Name: הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: למדו שיטה מהירה להעשרת תאי MDSC מטבולות עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיון מגנטי AutoMACS. הטכניקה מבודדת תאי Gr-1+ חיים לניסויים בתרבית ובחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים cytometry זרימה USF Core Facility. ברצוננו להודות לד&quot;ר דניס קופר על שיתוף משאבים. אנו רוצים גם להודות מאיה כהן, לורה פנדלטון ודיאנה לאטור על עזרתם בהקמת והסרטה של ​​סרט זה. NN נתמך על ידי גשר NSF FG-LSAMP כדי אחוות דוקטורט HRD # 0929435. עבודה זו מומנה על ידי האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מרכז המחקר גרנט # סרטן 93-032-13/Moffitt הוענק TG.

לפני שמתחילים, להכין את הפתרונות הבאים: 3 מכתים% Media (SM): עוברי -3% בסרום שור (FBS) ב 1X מאגר מלוחים פוספט (PBS) מאגר MACS (MB): - 0.5% אלבומין סרום מ שור (BSA) ב 1XPBS 1. קציר spleens של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי להזריק 6-8 בשבוע של C57BL גיל / 6 עכברים (הרלן) עם 1.5 x 10 5 Murine Panc02 תאים תלויה 100 μl 1x PBS (גידול נושאת; TB). עכברים שליטה (נאיבי) מקבלים 100 1XPBS μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 4 שבועות הזרקת הודעה, להרדים עכברים ידי מחנק פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spleens קציר מעכברים ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים ושוקלים באמצעות איזון. Spleens מקום ב נפרד, שכותרתו 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי המכילים 1 X PBS. </li></ol> 2. צור מתא בודד Suspension של Leukocytes מ spleens הנהלים כל יש לבצע בסביבה סטרילית מתחת למכסה המנוע בטיחות ביולוגית תאים ונוגדנים שמרו על הקרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא דיסוציאציה מסננת ידי הוספת מסך רשת לתוך פתח הספל לתחתית. לאחר מכן, הכנס את הטבעת שמירה לאזור הליכי עם הצד מחוררת ולשימוש המפתח טבעת להדק את הטבעת שמירה, ובכך מחזיק את המסך במקום. מניחים את המסננת התאספו בצלחת פטרי שמכילה 10 מ&quot;ל 1 X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spleens ביליארד וזכוכית ועלי שימוש לטחון spleens על המסך רשת של תאים דיסוציאציה מסננת לתוך צלחת פטרי. חזור על הפעולה עבור כל קבוצת טיפול של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ההשעיה מסנן לתוך צינור מ&quot;ל 50 חרוטי באמצעות תא 70 מיקרומטר מסננת פיפטה 5 מ&quot;ל סרולוגית. סרכזת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend גלולה של 5 מ&quot;ל 1 חיץ RBC x תמוגה לכל הטחול. Pipet למעלה ולמטה במרץ. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 20 מ&quot;ל של 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ. סרכזת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 20 מ&quot;ל סטרילי 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות trypan כחול hemacytometer ו resuspend בריכוז הרצוי SM 3% עד 50 μl שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 -7 תאים / מ&quot;ל - 2x10 7 תאים / מ&quot;ל). </li></ol> 3. על פני קרום התא מכתים / Immunophenotyping של MDSC באמצעות cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג את הבארות של צלחת 96-V גם למטה לבקרה דגימות הניסוי וכתמים בודדים עבור פקדים פיצויים (לא כתם, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC ו DAPI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5x10 5-1x10 6 תאים שווה ערך ל μl 50 / היטב splenocytes לבארות שלהם בצלחת V-96-התחתונה גם כן. סרכזתצלחת ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &quot;מיקס מאסטר&quot; (מ&quot;מ) של עכבר BD Fc בלוק (אנטי עכבר עכברוש CD16/32 נוגדן חד שבטי) מדולל SM 3%, בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל על הקרח. כנקודת מוצא, השתמש 1 מיקרוגרם Fc בלוק ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לפי היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב על ידי צלחת היפוך במהירות מצד אל צד, על מיכל הפסולת או כיור ללא הפרעה של כדורי סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, בקצרה סרכזת MM Fc חסום למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לכל כדורי בצלחת V-96-התחתונה גם כן. מערבבים היטב בעדינות pipetting למעלה ולמטה, והשאיר הדגימות בבארות שלהם. דגירה הצלחת במשך 15 דקות בחושך על הקרח. סרכזת צלחת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &quot;מיקס מאסטר&quot; (מ&quot;מ) של fluorochrome-מצומדות נוגדנים בדילול ב SM 3% בצינור microcentrifuge 1.5ml על הקרח, בעוד דגימות דגירה עם בלוק FC. נוגדנים יש טיטרציהכדי לקבוע דילולים אופטימליים מכתים ההליכים. כנקודת מוצא, לשלב דילול של 1:25 Mac-1-FITC ו 1:20 דילול של Gr-1-APC ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לדגימה גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, בקצרה סרכזת מ&quot;מ ניאון מצומדות נוגדנים צביעה למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לשלוט כדורי ניסיוניים. מערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. עבור יחיד כתם פיצויים, להוסיף דילול של 1:25 Mac-1-FITC, 1:20 דילול של Gr-1-APC ו 75 ng / mL של DAPI, ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 דולר גם לבארות, בהתאמה. הוסף 50 μl SM 3% ל בלא כתם היטב (לא הכתם). מערבבים היטב דגירה תאים 96-גם צלחת V-התחתונה למשך 30 דקות בחושך על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS תווית צינורות (5 מ&quot;ל, 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ קלקר עגולים צינורות למטה) כדי מתאימות גם כל צלחת גם 96-V-התחתונה. הוסף 200 μl SM 3% לכל אחד FACSצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת צלחת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות ולהסיר supernatants. לשטוף את כדורי על ידי הוספת 100 SM 3% μl לכל גלולה ומערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. סרכזת צלחת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. חזור על שלב לשטוף שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל. Resuspend כל גלולה ב SM 100 3% μl ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl גלולה resuspended מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב צינור FACS שכותרתו בהתאמה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תזרים cytometry, להוסיף 75 ng / ml DAPI לשלוט דגימות ניסויים ובקרה DAPI אחת פיצוי הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע cytometric זרימת נתונים רכישת אחוזי MDSC. לבצע באמצעות פיצוי שלילי (אין שליטה כתם) ואת בקרות חיוביות בודדות. הגדר את העלילה נקודה המציג פיזור קדימה (FSC) לעומת הצד (SSC) בהיקף התחבר כדי אוכלוסיות של ליקוציטעניין ניתן לזהות. צייר שער גדול על כל leukocytes, למעט פסולת גושים עם קדימה הנמוך ביותר ולפזר בצד. מהשער אב זה, ליצור עלילה נקודה חדשה המציגה SSC לעומת DAPI והשער על DAPI-(Live) תאים. בחר אוכלוסיה מגודרת החדש וליצור עלילה נקודה המציג Mac-1 לעומת GR-1 ושער חיובית כפולה על שלך (Mac-1 + GR-1 +) MDSC. </li></ol> 4. העשרה המגנטי של GR-1 + Leukocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x10 aliquot 7 leukocytes בלא כתם הנותרים לתוך צינורות FACS שכותרתו כראוי צנטריפוגות ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן MM של נוגדנים Gr-1-PE בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 1:10 של נוגדנים Gr-1-PE ב -50 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ אנטי-PE microbeads בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 01:04 נגד PE microbeads ב 200 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של SB. לסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש, שכותרתו 50 מ&quot;ל חרוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ראש אוטומטי MACS מפריד Pro. מילוי בקבוקים עם כל הפתרונות המתאימים ולרוקן בקבוק פסולת, במידת הצורך. הפעל על מכשיר ולבחון מעמדה של נוזלים מכלי ועמודה (ים) לאחר אתחול. כל הסמלים צריך להיות ירוק. בתפריט, בחר &quot;הפרדה&quot; מן העליון<html> שורת התפריטים ואחריו &quot;לשטוף עכשיו&quot; משורת התפריטים נמוכה יותר. בחר &quot;לשטוף&quot; מן האפשרות מוקפץ ואחריו &quot;הפעלה&quot; כדי להתחיל את תהליך תחול. לאחר תהליך תחול הושלמה בהצלחה, המכשיר לאחר מכן להציג כי הוא &quot;מוכן ההפרדה&quot; תחת תפריט מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צינור מתאים מדף מצונן עבור גדלים צינור ומקום 50 מ&quot;ל צינור חרוטי עם תאים שכותרתו מגנטית ברציפות, 50 מ&quot;ל צינור חרוטי עבור אוסף חלק שלילי ב שורה 15 צינור חרוטי מ&quot;ל לאיסוף חלק חיובי בשורה ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;POSSEL_S&quot; הפרדת תאים תוכנית סלקציה חיובית של תאים היעד המוגדרים במצב רגיש דגימות. תאים היעד שכותרתו מגנטית נשמרות על עמודה האוטומטים, התאים שהוסרו מהן תוויות משתחררים לתוך צינור חלק שלילית האוסף ב &#39;בשורה על הכחשה אוטומטי של המגנט, התאים היעד שכותרתו ישוחררו לתוך צינור איסוף חיובי C שורה של הצינור מתלה. </li></ol>&gt; 5. לאחר מיון ניתוח GR-1 + Leukocytes מועשר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספר GR-1 + ו-GR-1 - שברים באמצעות trypan כחול hemacytometer. תאים Resuspend בריכוז הרצוי בינוני מכתים 3%, כך 50 μl הוא שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 7 תאים / מ&quot;ל - 2x10 7 תאים / מ&quot;ל) ולהעביר 50 μl לצינורות FACS שכותרתו בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ Mac-1 בלבד, בדילול 1:25 ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 לדגימה. כתם תאים ולהכין פיצויים כתם יחיד של GR-PE, Mac-1 ו FITC DAPI לניתוח cytometry הזרימה. הוספת 200 SM 3% μl וצבע DAPI הכדאיות כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע הרכישה cytometric זרימת נתונים כדי לקבוע GR-1 + ו-GR-1 - אחוזים וכן גם להשוות את אחוזי MDSC העשרת לפני ואחרי-autoMACS. </li></ol> 6. נציג תוצאות כאן אנו מראים R<html> תוצאות epresentative עבור העשרת autoMACS של GR-1 + leukocytes מ, spleens אספו נאיביות עבור FACS הבאים המיון של MDSC (איור 1). 1x10 6 leukocytes נאיביות הוכתמו Mac-1-FITC ו Gr-1-APC הנוגדנים לזהות אחוזי MDSC באמצעות מכשיר LSRII BD, לפני מיון autoMACS. 1x10 7 leukocytes הנאיביים היו מוכתמים מכן עם אנטי GR-1-PE נוגדנים PE-microbeads עבור העשרת GR-1 + leukocytes באמצעות מפריד Pro autoMACS. לאחר autoMACS העשרה, GR-1 אחוזים ב GR-1 + ו-GR-1 - שברים אסף הוערכו באמצעות cytometry הזרימה. 1x10 6 GR-1 + leukocytes הוסרו מוכתם נוגדנים Mac-1-FITC לנתח ולהשוות אחוזים של MDSC מועשר, אספו leukocytes תמימים שאינם מועשר, נקווה הגידול נושאות leukocytes ידי cytometry הזרימה. fig1.jpg &quot;/&gt; 1. איור AutoMACS העשרת נאיביות GR-1 + leukocytes עבור FACS MDSC מיון. Spleens נקצרו מעכברים הלבלב הגידול נושאות ותמים מעובד לתוך תא יחיד המתלים. Cytometry זרימה ניתוח של השטח leukocytes נאיבי מוכתם Mac-1 ו-GR-1 ניאון מצומדות נוגדנים, לפני העשרה autoMACS (א &#39;). Cytometry זרימה ניתוח GR-1 + (ב) ו - GR-1 - (ג) שברים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leuckocytes נאיביות אספו מוכתמים GR-1-PE נוגדנים נגד PE microbeads. Cytometry זרימה ניתוח MDSC ו Gr-1 + אחוזים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leukocytes נאיביות אספו (ד &#39;) לעומת הלא מועשר leukocytes אספו מן הגידול נושאות עכברים (ה) (עכברים נאיביות, N = 5 ; הגידול נושאות עכברים, N = 3). MDSC ו GR-1 אחוזים הם מגודרת בחלקות גובה ו היסטוגרמות מייצגים.

<ol><li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection%3A+involvement+of+Ly6G+%28Gr1%28%2B%29%29CD11b%28%2B%29+immature+myeloid+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li>
<li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy-6C%28hi%29+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li>
<li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2B%2FGr-1%2B+myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li>
<li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li>
<li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li>
<li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li>
<li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li>
<li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets%2C+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li>
<li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li>
<li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separations+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li>
<li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li>
<li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li>
<li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li>
<li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+%28Treg%29+and+effector+T+cells+to+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994(2009).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

זוהי שיטה מפורטת עיבוד immunophentyping אוכלוסיות MDSC כי הוא ישים הלימפה ברקמות שונות במודלים של בעלי חיים שונים. בפרט, להעשרת autoMACS יכול לשמש לבידוד של אוכלוסיות ליקוציט שונים, כולל דלדול-1 Gr של splenocytes 4, טיהור תת מיאלואידית מ splenocytes ובלוטות לימפה 5, בידוד של נויטרופילים במח העצם 14 וטיהור של CD8 + בתאי T של הטחול ואת בלוטות הלימפה 15. ללא קשר לאוכלוסייה התא של עניין, יצירת תא יחיד המתלים של leukocytes מן הרקמו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> החברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פוספט 1X שנאגרו מלוחים </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / 2 + Mg / פנול אדום ללא </td></tr><tr><td> אלבומין סרום מ שור (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> בואו BSA לפזר ללא הפרעה PBS, סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> העובר שור סרום (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> מחממים מומת, סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> אנטי עכבר חולדה CD16/32 נוגדנים חד שבטיים (FC בלוק) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> נגד העכבר CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> סטריליסביבה </td></tr><tr><td> נגד העכבר Ly6G (גרם-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> נגד העכבר Ly6G (גרם-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> דילול הסביבה סידורי סטרילי </td></tr><tr><td> תא דיסוציאציה Sieve </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> החיטוי לפני השימוש </td></tr><tr><td> 70 מיקרומטר מסננת </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> 1X RBC מאגר תמוגה </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש, סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> פטרי מנות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-757-12 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל קוןical צינורות </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל 12X75mm עגולים קלקר בתחתית צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> סביבה סטרילית, המכונה צינורות FACS </td></tr><tr><td> 96 היטב V-התחתונה צלחות </td><td> קורנינג </td><td> 3897 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> PE microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-048-801 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> AutoMACS מפריד Pro </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS עמודות </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS הפעלת מאגר </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (mdsc) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (automacs)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC הם אוכלוסיה הטרוגנית של מקרופאגים בוגרים, אלא תאים דנדריטים ו גרנולוציטים המצטברים באיברים הלימפה במצבים פתולוגיים כולל זיהום טפילי דלקת, טראומה, השתל נגד מארח מחלות, סוכרת וסרטן 1-7. בעכברים, MDSC אקספרס Mac-1 (CD11b) ו Gr-1 (Ly6G ו Ly6C) אנטיגנים פני 7. חשוב לציין כי MDSC נלמדים גם בגידול נושאות צבאות שונים שם הם התרחבו באופן משמעותי ולדכא אנטי סרטניים התגובה החיסונית לעומת עמיתיהם נאיביות 7-10. עם זאת, בהתאם למצב פתולוגי, יש subpopulations שונים של MDSC עם מנגנוני ויעדים שונים של דיכוי 11,12. לכן, שיטות יעילות לבודד אוכלוסיות MDSC קיימא חשובים הבהרת המנגנונים המולקולריים השונים של דיכוי במבחנה in vivo. לאחרונה, ה-Ghansah הקבוצה דיווחה על הרחבת MDSC ב מודל הלבלב Murine סרטן. MDSC הגידול נושאת שלנו להציג הפסד של הומאוסטזיס והגדילה את הפונקציה מדכאים לעומת MDSC תמים 13. אחוזי MDSC באופן משמעותי פחות תאים הלימפה של עכברים תמימים לעומת הגידול נושאת. זוהי אזהרה גדול, אשר לעתים קרובות מעכבת ניתוחים השוואתיים מדויקים של MDSC אלה. לכן, להעשיר GR-1 + leukocytes מעכברים תמימים לפני מיון Fluorescence Cell הופעל (FACS) משפר, הכדאיות טוהר מפחית באופן משמעותי את זמן המיון. עם זאת, העשרת GR-1 + leukocytes מן הגידול נושאות עכברים היא אופציונלית כמו אלה בשפע עבור FACS מהירים מיון. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה היעילה ביותר של immunophenotyping MDSC ומעשירה GR-1 + leukocytes מן spleens של עכברים תמימים למיון MDSC מבעוד מועד. Immunocompetent עכברים C57BL / 6, מחוסן עם Murine Panc02 לספירהlls מתחת לעור ואילו עכברים תמימים לקבל 1XPBS. כ 30 ימים לפרסם חיסון; spleens נקצרים ומעובדים מתא בודד השעיות באמצעות תא דיסוציאציה מסננת. Splenocytes הן מכן כדורית דם אדומה (RBC) lysed ו aliquot של leukocytes אלה מוכתמות באמצעות fluorochrome-מצומדות נוגדנים נגד Mac-1 ו-GR-1 לאחוזים immunophenotype MDSC באמצעות cytometry הזרימה. בניסוי מקביל, leukocytes שלמים מעכברים נאיביות מגואלות ניאון מצומדות GR-1 נוגדנים, מודגרות עם PE-microbeads נבחרים באופן חיובי באמצעות מיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (autoMACS) Pro מפריד. לאחר מכן, aliquot של GR-1 + leukocytes מגואלות Mac-1 הנוגדנים לזהות את הגידול באחוזים MDSC באמצעות cytometry הזרימה. עכשיו, אלה + Gr1 leukocytes מועשר מוכנים FACS המיון של MDSC לשימוש בניתוחים השוואתיים (נאיבי לעומת הגידול נושאת) ב in vivo ו in vitro </em&gt; מבחני.

זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה GR-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukocytes מ spleens עכבר. שיטה זו משתמשת cytometry זרימה נייד AutoMACS מיון להעשיר קיימא עבור GR-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukocytes שקדמו FACS המיון של MDSC לשימוש<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני.

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

MDSC הן אוכלוסייה הטרוגנית של מקרופאגים, תאים דנדריטיים וגרנולוציטים לא בשלים המצטברים באיברים לימפואידיים במצבים פתולוגיים...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק במהירות אוכלוסייה מועשרת של לוקוציטים חיוביים ל-GR one המכילה תאי מדכאים ממקור מיאלואי (myeloid derived suppressor cells) או MDSCs מטחול של עכברים, לשימוש במבחנים in vivo ו-in vitro. ראשית, טחולים ממספר עכברים מאוגדים ומעובדים כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. כדי לכמת את אחוז ה-MDSC לפני ההעשרה, אליקווט קטן מהתאים המאוגדים מועבר לפלטת 96 בארות עם תחתית בצורת V.סימון של אנטיגנים שטח מסוג MAC one ו-GR one, והעברת התאים המסומנים למבחנות fax לצורך אנליזה בציטומטריית זרימה. שאר הלוקוציטים המאוגדים נצבעים באמצעות נוגדן נגד GR one המצומד לפלואורוכרום, ומודגדים עם מיקרו-חרו지를 מגנטיים, הנקשרים לפלואורוכרום שעל הנוגדן נגד GR one. לאחר מכן, האוכלוסיות החיוביות ל-GR one והשליליות ל-GR one מופרדות באמצעות מפריד AutoMax pro כדי להעריך את הצלחת ההעשרה של GR one באוכלוסייה.נלקחת אליקוט קטנה המנותחת לבדיקת ביטוי של GR one ו-MAC one כדי להעריך את אחוזי ה-MDSC. השוואה של נתוני האימונופנוטיפינג שהתקבלו מדגימה עלייה באחוזי ה-MDSC באוכלוסיית הלוקוציטים המועשרת ב-GR one בהשוואה לאוכלוסייה שאינה מועשרת. בנוסף, קיימת עלייה ב-naive MDSC, המניבה אוכלוסייה הדומה ל-MDSC ממנשאי גידול.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעת זרימה קונבנציונלית ומיון מבוסס ציטומטריית זרימה במהירות גבוהה של m DSCs מרקמות לימפואידיות, הוא שטכניקת ה-master mix שלנו מונעת שונות משמעותית בתוצאות על ידי הבטחת צביעת שטח שווה של מאגר הלוקוציטים, לצורך טיפוס (typing) ומיון AutoMax של m DSCs ותאים חיוביים ל-GR 1 בהתאמה. את הפרוצדורות תדגים נדין נלסון, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו, וד"ר הו-סרה, מנהלת מרכז הליבה לציטומטריית זרימה ב-USF. יש לבצע את ההליך הבא בסביבה סטרילית תחת מ 빠르게 ביולוגי, כאשר התאים והנוגדנים נשמרים על קרח.בכל פעם שניתן, הרכיבו את נפה לפירוק התאים על ידי הכנסת רשת הסינון לתוך פתח הכוס לכיוון התחתית. לאחר מכן, הכניסו את טבעת האיטום לאזור ההברגה כאשר הצד החרוץ פונה כלפי מעלה, והשתמשו במפתח הטבעת כדי להדק את טבעת האיטום ולבסס את קיבוע הרשת. הניחו את הנפה המורכבת בתוך צלחת פטרי המכילה 10 milliliters של תמיסת XPBS אחת.יש להוציא טחולים מעכברים מסוג C 57 black six בני ששה עד שמונה שבועות, נושאי גידולים או עכברי ביקורת נאיביים, ולהניחם על רשת הסינון של נפת פירוק התאים. לאחר מכן, יש להשתמש בעלי פיתול מזכוכית כדי לטחון את הטחולים דרך רשת הסינון אל תוך צלחת פטרי. יש לחזור על תהליך זה עבור כל קבוצת טיפול של העכברים.בשלב הבא, באמצעות פיפט סרולוגית של 5 ml, העבירו את תרחיף התאים למסננת תאים של 70 מיקרון והניחו להם להסנן אל תוך מבחנה קונית של 50 ml. צנטריפוגו ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקע על ידי הוספת 5 ml של RBC lysis buffer לכל טחול וביצוע פיפוט נמרץ מעלה ומטה. הדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר ההדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספת 20 ml של PBS וביצוע פיפוט נמרץ מעלה ומטה.לאחר מכן, סנטריפוגו ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השהו את המשקע (pellet) ב-20 milliliters של PBS סטרילי וספרו את התאים. באמצעות trypan blue והמוסייטומטר (hemocytometer), השהו מחדש את התאים בריכוז של 1×10⁷ עד 2×10⁷ תאים ל-milliliter בתווך צביעה של 3%Staining medium. השגת צביעה אופטימלית היא ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה.ניתן לבצע זאת בהצלחה על ידי טיטרציה מוקדמת של הנוגדנים. השתמשו בהכנת תערובות מאסטר (master mixes) ובצביעה שטחית בנפחים קטנים כפי שמתואר בפרוטוקול זה. כדי לצבוע את התאים לצורך אנליזה בציטומטריה עם זרימה, סמנו את הבארות של פלטת vbo בעלת 96 בארות עבור דגימות ביקורת ודגימות ניסוי, וכן עבור צביעות בודדות.עבור בקרות פיצוי, הוסף 5×10⁵ עד 1×10⁶ תאים ב-50 µL לכל אחת מהבארות המסומנות. לאחר מכן, סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, התבונן בפלטה מלמטה.הביטו כלפי מעלה כדי לוודא שקיימים משקעים בבארות, והכינו תערובת מאסטר של חסימת mouse BDFC המכילה נוגדן מונוקלונלי rat anti muse CD 1632 המדולל בתווך צביעה של 3% בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח עם ערבוב בוורטקס. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגה קצרה למשך חמש שניות תוך החזקת פלטת 96 בארות בעלת תחתית V מעל מיכל פסולת או כיור. הפכו את הפלטה במהירות הלוך וחזור כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפר את משקעי התאים.לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תערובת FC block master mix לכל המשקעים בלוחית 96 בארי עם תחתית בצורת V, וערבבו על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה. הניחו את הלוחית על קרח והדגירו למשך 15 דקות בחושך; סובבו את הלוחית בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. הכינו תערובת master mix של נוגדי Mac one fitzy ו-GR one A PC מדוללים ב-3% Staining medium בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 mL על קרח.בצעו ערבוב מהיר (Vortex) וצנטריפוגה קצרה למשך חמש שניות. לאחר הסבב, הפכו את הפלטה כדי להסיר את העלייה (supernatant) מכל באר, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL מתערובת הנוגדנים למשקעים של הביקורת או של הניסוי. ערבבו היטב על ידי שאיבה ופליטה עדינה (pipetting) בעזרת פיפטה. עבור פיצויים של צביעה בודדת, הוסיפו 50 µL של MAC one F GR one A PC או DPI מדוללים בתווך צביעה של 3% לבארי המתאימות. עבור בקרת ללא צביעה, הוסיפו 50 µL של תווך צביעה 3% לבאר המתאימה וערבבו.לאחר מכן, דגרו את הפלטה למשך 30 דקות בחושך על קרח. במהלך הדגירה, סמנו מבחנות fax כך שיתאימו לכל באער בפלטה והוסיפו 200 µL של תווך צביעה 3% לכל מבחנת fax. עם סיום זמן הדגירה של 30 דקות, סבבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות.לאחר הסבוב, הסר את העל-נוזלים כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, שטוף את המשקעים על ידי הוספת 100 µL של תמיסת צביעה בריכוז 3% לכל משקע. ערבב היטב באמצעות פיפוט עדין למעלה ולמטה.סבב את הפלטה שוב בצנטריפוגה למשך חמש דקות. חזור על שלב השטיפה פעם נוספת לאחר הסבב, הסר את ה-natin כפי שנעשה קודם לכן, והשעה מחדש כל משקע ב-100 µL של תוכה לצביעה בריכוז 3% וערבב היטב. לאחר מכן, העבר 100 µL של התאים שהושעו מכל באר בפלטה למבחנת fax המסומנת בהתאם.לאחר מכן, הוסיפו 75 nanograms per milliliter של DPI לדגימות הביקורת ולדגימות הניסוי, וכן לבקרת הפיצוי לצביעה בודדת של DPI. בצעו רכישת נתונים ציטומטריים כדי לקבוע את אחוזי ה-MDSC כפי שמתואר במסמך המצורף; לאחר מכן, העבירו עבור העשרה של leukocytes חיוביים ל-GR one מנה אחת של 10 to the seventh מה-leukocytes הבלתי צבועים שנותרו למבחנות fax מסומנות כראוי, וסבבו אותן בצנטריפוגה ב-250 to 300 times G למשך חמש דקות. הוסיפו 50 microliters של דילול 1 to 10 של נוגדן GR one PE בבופר max והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius בחושך.לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר של max buffer לכל מבחנת fax וסבב במערך צנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר הסבב, השלך את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הוסף לכל מבחנה 200 µL של דילול 1:4 של anti PE microbeads ב-max buffer והדגר למשך 15 דקות ב-4 °C בחושך.הוסיפו 2 mL של max buffer למבחנות ה-fax וסבבו בצנטריפוגה ב-250 עד 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, השביו את המשקע ב-3 mL של staining buffer וסננו דרך מסננת של 70 micron לתוך מבחנה קונית חדשה ומסומנת של 50 mL. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהפרדה מגנטית אוטומטית.הפרדה מגנטית היא בחירה מצוינת של שיטה. אם עליכם להפריד מספר רב של תאים במהירות, באופן חסכוני ועל בסיס סמן פני, ודאו כי תבדקו את התוצאות בסיום התהליך באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי להכין ולהפעיל את המפריד AutoMax pro, ודאו שכל הבקבוקים מלאים בתמיסות המתאימות.הפעל את המכשיר. לאחר האתחול, בדוק את מצב מיכלי הנוזלים והעמודות. כל הסמלים צריכים להיות ירוקים.בשלב הבא בתפריט, בחרו ב-separation מסרגל התפריטים העליון ולאחר מכן ב-wash. כעת, מסרגל התפריטים התחתון, בחרו ב-rinse מהאפשרויות הנפתחות ולאחר מכן ב-run כדי להתחיל בתהליך ההכנה (priming). לאחר שתהליך ההכנה יושלם בהצלחה, המכשיר יציג כי הוא מוכן לביצוע הפרדה (separation).בתפריט הסטטוס (status), הניחו את השפופרת הקונית בנפח 50 milliliter עם התאים המסומנים מגנטית בשורה A של מעמד שפופרות מקורר ובגודל מתאים. לאחר מכן, הניחו שפופרת קונית בנפח 50 milliliter לאיסוף הפракציה השלילית בשורה B ושפופרת קונית בנפח 15 milliliter לאיסוף הפракציה החיובית בשורה C, ובחרו בתוכנית הפרדת תאים POS cell S לבחירה חיובית של תאי מטרה מסומנים במצב רגיש (sensitive mode) מדגימות. עם תחילת התוכנית, תאי המטרה המסומנים מגנטית יישמרו בעמודת ה-AutoMax בעוד שתאים שאינם מסומנים ישוחררו אל שפופרת איסוף הפракציה השלילית בשורה B. לאחר מכן המגנט ייסוג ותאי המטרה המסומנים ישוחררו אל שפופרת האיסוף החיובית בשורה C של מעמד השפופרות.לאחר ההעשרה, השתמשו ב-trian blue וב-hemo cytometer כדי לספור מחדש את הפראקציות של GR one positive ו-GR one negative. לאחר מכן, השעיו את התאים בריכוז של 1×10⁷ תאים למיליליטר עד 2×10⁷ תאים למיליליטר בתווך צביעה של 3% והעבירו 50 µL למבחנות fax מסומנות בהתאם. צבעו את התאים ב-MAC one ובצבע הבדיקה DPI עבור ציטומטריית זרימה ופיצויים של צביעה בודדת.בצע רכישת נתונים בציטומטריה זרימה כדי לקבוע את האחוזים של תאים חיוביים ל-GR one ותאים שליליים ל-GR one, וכן כדי להשוות את אחוזי ה-MDSC לפני ואחרי AutoMax. טחולים נאספו מעכברים עם גידולים בלבלב ומעכברים נאיביים ועובדו לתליי של תאים בודדים כפי שמתואר במאמר וידאו זה. ציטומטריה זרימה בוצעה כדי לבחון לוקוציטים נאיביים שסומנו על פני השטח באמצעות נוגדנים מצומדים לפלואורסצנציה עבור MAC one ו-GR one כפי שמוצג כאן; רק אחוז נמוך מאוד, 1.19% של MDSCs נאיביים חיוביים ל-MAC one ו-GR one, נראה לפני העשרה ב-AutoMax. עם זאת, בעקבות העשרה של האוכלוסייה החיובית ל-GR one, תת-אוכלוסיית תאים זו גדולה משמעותית, 10.5% מהנאיביים, וכעת היא דומה ל-25.3% מעכברים עם גידולים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כולל accelerated MDSC, מיון באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry) בניסויי העברה adopted transfer in vivo, qPCR כמותי ו-western blotting, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע למנגנונים המולקולריים האחראים להתרחבות, נדידה ודיפרנציאציה של MDSC, ולדיכוי התגובות החיסוניות על ידי תאים אלה.

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול בידוד אוכלוסיות מטוהרים מאוד של leukocytes כי החודרים גידולים. פרוטוקול זה הוא עיבוד ביוטק Miltenyi בפרוטוקול כדי לשפר את התשואה וטוהר לבידוד תאים של רקמת הגידול מורכב.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

אנו מתארים שיטה לניצול לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) מעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה להעברת תאים מאמצים. פרוטוקול זה נועד לאמת את הציטוטוקסיות הספציפית של TIL כנגד גידולים במודל עכברי סרטן הלבלב סינגני, ולספק תובנות לגבי התפתחות טיפולים תאיים מאמצים לסרטן הלבלב.

בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

שיטה מדויקת ומעשית כדי למדוד פרמטרים כמו זן ברקמת שריר הלב הוא בעל ערך קליני רב, שכן הוכח, כי הלחץ הוא סמן רגיש יותר מוקדם עבור תפקוד כויץ מאשר שימוש תכוף פרמטר EF.

תהודה מגנטית נגזר מסננים הערכה שריר הלב באמצעות מעקב אחר תכונות

זיהוי של תאי מוח סרטני ייזום (BTICs), תאים הנדירים בטווח של תכונות הטרוגניות גידול בעלי תאי גזע, מספק תובנה חדשות על היווצרות גידול במוח האנושית. יש לנו מעודנים תנאי התרבות ספציפיים להעשרה לBTICs, ואנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה להעשיר אוכלוסיות אלה עוד יותר. מבחנים עצמי חידוש וניתוח תמליל של התא הבודד RT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע בתאים מבודדים.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

למדו שיטה מהירה להעשרת תאי MDSC מטבולות עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיון מגנטי AutoMACS. הטכניקה מבודדת תאי Gr-1+ חיים לניסויים בתרבית ובחי.

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS) (וידאו) | JoVE Journal

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

גלה סרטונים נוספים