MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת את רמות הביטוי של מולקולות micro RNA ברקמת סרטן ערמונית וברקמת ערמונית נורמלית באמצעות quantitative real-time PCR. מטרה זו מושגת תחילה על ידי מיצוי RNA כולל מרקמות ערמונית, הכולל mRNA, micro RNA ו-RNAs קצרים אחרים.

בשלב הבא, ה-RNA עובר תעתוק הפוך להפקת cDNA. לאחר מכן, מבוצעת בדיקת real-time PCR מבוססת cyber green, תוך שימוש ב-cDNA כתבנית להגברה וכמות של ביטוי microRNA בזמן אמת. התוצאות המתקבלות מראות את הביטוי היחסי של microRNAs בדגימות פרוסטה שונות על בסיס quantitative realtime PCR.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות הוא שהיא מציעה רגישות, דיוק והדירות גבוהים, והיא מהירה וחסכונית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, שכן ביטוי של microRNA נמצא לעיתים קרובות במתאם עם גנים המעורבים באופן משמעותי בתהליך הסרטני. לפיכך, אנו יכולים להשתמש ב-QPCR כדי להעריך את הביטוי של microRNAs ולבדוק כיצד הוא נמצא במתאם עם משתנים קליניים.

סמנים ביולוגיים אלו עשויים לשמש ככלים לאבחון ולפרוגנוזה כאחד. הם עשויים לסייע לנו לאבחן סרטן ערמונית, וכן לעזור לנו לקבוע אילו סוגי סרטני ערמונית הם אגרסיביים. בנוסף, קייм פוטנציאל לסמנים ביולוגיים אלו לשמש כסוכנים טיפוליים.

שיטה זו לא רק יכולה לספק תובנות לגבי הגנזה של גידולי פרוסטטה, אלא עשויה להיות ישימה גם לסוגים אחרים של סרטנים ומחלות. אספו דגימות פרוסטטה בזמן הניתוח (ectomy) וכווןו את הדגימה באמצעות נקודות ציון אנטומיות. צבעו את הפרוסטטה ואת שלפוחית הזרע באופן הבא: צד ימין בירוק וצד שמאל בכחול.

קחו חיתוך רוחבי אקראי של הרקמה בניצב לפני השטח של הרקטום, הקפיאו את הדגימה ואחסנו אותה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. צלמו את הפרוסות של הדגימות, כוונו אותן וחלקו אותן לארבעה חלקים שווים. התייעצו עם פתולוג כדי לקבוע את אזורי הגידול לעומת האזורים הנורמליים בתמונה התואמת.

השתמש באזורים המסומנים כמדריך לזיהוי רקמת גידול לצורך הפקת RNA לצורך בידוד RNA. התחל בהנחת דגימות פרוסטטה קפואות על קרח יבש תוך התייחסות לצילום המועתק המסומן. גזור חלק קטן מגידול הפרוסטטה.

בצעו הומוגניזציה לרקמת גידול הפרוסטטה במיליליטר אחד של ריאגנט triol. דגרו את הדגימות ההומוגניות למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו לדגימות 0.2 מיליליטר של כלורופורם ונערה בעוצמה למשך 15 שניות.

דגרו את הדגימות למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-12,000 ×g למשך 15 דקות ב-4 °C. העבירו את הפאזה המימית העליונה חסרת הצבע למבחנות חדשות והוסיפו 0.5 milliliters של isopropyl alcohol. דגרו את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-12,000 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C.

שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע המכיל את ה-RNA. הוסיפו מיליליטר אחד של ethanol 75% למשקע ה-RNA, ערבבו במכשיר vortex, והשקיעו את הדגימה באמצעות סרטיפוגציה למשך חמש דקות ב-7,500 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שוב, שאבו את הנוזל העליון ויבשו את משקע ה-RNA למשך חמש עד 10 דקות, תוך וידוא שהוא אינו יבש לחלוטין.

הממיס את המשקע במים נטולי נוקלאז ומדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש בביואנלייזר (bioanalyzer) כדי לבדוק את האיכות והשלמות של דגימות ה-RNA. בצע תעתוק הפוך של ה-RNA ל-CDNA באמצעות ערכה לתעתוק הפוך בהתאם להוראות היצרן.

כדי להפיק עקומת סטנדרט, הכין סדרת מהלולים של ה-CD NA המקורי מדגימה הידועה כבעלת ביטוי משמעותי של הגן הנחקר. בצע real-time PCR על ידי הכנת תערובת מאסטר (master mix) המבוססת על נפח תגובה של 20 µL של two x quant. Detect cyber green PCR master mix, ‏10 x microscript universal primer, ‏10 x microscript primer assay ומים נטולי RNase.

הוסיפו שתי סדרות של פריימרים, אחת עבור הגן המטרה ואחרת עבור הגן הייחוס, שבמקרה זה הוא RNU six B. טפטפו 2 µL מכל דילול של ה-CDNA למבחנות קפילריות בודדות עבור ה-light cycler, והוסיפו 18 µL של תערובת מאסטר (master mix). השתמשו במתאם קפילרי לצורך צנטריפוגה. הכניסו את הקפילרות למכשיר realtime cycler מבוסס קפילרות והריצו את תוכנית ה-PCR באופן הבא: 95 °C למשך 15 דקות, ולאחר מכן 50 מחזורים של 94 °C למשך 15 שניות.

55 °C למשך 30 שניות ו-70 °C למשך 30 שניות. בחר דגימה שתשמש ככיול (calibrator) והגדר את כמות היעד הנורמלית שלה כ-1. השווה את הביטוי היחסי של ה-microRNA בכל שאר הדגימות ביחס לדגימת הכיול כדי להפיק עקומות הגברה.

עבור תגובות ה-PCR, השתמש בתוכנת ה-light cycler של molecular biochemicals גרסה 3.5 בלשונית ה-quantification. כמת את התגובות וייצא את הנתונים לקובץ טקסט. ייבא את הנתונים לתוכנת הניתוח REL quant כדי להפיק תוצאות כמותיות.

ייבאו קבצים נפרדים עבור נתוני הגן מטרה, הגן הייחוס ועקומת הסטנדרט. הגדירו את מיקום הקליברטור עבור הגן מטרה והגן הייחוס, וכן את מיקומי הדגימות. הנתונים מוצגים כיחס בין הגן מטרה לגן הייחוס של דגימות שונות, חלקי היחס בין הגן מטרה לגן הייחוס של הקליברטור.

השתמשו בעקומת הסטנדרט שהופקה בעבר עבור micro RNA וגן בית (housekeeping gene) ספציפיים כסטנדרט ייחוס להשחלה (extrapolation) של נתונים כמותיים עבור micro RNA עם ריכוזים לא ידועים. נתוחו שלוש דגימות כקבוצה וחשבו את ריכוזי הממוצע ואת סטיות התקן של השלישייה.

אם אחת מהחזרות המשולשות אינה עקבית עם שאר הקבוצה, התוכנה תסיר אותה. מוצג כאן דוגמה לניתוח A-Q-P-C-R של דגימות מפרוסטה. הגרפים המראים את רמות הביטוי של הגן הייחוס U six מתחילים הגברה אקספוננציאלית בסביבות מחזור 20, בעוד שהביטוי של גן המטרה, MIR 98, הראה הגברה מושהית סביב מחזור 25.

הנתונים מניסוי זה יוצאו כקובץ טקסט ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח רלוונטית שבה מוגדרים מיקומי הקפילרות המכילות את כיליברטור ואת הדגימות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד כאשר היא מבוצעת כראוי. מהימנותה של טכניקה זו תלויה באיכות ה-RNA.

לפיכך, חשוב להקפיד במיוחד בעת הטיפול ב-RNA מכיוון שהוא עלול להתפרק בקלות רבה.