילים ECFC המופקים מדם טביליות, ניתן להבחין בכלי דם זעירים המלאים בתאי דם אדומים של המארח, אשר נוצרו בג'ל קולגן פיברונקטין לאחר 14 ימי השתלה. כאן, צביעת anti-human CD 31 בחום מאשרת עוד יותר את המקור האנושי של כלי דם אלו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים ECFCs מדם חבל טבילה אנושי, וכיצד לשבט, להרחיב ולאפיין את התפקוד של מושבות ECFC לאחר פיתוחן. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האנדותל של כלי הדם לבחון את הפוטנציאל הפרוליפרטיבי הקלוני ואת הפוטנציאל הגנומי של תאים אנדותליים המופקים ממקורות מרובים.

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

האנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs) הם כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס לתקן כלי הדם.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

פרוטוקול זה מאפשר יצירה ואפיון אמינים של תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs) מנפח קטן של דם היקפי בוגר. BOECs יכולים לשמש כתחליף לתאי אנדותל מחולים עם הפרעות בכלי הדם וכמצע ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

אפיון צמיחת דם תאי אנדותל (BOEC) מדם היקפי חזירי

למדו לבודד ולאפיין תאי ECFC מדם טבורי אנושי לחקר ביולוגיית כלי דם ורפואה רגנרטיבית. השיטה כוללת ניתוח פוטנציאל התמדה קלונלית ויכולת יצירת כלי דם בתוך גוף חי.

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

גלה סרטונים נוספים