Name: הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למד כיצד לבודד ולהפעיל מקרופאגים אלביאולריים מעכברים באמצעות ננו-חלקיקי Polyanhydride. שיטת שטיפת הריאות והסיטומטריה זרימה מאפשרות הערכת סמני הפעלה תאית לחקר אימונולוגיה וחומרים ביורפואיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות צבא ארה&quot;ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור תמיכה כספית ד&quot;ר שון ריגבי מ מתקן מדינת איווה אוניברסיטת cytometry זרימה עבור מומחה סיוע טכני שלו.

<ol><li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642(2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li>
<li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung%3A+Distinguishing+between+marginated%2C+interstitial%2C+and+alveolar+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li>
<li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li>
<li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li>
<li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+lung+function+in+the+mouse%3A+the+challenge+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4(2003).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Nanoparticle Polyanhydride פלטפורמות החיסונים הראו יעילות כאשר מנוהל intranasally ב משטרי מינון יחיד 5. מדידת ההפעלה של אוכלוסיות תאים מקומיים phagocytic של הריאות הנגרמת על ידי אספקת פלטפורמה זו מאפשרת חיסון הערכת היכולת הפוטנציאלית שלה בסופו של דבר לקדם את המערכת החיסונית אדפטיבית. באופן ספציפי, קצירת מקרופאגים מכתשיים מנוזל שטיפה ריאות וטיפול אותם ניסוחים שונים של חלקיקים מספק תובנות לגבי היכולות של...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CAM מדיה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין 10,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פתרון </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר FACS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן זרחתי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (שור אלבומין סרום) </td><td> סיגמא </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> אזיד הנתרן </td><td> סיגמא </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> עכברוש IgG </td><td> סיגמא </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MS CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MS MHC II haplotype IA / IE, שיבוט M5/114.15.2, מצומדות כדי isothiocyanate fluorescein (FITC) </td><td> eBioscience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD86 העכבר, שיבוט GL-1, מצומדות כדי allophycocyanin (APC), Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD40 העכבר, שיבוט 1C10, מצומדות כדי APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD209, שיבוט 5H10, מצומדות כדי ביוטין </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> נגד העכבר CD11b, שיבוט M1/70, מצומדות כדי Alexa פלואוריד 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> נגד העכבר F4/80, שיבוט BM8, מצומדות כדי phycoerythrin (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-טקסס אדום מצומדות streptavidin </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> מתכלים אחרים ריאגנטים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A405-20 </td><td> משמש% 70 (V / V) </td></tr><tr><td> דחוס CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> ריבונית ½ 3 &quot;Catcatheter האב טום </td><td> קנדל </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית הממשלה </td><td> NUAIRE </td><td> סדרה 22 </td><td></td></tr><tr><td> דיסקציה מספריים </td><td> דיג </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X ללא סידן ומגנזיום </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 צנטריפוגות צינורות מ&quot;ל עם שווי בורג </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> ששת גם בתרבית רקמה המטופלים צלחות </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> תחתית Racks פלסטיק </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> מגרד תא 24 ס&quot;מ </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל פוליסטירן מסביב התחתונה Tube </td><td> בז </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet, סיוע XL </td><td> דראמונד </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, ו - 2 מ&quot;ל טפטפות </td><td> דיג </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ו 10 micropipettors μL </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ו 10 פיפטה טיפים μL </td><td> דיג </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD ייצובמיצב </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II diluent </td><td> Beckman Coulter- </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> זאפ ב-oglobin מגיב ממוסס </td><td> Beckman Coulter- </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> קולטר בקבוקוני פלסטיק פוליסטירן מונה </td><td> Beckman Coulter- </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> מבחנות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> ציוד </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> בקירור צנטריפוגה </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> החממה Humidified CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> דגם Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto תזרים Cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> קולטר החלקיקים מונה Z1 </td><td> Beckman Coulter- </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> נוזלי Sonicator ציוד לעיבוד עם Microtip </td><td> Misonix </td><td> מס &#39;דגם S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים murine והערכת בהשפעת חלקיקים polyanhydride

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

חלקיקים מתכלה צמחו כפלטפורמה צדדי על התכנון והיישום של אפי חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. באופן ספציפי, polyanhydride חלקיקים מורכב חומצה sebacic aliphatic (SA), ארומטי 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), או amphiphilic 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) להציג בתפזורת ייחודי סחף קרקע קינטיקה 1,2 וניתן לנצל לשחרר באיטיות ביומולקולות תפקודית (למשל, אנטיגנים, נוגדנים חלבון וכד &#39;) in vivo 3,4,5. אלו חלקיקים גם בעלי פעילות משלים מהותי, מה שהופך אותם בחירה מצוינת עבור פלטפורמת אספקת החיסון 6,7,8. על מנת להבהיר את המנגנונים השולטים ההפעלה של חסינות מולדת בעקבות החיסון הרירית אפי, יש להעריך את התגובות מולקולרית תאית של p אנטיגןתאים כועס (נגמ&quot;שים) אחראית ליזום התגובה החיסונית. התאים הדנדריטים הם נגמ&quot;שים העיקריים שנמצאו בניהול דרכי הנשימה, בעוד מקרופאגים מכתשיים (AMɸ) שולטים parenchyma ריאות 9,10,11. AMɸ הם היעילה ביותר בניקוי הריאות של פתוגנים חיידקים ופסולת תא 12,13. בנוסף, זה סוג תא יש תפקיד חשוב בהובלה של אנטיגנים של חיידקים אל קשרי הלימפה וניקוז, וזה צעד ראשון חשוב בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית 9. AMɸ גם מביעים רמות גבוהות של זיהוי תבניות מולדות קולטנים זבל, מפרישים Pro דלקת מתווכים, וראש ותאי T נאיבי 12,14. האוכלוסייה טהורה יחסית של AMɸ (למשל, יותר מ 80%) יכול בקלות להיות מושגת באמצעות שטיפה ריאות למחקר במעבדה. תושב שנקטפו AMɸ מבעלי חיים המוסמכות החיסונית לספק הפנוטיפ מייצג של מקרופאגים אשר encounter חיסון החלקיקים מבוסס in vivo. במסמך זה אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים הקציר ותרבות AMɸ מעכברים ולבדוק את הפנוטיפ הפעלה של מקרופאגים לאחר הטיפול עם חלקיקים polyanhydride במבחנה.

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

ננו-חלקיקים מתכלים ביולוגית הפכו לפלטפורמה רב-גונית לתכנון וליישום של חיסונים אינטראנזאליים (דרך האף) חדשים נגד מחלות נשימה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את יכולתם של ננו-חלקיקי פולי-אנहाइडריד להפעיל מקפגים אלביולריים מטוהרים. ראשית, קנה הנשימה של העכבר נחשף בניתוח ומבוצע שטיפה (lavage) כדי לאסוף תאים מדרכי הנשימה. לאחר מכן, המקפגים האלביולריים מופרדים על ידי סבוב (centrifugation) לצורך בידודם ומגודלים במעבדה למשך לילה.לאחר מכן מכינים תרחיף של ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד ומוסיפים אותו למקרופאגים אלveולריים. המקרופאגים מדגגריים למשך 48 שעות כדי לאפשר הפעלה. ביטוי של סממנים על פני השטח של התאים מנותח באמצעות ציטומטריית זרימה.ניתוח הנתונים מאפשר זיהוי של פורמולציות של ננו-חלקיקי Polly Anhydride המסוגלות להפעיל מקפגאים אלבואולריים. ממצא זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות בתחומי הביומטריאלים והאימונולוגיה. באופן ספציפי, אנו יכולים לזהות ביומטריאלים בעלי פעילות אדג'ובנטית (adjuvant) מובנית, כפי שמעידה היכולת להפעיל תאים מציגי אנטיגן, כולל מקפגאים אלבואולריים.חשבנו לראשונה להשתמש בשיטה זו במחקרינו כאשר גילינו כי פלטפורמה של ננו-חיסון פולי-אנהידריד נגד פתוגנים נשימתיים סיפקה הגנה מלאה מפני דלקת ריאות חיידקית. בעבודה הנוכחית, ביקשנו לבחון את האינטראקציות הספציפיות של פלטפורמת החיסון עם תאי מערכת החיסון בדרכי הנשימה. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת עכבר שהורדם על גבו.רססו את העכבר ב-70% ethanol; למרות שבמקרה זה נעשה שימוש בעכבר C 57 BL six בן שש עד שמונה שבועות, ניתן לבצע טכניקה זו בכל זן של עכבר. אתרו את עצם הסטרנום (sternum) והחדירו מחט 23 gauge עם מזרק של one milliliter בזווית של 30 מעלות מהבטן. אספו 0.4 עד one milliliter של דם, בערך 50 millimeters לתוך חלל בית החזה, בדרך כלל מהווריד (vena cava).ביצוע פרוצדורה זו עלול להוביל לקשיי רכישה של חומרים עבור הניסויים שלהם. זו הסיבה שחשוב מאוד לבצע אותה בזהירות, כפי שמוצג כאן. כדי לבצע את השטיפה, הפכו את העכבר על בטנו ורססו אותו ב-70% ethanol.לאחר מכן, צבטו את העור בערך במחציתו של עמוד השדרה באמצעות מספרי ניתוח שעומדרו ב-70% ethanol. בצעו חתך קטן דרך העור. תפסו את העור משני צידי החתך ומשכו בכיוונים מנוגדים לאורך הציר הקרניאלי של העכבר.לאחר חשיפת השרירים ובלוטות הצוואר, חתכו בזהירות את רקמת השריר. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, משכו את הרקמה לכיוון החלק הקדמי של העכבר כדי לחשוף את הלרינקס (גרון), הקנה והוושט.הימנעו מחיתוך הווריד הג'וגולרי (jugular vein) או העורק הקרוטידי (carotid artery). ניתן לזהות את קנה הנשימה (trachea) כרקמה המוקפת טבעות סחוס. בעזרת פינצטה, תפסו בעדינות את קנה הנשימה והרימו אותו בעדינות כדי להפרידו מהוושט (esophagus), הממוקם בצד הגבי (dorsal side).מלאו מזרק של 1 cc המצויד בקטטר tomcat ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, בזווית של 45 מעלות, בצעו חתך קטן בקנה הנשימה (trachea) לפני הפנסיים (forceps), אך מאחורי הגרון (larynx).הימנעו מחיתוך מלא של הקנה, כדי למנוע ממנו להיסוג אל תוך חלל הגוף. בעזרת פינצטה, החזיקו את הקנה והחדירו בעדינות את הקטטר למרחק של כ-20 millimeters אל תוך נקודת החיתוך בקנה. לאחר מכן, אחזו בקנה סביב צינור הקטטר כדי לפנות את היד השנייה לביצוע עיסוי חיצוני של בית החזה.השתמשו במזרק של 1ml המצויד בקטטר כדי להחדיר בעדינות 0.75ml של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר לתוך הריאות. לאחר מכן, שאבו בעדינות את ה-PBS חזרה אל המזרק. חזרו על תהליך זה שלוש פעמים.נתקו את המזרק מהקטטר ורוקנו את נוזל השטיפה לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח של 15 milliliter. מלאו את המזרק ב-0.75 milliliters של PBS טרי, חברו שוב את המזרק לקטטר וחזרו על השטיפה. השבת הנוזלים עשויה להיות חלקית, ולכן ייתכן שיושג נפח קטן יותר מהנפח שהוזרק.אם התאים נאספים ביותר מעכבר אחד, יש להניח את המבחנה בנפח 15 מיליליטר עם התאים שנאספו על קרח עד לסיום כל שטיפות הריאות. כדי להעשיר את אוכלוסיית המקרופאגים האלבולאריים בתאים שנאספו, יש לסובב במערך צנטריפוגה את נוזל שטיפת הריאה ב-250 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.בעזרת טכניקה סטרילית, העבירו את העילוי למכל פסולת מתאים בתוך קבينة בטיחות ביולוגית. השעו את משקע התאים על ידי רעידה עדינה של מבחנת הצנטריפוגה על פני מעמד למבחנות. הוסיפו 1 mL של מצע מלא למקרופאגים אלבולאריים כדי לששש את התאים לצורך ספירתם.העבירו בפיפטה 20 µL של תאי דם לתוך 10 mL של מדלל isotone two בבקתילת ספירת תרבית. הוסיפו לבקתילה שלוש עד ארבע טיפות של zog globin, two lytic reagent והפו את הבקתילה בעדינות שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן, הכניסו את בקתילת הדגימה למספר חלקיקים colter particle counter Z one counter.הקפידו לתכנת את המונה עם מקדם דילול של 2 × 10⁴ כדי להציג את ריכוז התאים כמספר תאים למיליליטר. לאחר שריכוז התאים נקבע, דללו את התאים ל-2.5 × 10⁵ למיליליטר באמצעות מצע מלא למקרופאגים אלוולאריים בתוך מבחנה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו שני מיליליטרים מהתמיסה לכל באער בצלחת תרבית רקמות בעלת שישה באערים.כדי להעשיר את המקרופאגים האלבולריים, דגרו את צלוחיות התרבית באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C ואטמוספירה של 5%CO2 למשך שש שעות. במהלך הדגירה, המקרופאגים ייצמדו לתחתית הבאר; לאחר הדגירה, שאבו בעדינות את הנוזל העליון (supernatant) תוך הקפדה שלא להפריע לתאים הצמודים. לאחר מכן, שטפו את הבארים באמצעות PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום.כדי להסיר תאים שאינם נצמדים ושאריות תאים, הוסיפו שתי מיליליטרים של מצע גידול מלא למקרופאגים אלוולאריים לכל באר, ולאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. לאחר שלב העשרה זה, כ-87% מהתאים יהיו חיוביים לסממני המקרופאגים CD 11 B ו-F4/80.לאחר הגביית והעשרת אוכלוסיית המקרופאגים האלבולריים, השלב הבא בפרוצדורה הוא הוספת ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד. ראשית, ייצרו את הננו-חלקיקים באמצעות ננו-כמיסה (nanoencapsulation) של פולי-אנהידריד בשיטת נוגד-ממס. בתהליך זה, הפולימר מומס במתילן כלוריד ומשקיע בפנטאן. שקלו את הכמות המתאימה של ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד באמצעות נייר שקילה סטרילי.כאן, מוסיפים 125 micrograms של חלקיקים עבור כל milliliter של תרבית. העבירו את החלקיקים למבחנה של micro centrifuge בנפח 1.5 milliliter, השעיקו מחדש את הננו-חלקיקים בכמות המתאימה של מצע alveolar macrophage מלא וקר (בטמפרטורת קרח), והניחו אותו על קרח. לאחר מכן, סטריליזו את הקצה (microtip) של מכשיר sonicate שולחני.רססו את המבחנה ב-70% ethanol ונגבו בעזרת נייר Kim wipe סטרילי, תוך שמירה על המבחנה על קרח. בצעו סוניקציה בעוצמה של 10 עד 20 joules למשך 30 עד 45 שניות. במידה והחלקיקים אינם מפוזרים מספיק, בחנו את תרחיף הננו-חלקיקים באופן מאקרוסקופי.הנח את התרחיף על קרח למשך דקה עד שתיים כדי להבטיח שהננו-חלקיקים נמצאים מתחת לטמפרטורת מעבר הזכוכית של הפולימר. לאחר מכן, בצע סוניקציה שנית למשך 30 עד 45 שניות. מטרת שלב הסוניקציה היא לפזר את הננו-חלקיקים באופן הולם כפי שמופיע בתג 50 50 CCP.ננו-חלקיקי CPH נוטים להתרקב כאשר הם נחשפים לסביבה מימיה. עם זאת, ייתכן שחלק מהצברים הקטנים של ננו-חלקיקים עדיין יישארו בסספנסיה. יש לשמור את סספנסיית הננו-חלקיקים על קרח ולהשתמש בה באופן מיידי כדי למנוע שחיקה מוקדמת של פני השטח או התרקב.הוציאו את צלחות התרבית המכילות את המקרופאגים האלבאולריים מהאינקובטור והניחו אותן בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. הטו את הצלחת בזהירות כדי לא להפריע לתאים הדבקים, ושאבו בעזרת פיפט את כמות המדיום שתתווסף לת сусפנסיון הננו-חלקיקים. ערבבו את סספנסיון הננו-חלקיקים הפולי-אנהידריד באמצעות וורטקס לזמן קצר, ולאחר מכן העבירו בעזרת פיפט עד 0.3 milliliters של סספנסיון הננו-חלקיקים לבארים המתאימות.שוב, יש להיזהר לא להפריע לתאים הדבקים. החלקיקים ישקעו לתחתית הבאר ויבואו במגע עם התאים. המשיכו לבארות הבאות ולקבוצות הטיפול הרצויות.כלול קבוצות ביקורת חיוביות ושליליות, כגון מצע בלבד, ו-200 nanograms per milliliter של Lipopolysaccharide בבארות המיועדות, ולאחר מכן דגור ב-37 °C למשך 48 שעות. לאחר הדגירה, ניתן להעריך את הפעלת האלבאולאר באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) כפי שמתואר במסמך המצורף.מאקרופאגים אלבולאריים הופקו מעכברי C 57 BL six והועשרו כפי שמתואר במאמר הווידאו כדי להעריך אקטיבציה תאית. 125 µg/mL של ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד 50 50 CPT CPH הוספו ל-5×10⁵ תאים/mL של מאקרופאגים אלבולאריים מועשרים למשך 48 שעות. ביטוי של סמני מאקרופאגים אלבולאריים, MHC II, CD 40, CD 86 ו-SIRT, נבחן לאחר מכן באמצעות צביעה בנוגדנים וציטומטריה של זרימה, כפי שניתן לראות בהיסטוגרמה זו.במקרופאגים אלבולאריים שדוהרו עם ננו-חלקיקים, המסומנים בקו הכחול הרצוף, נצפתה עלייה בביטוי השטחי של MHC two, מולקולה הדרושה להצגת אנטיגן לתאי CD four T, בהשוואה לאלו שלא טופלו בננו-חלקיקים, כפי שצופה. רמות צביעה נמוכות יותר נצפו בביקורת fluorescence minus one (FMO), מה שמעיד על כך שהאות שנצפה אינו נובע מאוטופלורסצנציה. במקרופאגים אלבולאריים שדוהרו עם ננו-חלקיקים, המסומנים בקו הכחול הרצוף, נצפה ביטוי מוגבר של CD 40, מולקולה קו-סטימולטורית הנחוצה להפעלה תקינה של תאי T, בהשוואה לתאים שלא טופלו.ביטוי של מולקולה קו-סטימולטורית נוספת של תאי T, CD 86, עלה גם הוא בעקבות טיפול בננו-חלקיקים של פולי-אנהידריד למשך 48 שעות. הביטוי של CY, קולטן לקטין מסוג C הנקשר למוטיבים של פחמימות הנמצאים על פני פתוגנים, מוגבר משמעותית במקרופאגים אלבולאריים לאחר טיפול בננו-חלקיקי פולי-אנהידריד. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע שטיפת לונג (lung lavage) במטרה לאסוף מקרופאגים אלבולאריים, כיצד לתרבת תאים אלו, וכן כיצד לגרות תאים אלו כדי למדוד או להעריך את ההפעלה התאית שלהם באמצעות ננו-חלקיקי פולי-הידרו.בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בטכניקות מעבדה סטריליות כדי למנוע זיהום של התאים הראשוניים הנאספים וכדי למנוע הכנסת מזהמים אל תוך הטיפולים.

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

כאן אנו מתארים את המודל והגישה לחקר הפונקציות של מקרופאגים מכתשית ריאתית בגרורות סרטניות. כדי להדגים את תפקידם של תאים אלה בגרורות, נעשה שימוש במודל הסינגני (4T1) של סרטן השד בשילוב עם דלדול המקרופאגים המכתשית עם ליפוזומים קלודרונאטיים.

לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

מצב בריאותי של הריאה משתקף על ידי סוג ומספר של תאים חיסוניים הנמצאים bronchioles של הריאה. אנו מתארים טכניקת שטיפה ברונכואלוואלית המאפשרת בידוד ומחקר של תאים לא דליקים וגורמים מסיסים ממערכת הנשימה התחתונה של עכברים.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לקביעת האם חשיפה לאוזון, קריטריון מזהם אוויר, פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה מנצל בדרך כלל ריאגנטים וטכניקות והוא יכול להיות מותאם מודלים מרובים של פגיעה בריאות כדי לקבוע את ההשפעות על מכתשי מקרופאג efferocytosis.

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.

תא עיתונאי מקרופאג שיטה לבחון קולטן שיחת כמו-תיווך NF-kB/AP-1 איתות על שכבות חלבון Adsorbed על משטחים פולימריים

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

למד כיצד לבודד ולהפעיל מקרופאגים אלביאולריים מעכברים באמצעות ננו-חלקיקי Polyanhydride. שיטת שטיפת הריאות והסיטומטריה זרימה מאפשרות הערכת סמני הפעלה תאית לחקר אימונולוגיה וחומרים ביורפואיים.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

גלה סרטונים נוספים