Name: חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: למד טכנולוגיית העשרת חלבונים ופפטידים בעלי משקל מולקולרי נמוך משתיית דם אנושי באמצעות סרטי סיליקה מזופורוס דקים. שיטה זו משפרת פרופילינג של פרוטאום ומאפשרת זיהוי סמנים ביולוגיים ליישומים אבחנתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי ברית של פרס מראש במרכז NanoHealth (W81XWH-11-2-0168) וטקסס המרכז Nanomedicine סרטן (1U54CA151668-01).

<ol><li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li>
<li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+early+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li>
<li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li>
<li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+written+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+old%2C+old+fashioned%2C+but+it+still+climbs+up+the+mountains%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li>
<li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

ראיות גובר כי האזור נמוך מולקולרית משקל proteome הדם הוא מקור עשיר של סמנים דיאגנוסטיים לזיהוי מוקדם של המחלה. בטכנולוגיה זו, הצגנו סדרה של שבבי סיליקה mesoporous עם גודל הנקבוביות שונים, מבנים נקבוביות ושינויים באופן סלקטיבי להעשיר פפטידים חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך. כדי להעריך את יציבות החלבון, שבבי השוטרים הצבאיים היו מודגרות עם סרום אנושי, יבש לאחר שטיפה, ומאוחסן על 3wk בטמפרטורת החדר. את חלבון / פפטיד דפוסי שהתקבלו היו דומים לאלה של סרום מופרדים טרי (איור 6 א), כפי שאושרו על ידי התוצאות של הניתוח הסטטיסטי הראה באיור 6 ב. השתנות של אותות השיא נמדד לפי קורות החיים הממוצע נאמד ב -12.7% ל סרום גולמי של 14.2% על דגימות לבורסקאות. הווריאציות שוליים יכול להיות בגלל השתנות פנימית של המכשיר MALDI והציע On שבב המקדים ואחסון לא לגרום לכל שינוי ניכר פרופילים חלבון טרשת נפוצה. ניסוי דומה שבוצעה על סיליקון נקבובי לא. סרום יבשים התאושש לאחר האחסון על משטח סיליקון היה מופרדים על שבבים של MPS לפני ניתוח MALDI. פרופיל MS עניים שהתקבלו הראו יתרון ייצוב פני השטח mesoporous. באנלוגיה עם מנגנונים שנקבעו מראש קודם לכן, אנו משערים כי המין LMW לכודים בתוך nanopores את נשמרו מן השפלה דרך למעט הגודל של פרוטאזות, או על ידי עיכוב פעילות סטרית פרוטאוליטים שלהם בחלל הקטן של nanopores את. השיטה מבוססת שבב MPS יכול להיות כלי רב עוצמה פפטיד ו פרופיל חלבון LMW המחקר נוזלים מורכבים ביולוגי. השבבים של MPS זולים לייצור לאפשר ייצור בקנה מידה של עד להשגת עיבוד בו זמני של מספר גדול של דגימות, מתן תכונות יתרון להקרנה גישוש ביוסמן הגילוי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Tetraethoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> ספין coater </td><td> ברואר מדע </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> פלזמה אשר </td><td> Nordson במרץ </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרוסקופיות Ellipsometer </td><td> JA Woollam ושות </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> יישומי Biosystems </td><td> Voyager-de-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich ושות </td><td> C8982 </td><td> מטריקס עבור MALDI-TOF </td></tr><tr><td> טרנס 3 ,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich ושות </td><td> 85429 </td><td> מטריקס עבור MALDI-TOF </td></tr><tr><td> מערבבים בצלחת חמה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11-475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell מחולק לתאים coverglass </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 מ&quot;מ קוטר. × 1 עומק מ&quot;מ, 3-10 μL, סטרילי </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106-70-PPO PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-70-PPO PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20-70-PPO PEO 20 </td></tr></tbody></table> 1. לוח פיסיקלי כימי וריכוזים שנועדו (משקל מולקולרי ו-ISOנקודת חשמל) של הפפטיד נבחרת סטנדרטים חלבון.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

זיהוי סמנים ביולוגיים במחזור בעל פוטנציאל גדול עבור גישות פולשניים שאינם באבחון התחזית המוקדמת, כמו גם ניטור של היעילות הטיפולית. 1-3 proteome במחזור נמוך משקל מולקולרי (LMWP) מורכבת של חלבונים קטנים לשפוך מן רקמות תאים או שברי פפטידים שמקורם השפלה פרוטאוליטים של חלבונים גדולים יותר, נמצא קשור למצב פתולוגי אצל חולים וכנראה משקף את מצב המחלה. 4,5 למרות אלה יישומים קליניים אפשריים, שימוש ספקטרומטריית מסה (MS) לפרופיל LMWP מ נוזלים ביולוגיים הוכיחה להיות מאוד מאתגר בשל טווח דינמי גדול של ריכוזי חלבון פפטיד בסרום. 6 ללא מדגם טרום טיפול, חלק יותר חלבונים בהיקף נרחב ביותר לטשטש את הזיהוי של שפע מינים נמוך בסרום / פלזמה. שוטפים proteomic גישות מבוססות, כגון polyacrylamide דו מימדי ג&#39;ל אלשיטות ectrophoresis (2D-PAGE) ו proteomics הרובה הם עתירי עבודה, תפוקה נמוכה והתאמתם הצעות מוגבלות ליישומים קליניים. 7-9 לכן, אסטרטגיה יעילה יותר יש צורך לבודד LMWP מן הדם ולאפשר את הקרנת תפוקה גבוהה של דגימות קליניות . כאן, אנו מציגים מהיר, יעיל ואמין חלוקה מרובת מערכת המבוססת על שבבי סיליקה mesoporous במיוחד כדי למקד ולהעשיר LMWP. 10,11 mesoporous (MPS) סיליקה שכבות דקות עם תכונות מתכונן הננומטרי היו מפוברקות באמצעות קופולימר triblock מסלול תבנית . שימוש בתבניות פולימריים שונים ריכוזים פולימר בתמיסה מבשר, שונות גודל הנקבוביות הפצות, מבנים הנקבוביות, קישוריות ואת מאפייני פני השטח נקבעו ויושמו להתאוששות סלקטיבית של חלבונים מסה נמוכה. ניתוח סלקטיבי של פפטידים מועשר אל subclasses שונות על פי מאפייני physicochemical שלהם יהיה enhance את היעילות של התאוששות זיהוי שפע של מינים נמוכים. בשילוב עם ספקטרומטריית מסה וניתוח סטטיסטי, הראינו את הקשר בין המאפיינים Nanophase של הסרטים סיליקה mesoporous דקים הספציפיות והיעילות של קצירת מסה נמוכה proteome. התוצאות המוצגת כאן לחשוף את הפוטנציאל של הטכנולוגיה המבוסס על ננוטכנולוגיה כדי לספק חלופה רב עוצמה לשיטות קונבנציונליות של קצירת LMWP של נוזלים ביולוגיים מורכבים. בגלל היכולת לכוון את תכונות החומר, יכולת ייצור בעלות נמוכה, פשטות המהירות של אוסף המדגם, וכן את הדרישות מדגם מופחת באופן משמעותי לניתוח, זה ננוטכנולוגיה חדשנית באופן משמעותי להשפיע על תחום המחקר סמן proteomic ו proteomic קליני הערכה.

פיתחנו טכנולוגיה המבוססת על הסרט סיליקה mesoporous דק להתאוששות סלקטיבית של חלבונים נמוך משקל מולקולרי ופפטידים מ בסרום אדם. פיסיקלי כימי את המאפיינים של שבבי mesoporous שלנו היו מכוון היטב כדי לספק שליטה משמעותית להעשרת פפטיד ולכן פרופיל proteome סרום למטרות אבחון.

לזיהוי של סמנים ביולוגיים במחזור הדם יש פוטנציאל רב לגישות לא פולשניות לאבחון מוקדם ולפרוגנוזה, וכן ל...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לפתח טכנולוגיה המבוססת על שכבה דקה של סיליקה מזו-נקבובית (meso porous silica) לשחזור סלקטיבי של חלבונים ופפטידים בעלי משקל מולקולרי נמוך מסרום אנושי. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור שבבי שכבה דקה של סיליקה מזו-נקבובית וטיפול מקדים באמצעות שריפת פלזמה של חמצן (oxygen plasma ashing). השלב השני הוא ביצוע טיפול מקדים פשוט של הסרום ולאחר מכן העשרה של החלבונים והפפטידים בעלי המשקל המולקולרי הנמוך מהסרום באמצעות הפרדה (fractionation) על השבב.בעקבות שטיפת החלבונים והפפטידים בעלי המשקל המולקולרי הנמוך מהשבב, המולקולות מאופיינות באמצעות ספקטרומטריית מסות מסוג matrix assisted laser desorption ionization time of flight. השלב הסופי הוא שימוש בתוכנה מקצועית לביצוע ניתוח נתונים. בסופו של דבר, ספקטראות המסות ותוצאות הניתוח הסטטיסטי חושפות את הסגוליות והיעילות של איסוף הפרוטאומה בעלת המשקל המולקולרי הנמוך.היתרון המרכזי של טכניקות אלה או של טכנולוגיות קיימות כמו 2D page ו-Western blot כולל יכולת עוצמתית להעשרה של חלבונים ופפטידים בעלי ריכוז נמוך ומשקל מולקולרי נמוך בסרום, תפוקה גבוהה ויעילות בזמן, הפחתה של דרישות דגימות הסרום ועלות נמוכה. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הליך זה הוא השליטה במורפולוגיה של רשת ה-Nanopore, כגון התפלגות גודל הנקבים, צורת הנקבים והקישוריות ביניהם. זאת מכיוון שמאפיינים אלה קובעים את הרגישות והספציפיות של מיפוי חתימת הדם המהווה את יעד הבדיקה.כדי להבטיח את ביצוע הניסוי, אנו שואפים לשלוט בקפידה ביחס המודל של חומר המוצא ולפעול בדיוק לפי ההוראות ליצירת תמיסת הציפוי עבור השבב. התחילו בהכנת תמיסת הפרקורסור של סיליקט שעבר הידרוליזה. ערבבו 14 milliliters של teos עם 17 milliliters של אתנול בריכוז 200 proof,‏ 6.5 milliliters של מים דה-יוניים ו-0.5 milliliters של חומצה כלורית בריכוז six molar תחת ערבוב חזק.המשיכו בערבוב חזק וחממו את התמיסה שנוצרה בטמפרטורה של 80 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הטרי-בלוק קופולמר על ידי הוספת תמיסת הפולימר שנבחרה ל-10 milliliters של אתנול בטמפרטורת החדר תוך ערבוב נמרץ. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-onic F1 27.השלימו את התערובת על ידי הוספת תמיסת הסיליקט אל קו-פולימר הטרי-בלוק הזה, ולאחר מכן ערבבו בחוזקה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. מרחו מיליליטר אחד של תמיסת הציפוי שהתקבלה על פרוסת סיליקון בגודל ארבעה אינץ' באמצעות ציפוי סבב (spin coating) במהירות של 1, 500 RPM למשך 20 שניות. לאחר מכן, חממו את הפרוסה בטמפרטורה של 80 °C למשך 12 שעות.לאחר מכן, העלו את הטמפרטורה במעלה אחת של צלזיוס לדקה עד להגעה ל-425 °C ואפו בטמפרטורה זו במשך חמש שעות. לאחר מכן, בצעו טיפול מקדים של פני השבב של הסיליקה המזו-נקבובית (MPS) שנוצרה באמצעות שריפת פלזמה של חמצן. לבסוף, מדדו את עובי השכבה ואת הנקבוביות באמצעות אוקסומטר.במקביל, לכל דגימת סרום, הוסיפו חומצה טריפלואורואצטית (trifluoro acidic acid) עד לריכוז סופי של 0.01% ואצטוניטריל עד לריכוז סופי של 5%. לאחר מכן, לאחר אפייה מקדימה של השבבים למשך לילה בתנור בטמפרטורה של 160 °C, נערו דגימות אלו במכשיר vortex shaker שולחני בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. השתמשו באוויר דחוס כדי להסיר חלקיקים שעשויים להימצא על פני השבב. נקו את זכוכית הכיסוי (cover slip) ב-100% ethanol והניחו אותה על פני שבב ה-NPS, כדי ליצור את בארי הדגימה.לחצו על לכיסוי הזכוכית בעזרת פינצטה כדי להבטיח איטום מלא עם השבב. לאחר מכן, העבירו בפיפט 10 µL של דגימת סרום לכל באר. דגרו למשך 30 דקות בתא לחות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לחלבונים בעלי המשקל המולקולרי הנמוך להיכנס לנקבוביות. לאחר הדגירה, שאבו את הסרום מהבארים והשליכו אותו.לאחר מכן, העבירו בפיפט 10 µL של מים דה-יוניים לכל באער כדי לשטוף חלבונים גדולים יותר. חזרו על שטיפה זו ארבע פעמים, תוך עבודה עם באער אחד עד שניים בכל פעם. כדי למנוע התאיידות, הוסיפו במהירות 5 µL של תמיסת אלואציה (elution buffer) לכל דגימה.בצעו שאיבה והזרקה (pipette up and down) 30 פעמים תוך כדי הזזת קצה הפ pipette בתוך הבאר כדי לערבב. לאחר הערבוב, שאבו את כל תחליל האלוציה והעבירו למבחנה למיקרו-צנטריפוגה עד לביצוע ניתוח MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization time of flight). לביצוע ה-MALDI-TOF, טפטפו 0.5 µL מהדגימה על לוחית המטרה של ה-MALDI והמתינו לייבוש; לאחר מכן, טפטפו 0.5 µL של מטריצה ב-50% acetonitrile המכילה 0.1% TFA והמתינו לקריסטליזציה משותפת. לאחר מכן, טפטפו 0.5 µL של תמיסת כיול על נקודת הכיול. לאחר הייבוש, הכניסו את לוחית המטרה למספקטורומטר המסה מסוג MALDI-TOF.יש להעביר את המכשיר למצב רפלקטור חיובי (positive reflector mode) עם עוצמת לייזר של 4 ו-203,000 פולסים לדגימה. ראשית, בצע את האנליזה עם טווח מסות נבחר של 800 עד 5,000 Daltons ומסת מטרה של 2000 Daltons. לאחר מכן, בצע את אותה אנליזת MALDI toff במצב ליניארי, אך שנה את טווח המסות ל-900 עד 10,000 Daltons או ל-3000 עד 70,000 Daltons עם מסת מטרה של 5,000 Daltons.לאחר תהליך ניתוח ה-multi top, עבד את הספקטרה הגולמיים באמצעות תוכנת convert peak list, ולאחר מכן ייצא אותם ל-specal. לצורך עיבוד מקדימ (pre-processing), יישר את כל הספקטרה באמצעות יישור פסגות בשיטת התמרת פורייה מהירה או שיטת P-A-F-F-T correlation, ונרמל את העוצמות לזרם יונים כולל (total ion current). בצע זיהוי פסגות עם יחס גובה של שניים ו-0.3% מחלון המסה.תקנו את קו הבסיס והסירו את הערכים השליליים לפני הניתוח. ייבוא קובצי T 2D לתצוגת הסמנים (marker view) הוא השלב הראשון בעיבוד מודרך של נתוני MALDI מקבוצות שונות. התחילו בפתיחת תוכנת ה-marker view, ולאחר מכן ייבאו את קובצי ה-T 2D.בחרו את התיקייה המכילה את קבצי ה-T 2D והגדירו את הפרמטרים לעיבוד הספקטרה. לאחר מכן, פתחו את טבלת הדגימות. סמנו את הדגימות מאותה קבוצה, והגדירו תווית לקבוצה.נרמלו את הדגימות באמצעות סיכום השטח הכולל. לאחר מכן, פתחו את חלון האפשרויות. הגדירו צבע וסמל ייחודיים עבור כל קבוצה.לאחר מכן, בצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) ומבחן T עבור דגימות הנתונים הפעילות, אשר מחולקות לקבוצות שונות על פי ציוני PC 1 ו-PC 2. מועמדים לסמנים ביולוגיים יימצאו על פי תרשימי העמסה של PC, המציגים סיכום של פרופיל העוצמה של הסמן הביולוגי שנבחר באמצעות לחיצה על plot profiles עבור שיאים נבחרים. נקודות בעלות ערכים גבוהים יותר עשויות להבדיל בין הקבוצות השונות.לאחר השוואת הקבוצות באמצעות מבחן T, מיינו את הטבלה לפי ערכי P עולים כדי לקבוע את השיאים שיכולים להבדיל בין הקבוצות השונות; מוצגים כאן ספקטראי MS של דגימת סרום עבור פפטידים בטווח של 900 עד 10,000 Daltons, ועבור חלבונים בטווח של 3,000 עד 70,000 Daltons. הספקטראים של הדגימות שלא עברו עיבוד ממחישים את דיכוי האות באזור המשקל המולקולרי הנמוך עקב נוכחות של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה, השכיחים מאוד ומיונונים היטב, כגון אלבומין; לאחר פראקציונציה באמצעות דקיקי MPS, רוב המולקולות הגדולות הוסרו, מה שהביא להעשרה משמעותית של הרכיבים בעלי המשקל המולקולרי הנמוך. כבקרה, אותה דגימת סרום הוחלה על פני שטח של סיליקה טהורה שאינו נקבובי.כדי להעריך את הספציפיות של סרטי MPS דקים לשחזור פרוטאומה בעלת משקל מולקולרי נמוך, לא נמצא איסוף משמעותי של פפטידים או חלבונים מהסיליקה הבלתי נקבובית. לפיכך, ניתן להסיק כי הארכיטקטורה המזו-נקבובית, ולא זיקת פני השטח של הסיליקה, היא הגורם המרכזי בהעשרה של LMWP. ניתן להשיג שינויים מבוקרים במדויק בגודל הנקבים באמצעות שימוש קופולימרים בעלי אורכי בלוקים הידרופוביים שונים.השפעת גודל הנקבים על יעילות השחזור של פפטידים וחלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (LMW) נבחנה באמצעות שכבות דקות של MPS שהוכנו מארבעה חומרים פעילים שטחניים (surfactants) אוניים עם יחסי נפח שונים של הרכיבים ההידרופוביים וההידרופיליים. מוצגת כאן תצפית מוגדלת של ספקטרום ה-MALDI המדגימה את סף החיתוך המולקולרי האופייני של כל שבב MPS, אשר תואם לגודל הנקבים. טווח גדלי הנקבים הוביל לשחזור של רפרטואר שונה של פפטידים וחלבונים מאותה דגימת סרום, וזאת באמצעות הדרה לפי גודל וצורה.ניתן להבחין בכך גם במקבץ ההיררכי הדו-כיווני של מאפייני תערובת הפפטידים בין השבבים השונים. עוצמת הצבע האדום או הצהוב מעידה על ריכוז הפפטידים היחסי. נקבים גדולים יותר שיפרו את איסוף הפפטידים הגדולים, בעוד שפפטידים קטנים התאוששו באופן מועדף משבבים בעלי נקבים קטנים יותר.ניתן להשיג ננו-מבנים מחזוריים שונים של שכבות דקות של MPS, שנוצרו באמצעות קו-פולימרים טרי-בלוק בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון onic F1 27 עם התפלויות גודל נקבוביות דומות, על ידי כיוונון מבנה הפולימר בתמיסת הפרקורסור. למבני הננו הקוביים התלת-ממדיים ולמבני הננו המשושים דמויי חלת הדבש יש קישוריות נקבוביות רצויה יותר ומורפולוגיית נקבוביות נגישה יותר. כתוצאה מכך, הם מראים ביצועים מעולים בהעשרה סלקטיבית של פפטידים בעלי משקל מולקולרי נמוך (LMW), בהשוואה למבנה המשושה הדו-ממדי.דבר זה נכון למרות שהם חולקים התפלגויות דומות של גודל נקבים ואותו סף מולקולרי להפרדת סרום. השביית Organy lane על שבבי MPS הופשטה על ידי הכנסת שריפה בפלזמת חמצן כדי לטיפול מקדים של פני השבב. איור זה מדגים את השחזור הספציפי למטען עבור שבבים בעלי פונקציות פני שונות, באמצעות גרף עמודות של עוצמת MS של זיהוי פפטידים שנלכדו באופן סלקטיבי על השבבים הפונקציונליים.בהתאם לנקודת האיזואלקטרית שלהם, הפפטידים בעלי מטען חיובי או שלילי ב-pH 7.0, לצד דלדול של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. התוצאות מדגימות כי התכנון המבני והפונקציונליזציה הכימית של ה-NPS הגבירו עוד יותר את הסגוליות של העשרת הפפטידים. באמצעות פיתוח זה.אנו מצפים שטכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור סמנים ביולוגיים חדשניים לאבחון מוקדם או להערכה טיפולית בתוך מערכת הנשימה במודלים אנושיים ובעלי חיים. כתוצאה מכך, היא תסייע בקידום טיפול מותאם אישית למחלות מרכזיות.

low-molecular-weight-protein-enrichment-on-mesoporous-silica-thin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

גישה חומרי הקרנה מודרכת לפתח microarrays מסוממת סול ג נגזר חלבון באמצעות שיטת סיכת הדפסה מתפתחת של ייצור מתוארת. מתודולוגיה זו באה לידי ביטוי באמצעות הפיתוח של acetylcholinesterase וmultikinase microarrays, המשמשים להקרנת מולקולה קטנה וחסכונית.

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.

הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

לא ניתן לזהות בקלות מספר סמנים ביולוגיים פתולוגיים בטכניקות הנוכחיות בגלל ריכוזם הנמוך בנוזלים ביולוגיים, נוכחותם של אנזימים מפרקים וכמויות גדולות של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. ננו-חלקיקי הידרוג'ל מתפקדים כימית יכולים לקצור, לשמר ולרכז חלבונים בשפע נמוך המאפשרים זיהוי של סמנים ביולוגיים שלא ניתן היה לזהות בעבר.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

מוצג הליך להכנת אמצעי הפרדה היברידיים נקבוביים המורכב ממונוליט פולימרי מקרו-נקבובי המצופה פנימית על ידי פולימר קואורדינציה מיקרו-נקבובי בעל שטח פנים גבוה.

הכנת תיאום מאוד נקבובי פולימר ציפויים על מונוליתים פולימר Macroporous להעשרה משופרת של Phosphopeptides

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של מולקולות בשפע נמוך פתרונות מורכבים באמצעות מולקולרית החתמה בשילוב ביוסנסור קיבול.

זיהוי העדינה של סמנים ביולוגיים באמצעות הטבעה מולקולרית מבוסס ביוסנסור קיבולי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסנתז חומרים סיליקה bioinspired, לשתק אנזימים המצוי בו. סיליקה הוא מסונתז על ידי שילוב של סודיום סיליקט, אמין 'תוספת', אשר מנטרלים בקצב מבוקר. ניתן לשנות תכונות של חומר ותפקוד בחיי עיר אנזים הנייח או פוסט-סינתטי • חומצה תנאי של תוספים שעברו אנקפסולציה.

הכנת סיליקה פונקציונלי באמצעות שיטת Bioinspired

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

פרוטוקול עבור הכנת פוליפוני (pentafluorophenyl אקרילט) (חרוזים סיליקה poly(PFPA)) הושתל מוצג. לאחר מכן, השטח functionalized poly(PFPA) הוא מרותק למיטה עם נוגדנים, בעבר בהצלחה לצורך הקמת מכשול ההפרדה חלבון באמצעות immunoprecipitation.

הכנת חרוזים2 Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

למד טכנולוגיית העשרת חלבונים ופפטידים בעלי משקל מולקולרי נמוך משתיית דם אנושי באמצעות סרטי סיליקה מזופורוס דקים. שיטה זו משפרת פרופילינג של פרוטאום ומאפשרת זיהוי סמנים ביולוגיים ליישומים אבחנתיים.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

גלה סרטונים נוספים