אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להסביר כיצד להפיק תאים יוצרי מושבת אנדותל או e CFCs מדם טבורי אנושי. זה מושג תחילה על ידי ציפוי תאים חד-גרעיניים מדם טבורי, ולאחר מכן שיבוט והרחבה של צמיחת מושבה של E CFC. השלב השני הוא לאפיין את התאים במבחנה באמצעות טכניקת בדיקת תא בודד חדשה לפוטנציאל התפשטות משובט.

לבסוף, התאים מאופיינים בבדיקת יצירת כלי in vivo באמצעות ייצור והשתלה של ג'לים המכילים E CFCs בעכברי החלקה על הנהון. בסופו של דבר, ניתן להעריך את היווצרות in vivo של כלי דם מלאים במארח דה נובו על ידי צביעת h ו-e של ה-ECFC המכילים שתלים תאיים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני השיטות הקיימות הוא ששיטות אלו מאפשרות לבחון את פוטנציאל ההתפשטות של תאי אנדותל ברמת תא בודד.

ניתן להרחיב את ההשלכות של טכניקה זו למציאת כלים אבחנתיים וטיפוליים למחלות כמו מחלת עורקי פרא או PAD מכיוון שטכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את פוטנציאל ההתפשטות והיכולת הגנית של תאי האנדותל של המטופל. לפני תחילת ההליך, הוסף מיליליטר אחד של קולגן זנב עכברוש, הקלד אחד לכל באר של צלחת תרבית רקמות של שש בארות, ולאחר מכן דגר את הצלחת למשך הלילה ביום ההליך, הוציא את הדם הטבורי ביחידות של 15 מיליליטר לצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר PBS לכל צינור והעבירו את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים.

לאחר מכן, משוך 15 מיליליטר של פיאל PA לתוך פיפטה, הניח את קצה הפיפטה בתחתית צינור הדם המדולל והניח בזהירות את צנטריפוגת האלפק את הצינורות למשך 30 דקות ב-740 פעמים G בטמפרטורת החדר ללא הגדרת בלם ההאטה. לאחר הפרדת התאים, השתמש בפיפטה העברה כדי להסיר את השכבה המעורפלת של תאים חד-גרעיניים בצפיפות נמוכה הממוקמת בממשק בין פסגת הפיאל לפלזמה המדוללת. הוצא את התאים שנאספו לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של E GM שני מדיום וגלול את התאים החד-גרעיניים למשך 10 דקות ב-515 פעמים G בטמפרטורת החדר עם הגדרת בלם האטה גבוהה, שאב בזהירות והשליך את הסופרנטנט.

לאחר מכן, לאחר שטיפת התאים הגלולים ב-EGM פעמיים פעמיים, השעו אותם תאים חד-גרעיניים ב-EGM 2 ב-1.25 כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר. כעת פיפטה ארבעה מיליליטר של תרחיף התאים החד-גרעיניים לכל באר של הצלחת המצופה קולגן ודגירה על התאים עד להיווצרות מושבות ביום הראשון. לאחר הדגירה, הסר לאט את המדיום המושקע מהבארות בעזרת פיפטה מבלי להפריע לתאים הדבקים באופן רופף.

לאחר מכן הוסיפו בזהירות ארבעה מיליליטר של E GM שניים לבארות והחזירו את הצלחת לחממה. מושבות מופיעות בדרך כלל בין הימים החמישה ל-14 יום לפני ההליך. ב -50 מיקרוליטר קולגן זנב חולדה.

הקלד אחד לכל באר של צלחת 96 באר כמו קודם ודגירה על הצלחת למשך הלילה ביום ההליך. התחל בשטיפת תאים שעברו רק פעמיים עד שלוש פעמיים עם PBS. לאחר שאיבת השטיפה הסופית של PBS הניחו גליל שיבוט סטרילי מצופה ג'ל סביב כל מושבה, ולחצו כל גליל בחוזקה על הצלחת באמצעות מלקחיים סטריליים.

הוסף שתיים עד שלוש טיפות של טריפל E אקספרס חם לכל גליל שיבוט ודגר את הגלילים למשך שלוש עד חמש דקות עד שהתאים מתחילים להתנתק. לאחר שהתאים החלו להתנתק בכ-250 מיקרוליטר של EGM, שני מדיום למרכז הגליל ופיפטה למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף תא בודד. כעת העבירו את מתלה התא היחיד מכל גליל שיבוט בנפרד לצינור מיקרו צנטריפוגה בודד.

הדביקו את התאים בצלחת שש בארות עם EGFP המבטא לנטי-וירוסים ואספו את התאים המבטאים EGFP על ידי ציטומטריה פלואורסצנטית. לאחר מכן דגרו את התאים החיוביים EEG FP ואת ה-EGM 2 בצלחות המצופות קולגן. כאשר ה-E CFCs מוכנים, אסוף אותם באמצעות טריפ E אקספרס כפי שהודגם זה עתה והחייאה השעו את התאים ו-e GM שני בינוניים עד לריכוז סופי של כ-10 עד שישי תאים למיליליטר.

לאחר מכן, באמצעות סדרן זרימה עם קצב זרימה נמוך של 20 תאים לשנייה, מיין ECFC חיובי אחד לבאר לתוך צלחת 96 בארות מצופה קולגן שהוכנה קודם לכן, התאם את הנפח הסופי של כל באר עם EGM שניים עד כ-200 מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי להבטיח שכל באר מכילה תא אחד בלבד. דגרו על הצלחת במשך תקופה של שבועיים עם שני שינויי מדיה ביום ה-14 של התרבית.

שוטפים כל באר עם 100 מיקרוליטר PBS לפני תיקון התאים עם 100 מיקרוליטר של 4% אלדהיד פרפורמי למשך 30 דקות. עבור e CFCs שאינם מבטאים EGFP מוסיפים מגיב ציט, צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק לאחר קיבוע פרה-פורמלדהיד ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לכמת באופן גלוי את מספר תאי האנדותל המורחבים כפי שמודגם כאן, בארות עם מספר תאי אנדותל של שניים עד 50 נחשבות לאשכולות תאי אנדותל.

בארות עם 51 עד 2000 תאים הן בעלות פוטנציאל התפשטות נמוך e CFCs ובארות עם 2001 או יותר נחשבות ל-CFCs עם פוטנציאל התפשטות גבוה. לאחר ניתוק התאים עם אקספרס E משולש כמו קודם, קבל ספירת תאים בת קיימא של תרבית התאים על ידי המו, ציטומטר וטריאן כחול. העבירו 2.4 מיליון תאים ברי קיימא לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ולאחר מכן גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה בזמן שהתאים מסתובבים כלפי מטה.

מערבבים היטב את הרכיבים למטריצת הג'ל ולאחר מכן מכוונים את ה-pH ל-7.4 עם נתרן הידרוקסיד תוך שמירה על התמיסה על הקרח. לאחר השלכת הסופרנטנט יש להשעות את הגלולה ב-360 מיקרוליטר של נוזל חם e GM שתיים. לאחר מכן הוסף לתאים 840 מיקרוליטר מתמיסת מטריצת הג'ל וערבב את התמיסה בזהירות עד שהתאים מושעים היטב בג'ל העבירו את תרחיף הג'ל התאי של מיליליטר אחד לבאר אחת של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות ודגרו את הצלחת עד שהג'ל מתפלמר.

לאחר מכן, לפני הדגירה למשך הלילה, יש לכסות בעדינות את הג'ל בשני מיליליטר EGM חם שניים למחרת ומיד לפני ההשתלה. השתמש במספריים לקשתית כדי לנתח את הג'ל לשתי חתיכות שוות ולהחזיר את חתיכות הג'ל לאותה תרבית המכילה היטב e GM שני מדיום. לאחר אישור הרגעה על ידי צביטת הבוהן, גלחו את הבטן התחתונה של הנהון מורדם בן חמישה עד שישה שבועות, החליקו עכבר ונקו היטב את מקום הניתוח על ידי סיבוב רפידות אלכוהול ובטאדין.

לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים חדים לקשתית כדי לבצע חתך של כחמישה מילימטר ברבע התחתון של הבטן, ולחשוף את החלל התת עורי בין העור לשריר הבטן. בלאנט. נתחו את שכבת העור משריר הבטן בשני אזורים שונים של הבטן כדי ליצור כיסים ברוחב של 15 עד 20 מילימטרים, אחד מוביל לרביע הבטן העליונה ואחד לאזור אחר של הבטן. ואז להרים את שכבת העור פשוט להתפנק עד החתך.

הכנס חצי חתיכה אחת של הג'ל לכיס בטן אחד בחצי חתיכת הג'ל השנייה לכיס הבטן השני. לאחר החדרת הג'לים, סגור כל חתך בשניים עד שלושה תפרים באמצעות חמישה תפרי פוליפרופילן על מחט חיתוך. סמן את כרטיסי הכלוב ובצע ניטור ושיכוך כאבים לאחר הניתוח בהתאם לדרישות המוסד והפרוטוקול.

לאחר הקרבת החיה ביום ה-14 להשתלה, יש לספוג את בטנו של העכבר עם רפידות אלכוהול ולחתוך את העור המקושר לקו החתך המקורי. ואז כרתו דשי עור מטופחים למיקום המשוער של הג'לים. חותך באופן היקפי סביב הג'לים כדי להסיר כל שתל, ולאחר מכן מניח שתלים כרותים לתוך מקבע האבץ.

באמצעות טכניקת גזירת ECFC זו, צפינו בצמיחה של היווצרות מושבה ראשונית כבר ביום החמישי. שימו לב למורפולוגיה המרוצפת של חמש תרבויות ECFC אלה כפי שמצוין על ידי ראשי החצים. מושבות מורחבות מבטאות אנטיגנים אנדותליים, אך אינן מבטאות אנטיגנים המטופויאטיים.

כפי שמוצג בהערכה פנוטיפית מייצגת זו במבחנה של תאים אנדותליים והמטופויאטיים, אימונופנוטיפ גילה כי e CFCs מבטאים אנטיגנים אנדותליים כגון CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four ו-NRP two, אך לא ביטאו אנטיגנים המטופויאטיים, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR four או CD 1 33. חשוב לציין, כפי שמיוצג בגרף עמודות זה, מושבות מורחבות מציגות היררכיה מלאה של פוטנציאל התפשטות משובט ברמת התא הבודד שנע בין אשכולות של שניים עד 50 תאים ועד למושבות של יותר מ-2001. מיקרוגרפים אלה של מושבות מוכתמות בציט, צבע גרעיני פלואורסצנטי ירוק התקבלו לאחר ש-E CFCs שמקורם בדם טבורי תורביות ברמת התא הבודד במשך 14 יום.

יתר על כן, e CFCs יוצרים כלי דם אנושיים המוחדרים בתאי דם אדומים מארחים כאשר הם מושתלים בעכברים חסרי חיסון. בצביעה זו של ECFC שמקורו בדם טבורי המכילים שתלי ג'ל CELLULARIZE, ניתן להבחין במיקרו-כלי דם מלאים בתאי דם אדומים מארחים שנוצרו בג'ל הקולגן פיברונקטין לאחר 14 יום של השתלה. כאן, הצביעה האנטי-אנושית CD 31 בחום מאשרת עוד יותר את מקורם האנושי של כלים אלה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפיק e CFCs מדם טבורי אנושי, וכיצד לשכפל, להרחיב ולאפיין את הפונקציונליות של מושבות ECFC לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים באנדותל כלי הדם לחקור את פוטנציאל ההתפשטות של שיבוט האנדותל ואת היכולת הגנית של תאי אנדותל המתקבלים ממקורות מרובים.