הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק במהירות אוכלוסייה מועשרת של לוקוציטים חיוביים ל-GR one המכילה תאי מדכאים ממקור מיאלואי (myeloid derived suppressor cells) או MDSCs מטחול של עכברים, לשימוש במבחנים in vivo ו-in vitro. ראשית, טחולים ממספר עכברים מאוגדים ומעובדים כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. כדי לכמת את אחוז ה-MDSC לפני ההעשרה, אליקווט קטן מהתאים המאוגדים מועבר לפלטת 96 בארות עם תחתית בצורת V.

סימון של אנטיגנים שטח מסוג MAC one ו-GR one, והעברת התאים המסומנים למבחנות fax לצורך אנליזה בציטומטריית זרימה. שאר הלוקוציטים המאוגדים נצבעים באמצעות נוגדן נגד GR one המצומד לפלואורוכרום, ומודגדים עם מיקרו-חרו지를 מגנטיים, הנקשרים לפלואורוכרום שעל הנוגדן נגד GR one. לאחר מכן, האוכלוסיות החיוביות ל-GR one והשליליות ל-GR one מופרדות באמצעות מפריד AutoMax pro כדי להעריך את הצלחת ההעשרה של GR one באוכלוסייה.

נלקחת אליקוט קטנה המנותחת לבדיקת ביטוי של GR one ו-MAC one כדי להעריך את אחוזי ה-MDSC. השוואה של נתוני האימונופנוטיפינג שהתקבלו מדגימה עלייה באחוזי ה-MDSC באוכלוסיית הלוקוציטים המועשרת ב-GR one בהשוואה לאוכלוסייה שאינה מועשרת. בנוסף, קיימת עלייה ב-naive MDSC, המניבה אוכלוסייה הדומה ל-MDSC ממנשאי גידול.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעת זרימה קונבנציונלית ומיון מבוסס ציטומטריית זרימה במהירות גבוהה של m DSCs מרקמות לימפואידיות, הוא שטכניקת ה-master mix שלנו מונעת שונות משמעותית בתוצאות על ידי הבטחת צביעת שטח שווה של מאגר הלוקוציטים, לצורך טיפוס (typing) ומיון AutoMax של m DSCs ותאים חיוביים ל-GR 1 בהתאמה. את הפרוצדורות תדגים נדין נלסון, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו, וד"ר הו-סרה, מנהלת מרכז הליבה לציטומטריית זרימה ב-USF. יש לבצע את ההליך הבא בסביבה סטרילית תחת מ 빠르게 ביולוגי, כאשר התאים והנוגדנים נשמרים על קרח.

בכל פעם שניתן, הרכיבו את נפה לפירוק התאים על ידי הכנסת רשת הסינון לתוך פתח הכוס לכיוון התחתית. לאחר מכן, הכניסו את טבעת האיטום לאזור ההברגה כאשר הצד החרוץ פונה כלפי מעלה, והשתמשו במפתח הטבעת כדי להדק את טבעת האיטום ולבסס את קיבוע הרשת. הניחו את הנפה המורכבת בתוך צלחת פטרי המכילה 10 milliliters של תמיסת XPBS אחת.

יש להוציא טחולים מעכברים מסוג C 57 black six בני ששה עד שמונה שבועות, נושאי גידולים או עכברי ביקורת נאיביים, ולהניחם על רשת הסינון של נפת פירוק התאים. לאחר מכן, יש להשתמש בעלי פיתול מזכוכית כדי לטחון את הטחולים דרך רשת הסינון אל תוך צלחת פטרי. יש לחזור על תהליך זה עבור כל קבוצת טיפול של העכברים.

בשלב הבא, באמצעות פיפט סרולוגית של 5 ml, העבירו את תרחיף התאים למסננת תאים של 70 מיקרון והניחו להם להסנן אל תוך מבחנה קונית של 50 ml. צנטריפוגו ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקע על ידי הוספת 5 ml של RBC lysis buffer לכל טחול וביצוע פיפוט נמרץ מעלה ומטה. הדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר ההדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספת 20 ml של PBS וביצוע פיפוט נמרץ מעלה ומטה.

לאחר מכן, סנטריפוגו ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השהו את המשקע (pellet) ב-20 milliliters של PBS סטרילי וספרו את התאים. באמצעות trypan blue והמוסייטומטר (hemocytometer), השהו מחדש את התאים בריכוז של 1×10⁷ עד 2×10⁷ תאים ל-milliliter בתווך צביעה של 3%Staining medium. השגת צביעה אופטימלית היא ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה.

ניתן לבצע זאת בהצלחה על ידי טיטרציה מוקדמת של הנוגדנים. השתמשו בהכנת תערובות מאסטר (master mixes) ובצביעה שטחית בנפחים קטנים כפי שמתואר בפרוטוקול זה. כדי לצבוע את התאים לצורך אנליזה בציטומטריה עם זרימה, סמנו את הבארות של פלטת vbo בעלת 96 בארות עבור דגימות ביקורת ודגימות ניסוי, וכן עבור צביעות בודדות.

עבור בקרות פיצוי, הוסף 5×10⁵ עד 1×10⁶ תאים ב-50 µL לכל אחת מהבארות המסומנות. לאחר מכן, סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, התבונן בפלטה מלמטה.

הביטו כלפי מעלה כדי לוודא שקיימים משקעים בבארות, והכינו תערובת מאסטר של חסימת mouse BDFC המכילה נוגדן מונוקלונלי rat anti muse CD 1632 המדולל בתווך צביעה של 3% בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח עם ערבוב בוורטקס. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגה קצרה למשך חמש שניות תוך החזקת פלטת 96 בארות בעלת תחתית V מעל מיכל פסולת או כיור. הפכו את הפלטה במהירות הלוך וחזור כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפר את משקעי התאים.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תערובת FC block master mix לכל המשקעים בלוחית 96 בארי עם תחתית בצורת V, וערבבו על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה. הניחו את הלוחית על קרח והדגירו למשך 15 דקות בחושך; סובבו את הלוחית בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. הכינו תערובת master mix של נוגדי Mac one fitzy ו-GR one A PC מדוללים ב-3% Staining medium בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 mL על קרח.

בצעו ערבוב מהיר (Vortex) וצנטריפוגה קצרה למשך חמש שניות. לאחר הסבב, הפכו את הפלטה כדי להסיר את העלייה (supernatant) מכל באר, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL מתערובת הנוגדנים למשקעים של הביקורת או של הניסוי. ערבבו היטב על ידי שאיבה ופליטה עדינה (pipetting) בעזרת פיפטה. עבור פיצויים של צביעה בודדת, הוסיפו 50 µL של MAC one F GR one A PC או DPI מדוללים בתווך צביעה של 3% לבארי המתאימות. עבור בקרת ללא צביעה, הוסיפו 50 µL של תווך צביעה 3% לבאר המתאימה וערבבו.

לאחר מכן, דגרו את הפלטה למשך 30 דקות בחושך על קרח. במהלך הדגירה, סמנו מבחנות fax כך שיתאימו לכל באער בפלטה והוסיפו 200 µL של תווך צביעה 3% לכל מבחנת fax. עם סיום זמן הדגירה של 30 דקות, סבבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות.

לאחר הסבוב, הסר את העל-נוזלים כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, שטוף את המשקעים על ידי הוספת 100 µL של תמיסת צביעה בריכוז 3% לכל משקע. ערבב היטב באמצעות פיפוט עדין למעלה ולמטה.

סבב את הפלטה שוב בצנטריפוגה למשך חמש דקות. חזור על שלב השטיפה פעם נוספת לאחר הסבב, הסר את ה-natin כפי שנעשה קודם לכן, והשעה מחדש כל משקע ב-100 µL של תוכה לצביעה בריכוז 3% וערבב היטב. לאחר מכן, העבר 100 µL של התאים שהושעו מכל באר בפלטה למבחנת fax המסומנת בהתאם.

לאחר מכן, הוסיפו 75 nanograms per milliliter של DPI לדגימות הביקורת ולדגימות הניסוי, וכן לבקרת הפיצוי לצביעה בודדת של DPI. בצעו רכישת נתונים ציטומטריים כדי לקבוע את אחוזי ה-MDSC כפי שמתואר במסמך המצורף; לאחר מכן, העבירו עבור העשרה של leukocytes חיוביים ל-GR one מנה אחת של 10 to the seventh מה-leukocytes הבלתי צבועים שנותרו למבחנות fax מסומנות כראוי, וסבבו אותן בצנטריפוגה ב-250 to 300 times G למשך חמש דקות. הוסיפו 50 microliters של דילול 1 to 10 של נוגדן GR one PE בבופר max והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius בחושך.

לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר של max buffer לכל מבחנת fax וסבב במערך צנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבב, השלך את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הוסף לכל מבחנה 200 µL של דילול 1:4 של anti PE microbeads ב-max buffer והדגר למשך 15 דקות ב-4 °C בחושך.

הוסיפו 2 mL של max buffer למבחנות ה-fax וסבבו בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, השביו את המשקע ב-3 mL של staining buffer וסננו דרך מסננת של 70 micron לתוך מבחנה קונית חדשה ומסומנת של 50 mL. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהפרדה מגנטית אוטומטית.

הפרדה מגנטית היא בחירה מצוינת של שיטה. אם עליכם להפריד מספר רב של תאים במהירות, באופן חסכוני ועל בסיס סמן פני, ודאו כי תבדקו את התוצאות בסיום התהליך באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי להכין ולהפעיל את המפריד AutoMax pro, ודאו שכל הבקבוקים מלאים בתמיסות המתאימות.

הפעל את המכשיר. לאחר האתחול, בדוק את מצב מיכלי הנוזלים והעמודות. כל הסמלים צריכים להיות ירוקים.

בשלב הבא בתפריט, בחרו ב-separation מסרגל התפריטים העליון ולאחר מכן ב-wash. כעת, מסרגל התפריטים התחתון, בחרו ב-rinse מהאפשרויות הנפתחות ולאחר מכן ב-run כדי להתחיל בתהליך ההכנה (priming). לאחר שתהליך ההכנה יושלם בהצלחה, המכשיר יציג כי הוא מוכן לביצוע הפרדה (separation).

בתפריט הסטטוס (status), הניחו את השפופרת הקונית בנפח 50 milliliter עם התאים המסומנים מגנטית בשורה A של מעמד שפופרות מקורר ובגודל מתאים. לאחר מכן, הניחו שפופרת קונית בנפח 50 milliliter לאיסוף הפракציה השלילית בשורה B ושפופרת קונית בנפח 15 milliliter לאיסוף הפракציה החיובית בשורה C, ובחרו בתוכנית הפרדת תאים POS cell S לבחירה חיובית של תאי מטרה מסומנים במצב רגיש (sensitive mode) מדגימות. עם תחילת התוכנית, תאי המטרה המסומנים מגנטית יישמרו בעמודת ה-AutoMax בעוד שתאים שאינם מסומנים ישוחררו אל שפופרת איסוף הפракציה השלילית בשורה B. לאחר מכן המגנט ייסוג ותאי המטרה המסומנים ישוחררו אל שפופרת האיסוף החיובית בשורה C של מעמד השפופרות.

לאחר ההעשרה, השתמשו ב-trian blue וב-hemo cytometer כדי לספור מחדש את הפראקציות של GR one positive ו-GR one negative. לאחר מכן, השעיו את התאים בריכוז של 1×10⁷ תאים למיליליטר עד 2×10⁷ תאים למיליליטר בתווך צביעה של 3% והעבירו 50 µL למבחנות fax מסומנות בהתאם. צבעו את התאים ב-MAC one ובצבע הבדיקה DPI עבור ציטומטריית זרימה ופיצויים של צביעה בודדת.

בצע רכישת נתונים בציטומטריה זרימה כדי לקבוע את האחוזים של תאים חיוביים ל-GR one ותאים שליליים ל-GR one, וכן כדי להשוות את אחוזי ה-MDSC לפני ואחרי AutoMax. טחולים נאספו מעכברים עם גידולים בלבלב ומעכברים נאיביים ועובדו לתליי של תאים בודדים כפי שמתואר במאמר וידאו זה. ציטומטריה זרימה בוצעה כדי לבחון לוקוציטים נאיביים שסומנו על פני השטח באמצעות נוגדנים מצומדים לפלואורסצנציה עבור MAC one ו-GR one כפי שמוצג כאן; רק אחוז נמוך מאוד, 1.19% של MDSCs נאיביים חיוביים ל-MAC one ו-GR one, נראה לפני העשרה ב-AutoMax. עם זאת, בעקבות העשרה של האוכלוסייה החיובית ל-GR one, תת-אוכלוסיית תאים זו גדולה משמעותית, 10.5% מהנאיביים, וכעת היא דומה ל-25.3% מעכברים עם גידולים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כולל accelerated MDSC, מיון באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry) בניסויי העברה adopted transfer in vivo, qPCR כמותי ו-western blotting, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע למנגנונים המולקולריים האחראים להתרחבות, נדידה ודיפרנציאציה של MDSC, ולדיכוי התגובות החיסוניות על ידי תאים אלה.