Name: שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: למדו שאיפת מיקרופיפטה למדידת נוקשות תאית בתאי אנדותל עורקיים. שיטה זו מאפשרת הערכת תכונות ויסקואלסטיות תאיות וחקר השפעת טיפולים שונים על מכניקה תאית ביולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+red+cell+membrane.+I.+Membrane+stiffness+and+intracellular+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure.</a> Biophys. J. 4, 115-135 (1964).</li>
<li>Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+maps+of+red+cell+deformation%3A+hidden+elasticity+and+in+situ+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity.</a> Science. 266, 1032-1035 (1994).</li>
<li>Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+mechanical+properties+of+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Passive mechanical properties of human leukocytes.</a> Biophys. J. 36, 243-256 (1981).</li>
<li>Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Re.s+Commun%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of the cell nucleus.</a> Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).</li>
<li>Needham, D., Nunn, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+deformation+and+failure+of+lipid+bilayer+membranes+containing+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol.</a> Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).</li>
<li>Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+micropipette+technique+to+the+measurement+of+cultured+porcine+aortic+endothelial+cell+viscoelastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).</li>
<li>Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+a+homogeneous+half-space+model+in+the+analysis+of+endothelial+cell+micropipette+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements.</a> J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> J. Biomech. 33, 15-22 (2000).</li>
<li>Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+models+for+living+cells--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanical models for living cells--a review.</a> Journal of Biomechanics. 39, 195(2006).</li>
<li>Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+analytical+and+inverse+finite+element+approaches+to+estimate+cell+viscoelastic+properties+by+micropipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration.</a> Journal of Biomechanics. 42, 2768(2009).</li>
<li>Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+studies+on+viscoelastic+properties+of+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane.</a> Biophys. J. 24, 463-487 (1978).</li>
<li>Evans, E., Kuhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+material+behavior+of+granulocytes+based+on+large+deformation+and+recovery+after+deformation+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests.</a> Blood. 64, 1028-1035 (1984).</li>
<li>Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress.</a> Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).</li>
<li>Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+increases+membrane+stiffness+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells.</a> Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).</li>
<li>Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+role+of+cell+stiffness+in+modulation+of+volume-regulated+anion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels.</a> Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).</li>
<li>Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+actin+and+cell+stiffness+is+modulated+by+substrate+stiffness+in+2D+and+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D.</a> Journal of Biomechanics. 42, 1114(2009).</li>
<li>Evans, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+surfactant+bilayer+membranes%3A+thermal+transitions%2C+elasticity%2C+rigidity%2C+cohesion+and+colloidal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions.</a> Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).</li>
<li>Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellular+cholesterol+on+membrane-cytoskeleton+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion.</a> J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).</li>
<li>Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oxLDL-induced+decrease+in+lipid+order+of+membrane+domains+is+inversely+correlated+with+endothelial+stiffness+and+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).</li>
<li>Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+Cellular+Cholesterol+Content+Affects+Traction+Force%2C+Adhesion+and+Cell+Spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading.</a> Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).</li>
<li>Mitchinson, J. M., Swann, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanical+Properties+of+the+Cell+Surface%3A+I.+The+Cell+Elastimeter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter.</a> J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).</li>
<li>Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxLDL+increases+endothelial+stiffness%2C+force+generation%2C+and+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation.</a> J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).</li>
<li>Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+numerical+analyses+of+local+mechanical+properties+measured+by+atomic+force+microscopy+for+sheared+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater.+Eng%22%5BJournal%5D)">Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells.</a> Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453(2007).</li>
<li>Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oxLDL+facilitates+flow-induced+realignment+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).</li>
<li>Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li>
<li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+the+microrheology+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102(2001).</li>
<li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+cytoskeletal+prestress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-tracking+microrheology+of+living+cells%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li>
<li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+fluids%3A+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li>
<li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Microaspiration מספק שיטה פשוטה ולשעתק מאוד להעריך נוקשות תא / deformability על ידי הפעלת לחץ שלילי על קרום תא ומדידת deformability קרום בתגובה ללחץ מוגדר היטב. היא פותחה לראשונה על ידי Mitchison וסוואן (1954) כדי לאפיין את תכונות האלסטיות של ביצי קיפודי ים כדי לספק תובנה לתוך מנגנוני חלוקת תא 21 ולאחר מכן להסתכל על התכונות המכאניות בתאי דם אדומים 1. שיטה זו נעשתה שימוש במחקרים מרובים כדי להעריך את המאפיינים ביומכניים של סוגי תאים שונים (למשל 2,...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> סאטר פיפטה חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט ההפוך </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200 מ&#39; </td><td> מיקרוסקופ צריך להיות מצויד רצוי עם יכולות 3D/deconvolution. </td></tr><tr><td> מצלמת וידאו </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td> תמונת הרכישה sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> מתמרים לחץ פניאומטיים </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> טסטר מתמר פניאומטיים DPM1B כעת ניתן למצוא על ידי FLUKE. </td></tr><tr><td> כוס טפטפה </tד&gt; <td> Richland </td><td> כוס מותאמת אישית </td><td> Pipettes היה אישית עם קוטר פנימי 1.2 וקוטר חיצוני 1.6. </td></tr><tr><td> DiI דיי </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> מתמוסס היטב בDMSO </td></tr></tbody></table>

שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

מספר גדל והולך של מחקרים מראה כי מאפיינים ביומכניים של תאים בודדים לשחק תפקידים מרכזיים בתפקודים תאיים רבים, כולל תרבות של תאים, התמיינות, הגירה ואינטראקציות תא סלולרי. שני הפרמטרים המרכזיים של ביומכניקה הסלולרית הם deformability סלולרי או קשיחות והיכולת של התאים להתכווץ ולייצר כוח. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה להערכת נוקשות תא על ידי מדידת מידת עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מיושם על ידי micropipette זכוכית לתא השטח, טכניקה שנקראת איפת micropipette או Microaspiration. Microaspiration מתבצע על ידי משייכת זכוכית נימים ליצור micropipette עם טיפ קטן מאוד (2-50 קוטר מיקרומטר תלוי בגודל של תא או דגימת רקמה), אשר לאחר מכן הוא מחובר למתמר לחץ פנאומטי והביא לסיומו קרבת תא מתחת למיקרוסקופ. כאשרקצה פיפטה נוגע תא, שלב של לחץ שלילי יוחל על פיפטה ידי מתמר לחץ פנאומטי יצירת לחץ מוגדר היטב על קרום התא. בתגובה ללחץ, הממברנה להישאף לעיוות קרום פיפטה ומתקדמת או &quot;היטל קרום&quot; לתוך פיפטה נמדדת כפונקציה של זמן. העיקרון הבסיסי של גישה ניסויית זה הוא שמידת עיוות קרום בתגובה לכוח מכאני מוגדר היא פונקציה של קשיחות הממברנה. הקרום הוא נוקשה, השיעור האיטי יותר של עיוות קרום וטכניקת length.The שאיפת המצב יציב ניתן לבצע קצר בתאים מבודדים, היא בהשעיה ומצע-מצורפי האברונים, גדולים, וליפוזומים. ניתוח מתבצע על ידי השוואת דפורמציות קרום מקסימליים שהושגו תחת לחץ נתון לאוכלוסיות תאים שונים או בתנאי ניסוי. &quot;מקדם קשיחות&quot; הוא estimated ידי התוויית האורך נשאף, של עיוות הממברנה כפונקציה של לחץ המופעל. יתר על כן, את הנתונים ניתן לנתח נוסף להעריך מודולוס של יאנג של התאים (ה &#39;), הפרמטר הנפוץ ביותר לאפיון קשיחות של חומרים. חשוב לציין כי קרום פלזמה של תאים האיקריוטים יכול להיחשב כמערכת דו מרכיב בי bilayer שומני הממברנה underlied ידי cytoskeleton-קרום משנה ושזה cytoskeleton המהווה הפיגום המכאני של הקרום ושולט deformability של מעטפת התאים. גישה זו, אם כן, מאפשרת לחקור את התכונות של biomechanical cytoskeleton משנה הממברנה.

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה למדידת נוקשות תא. העיקרון הכללי של גישה זו הוא למדוד עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מוגדר היטב ליישם באמצעות micropipette על פני התא. שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לחקור את התכונות של תאי מצע biomechanical-מצורפים.

מספר גדל והולך של מחקרים מראה כי תכונות ביומכניות של תאים בודדים ממלאות תפקידים מרכזיים בתפקודים תאיים מרובים, כולל ...

מטרת הניסוי הבא היא לנתח תכונות ויסקו-אלסטיות תאיות תחת תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. דבר זה מושג על ידי הפעלת לחץ שלילי על ממברנת התא באמצעות מיקרו-פיפט המחובר למתמר לחץ, שנבנה מקפילרות זכוכית באמצעות שובר מיקרו-פיפט. הפיפט מורכב על מיקרו-מניפולטור עדין הממוקם על במה של מיקרוסקופ הפוך, וקצה הפיפט מובא לסמיכות רבה לתא.בשלב הבא, נוצר איטום בין קצה הפיפטה לממברנת התא, ולאחר מכן נמדדת עיוות הממברנה אל תוך הפיפטה בתגובה לצעד של לחץ שלילי המופעל על התא. התוצאות המתקבלות מראות את ההשפעות של טיפולים שונים על תכונות ביומכניות תאיות, בהתבסס על מידת עיוות הממברנה בתגובה לכוח מוגדר היטב. מטרת המעבדה שלנו היא לחקור את ההשפעה של דיסליפידמיה על תכונות ביופיזיות וביומכניות של תאי אנדותל כלי דם, והיום נציג בפניכם שיטה הנקראת micropipet aspiration המשמשת אותנו למדידת קשיחות תאים.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על ההבנה הבסיסית של ביומכניקה תאית במנגנונים מרובים, כגון אנגיוגנזה, חישוש מכני, נדידה ועוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביומכניקה תאית, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון ממברנות מודל, אברונים תוך-תאיים או רקמות. כדי להדמיות את ממברנת התא ולצפות בבליטת הממברנה אל תוך הפיפטה, צובעים ממברנות של תאי אנדותל כלי דם בצבע פלואורסצנטי ליפופילי.כדי להתחיל, דללו את צבע המלאי לריכוז עבודה באמצעות תמיסת PBS מחוממת; סונוקציה לתערובת למשך חמש דקות כדי לפרק את מקבצי ה-D. לאחר סבב של חמש דקות במיקרו-צנטריפוגה, הסירו את העליון; שטפו תאי אנדותל וסקולריים על ידי הוספת 0.5 milliliters של PBS. לאחר חמש דקות, שאבו את התמיסה והמשיכו בשתי שטיפות נוספות.לאחר מכן, הוסף את תמיסת ה-dice לתאים והדגר למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההדגרה, שטוף שוב את התאים עם PBS כפי שבוצע קודם לכן. מיקרו-פיפטות מיוצרות על ידי חימום של קפילרה מזכוכית במרכזה.כאשר הזכוכית מתחילה להמס, שני חצאי הנימים נמשכים זה מזה ליצירת שתי מיקרו-פיפטות. קצות הפיפטות המשמשות בניסויים אלו נעים בדרך כלל בין 2 ל-6 מיקרון בקוטר חיצוני, בהתאם לגודל התא; צורת הקצה צריכה להיות בקירוב של צינור גלילי לפני הכנסת ניב הזכוכית למכשיר משיכת הפיפטות.בהדגמה זו, נעשה שימוש במכשיר למשיכת פיפטות אופקי מדגם Suter P 97 עם תוכנית מותאמת. מכשיר משיכה זה מציע אפשרויות תכנות מרובות לשינוי המהירות ופרמטרים אחרים של המשיכה. התקדמו להפעלת תוכנית המשיכה.לאחר משיכת כל מיקרו-פיפט, יש לוודא את צורת החוד תחת המיקרוסקופ. לאחר ליטוש החוד באש, מלאו את המיקרו-פיפט בתמיסת סלין פיזיולוגית כגון PBS או במצע גידול שאינו פלואורסצנטי. חשוב לציין כי התמיסה צריכה להיות מועשרת ב-30% serum, מה שיאפשר לממברנת התא לנוע בצורה חלקה לתוך הפיפט. בהדגמה זו, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם יכולות דה-קונבולוציה תלת-ממדית (3D deconvolution), המחובר למצלמת וידאו ולמחשב, למתמר לחץ, לתחנה נטולת רעידות ולמיקרו-מניפולטור, כדי להתחיל להעביר תאים לתא שאיבה מיקרוסקופי על ידי הרמת התאים מהמצעים שלהם והעברתם באמצעות פיפטה לתא אורך רדוד המותקן על המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך.הרציונל לשימוש בתא אורך רדוד הוא לאפשר למיקרו-פיפט לגשת לתאים בזווית רדודה מאוד, קרובה ככל האפשר לאופקית. זאת כדי לאפשר את הדמיון של הממברנה שנמשכה לתוך המיקרו-פיפט במישור מיקוד בודד. הכניסו מיקרו-פיפט מלא למחזיק פיפט המחובר למתמר כוח (power transducer) באמצעות צינור גמיש, שקוטרו מותאם למחבר של מחזיק הפיפט כדי להבטיח התאמה הדוקה.בתחילת כל ניסוי, יש להשוות את הלחץ בפיפט ללחץ האטמוספרי, ולהרכיב את הפיפט על מיקרו-מניפולטור המאפשר בקרה מדויקת של תנועות הפיפט בטווח של מיקרונים. יש למקם את הפיפט בזווית רחבה ביחס לתחתית התא ולהביא את קצה הפיפט למרכז שדה הראייה. את גוף הפיפט (shank), שהוא החלק הגלילי של קצה הפיפט שבו נשאבת הממברנה, יש ליישר באופן אופקי למישור המוקד.כדי להשיג את המיקום הראשון, הנח את הפיפטה בזווית השטוחה ביותר האפשרית ולאחר מכן כופף את גוף הפיפטה כנגד תחתית התא. מכיוון שגוף הפיפטה דק מאוד, הוא גמיש מספיק כדי להחליק על תחתית התא תוך כדי התקרבות לתא. הורד לאט את המיקרו-פיפטה אל צדו של תא בודד באמצעות המניפולטור הגס, עד להגעה לאזור מישור המיקוד של התא.לאחר מכן, בעזרת המניפולטור העדין, העבירו את המיקרו-פיפט לקצה התא עד שקצה הפיפט נוגע בעדינות בממברנה. צלמו תמונה אחת כדי לבחון את מיקום הפיפט. אטמים טובים נוצרים כאשר כל קצה הפיפט נמצא במגע מלא עם פני השטח של התא והמגע יציב.בשלב הבא, הפעל שלב של לחץ שלילי באמצעות המתמר ושמור עליו עד להתייצבות בליטת הממברנה. כמות הלחץ הדרושה לשאיבת הממברנה אל תוך הפיפטה משתנה בהתאם לסוג התא ולתנאים ניסויים ספציפיים. עיוות ראשוני נצפה בדרך כלל בעת הפעלת לחץ בטווח של מינוס 2 עד מינוס 15 millimeters of mercury.עם הפעלת הלחץ, הממברנה מעוצבת בהדרגה לתוך הפ pipette עד להתייצבותה באורך מסוים. תהליך זה נמשך בדרך כלל שתיים עד שלוש דקות; במהלך זמן זה, יש לצלם תמונות של דפורמציית הממברנה בכל 30 שניות כדי לעקוב אחר התקדמות הממברנה שנמשכת לתוך ה-pipette. לבסוף, הגבירו את הלחץ לרמה הבאה בצעדים של 2 עד 5 mmHg.חזור על הפרוצדורה כולה עד שהבליטה של הממברנה תתנתק מהתא ותיכנס לתוך הפיפטה, ובנקודה זו הניסוי ייעצר. כדי לכמת את מידת העיוות של הממברנה, נמדד אורך השאיבה מקצה הפיפטה ועד לשיא ההיקף של בליטת הממברנה. פיפטה גדולה יותר תפעיל כוח רב יותר על ממברנת התא באותה רמת לחץ, כדי להתחשב בשונות בין קטרי הפיפטות.אורך השאיבה מנורמל לקוטר הפיפטה שנמדד עבור כל ניסוי כדי לתקף את השימוש בטכניקת מיקרו-שאיבה עבור תאים המחוברים למצע; בניסוי נבדק כי שיבוש של F actin מוביל לירידה בנוקשות התאים של תאי אנדותל מאורטות של בקר כפי שהוערכה בגישה זו. כאן מוצגת, כצפוי, סדרה טיפוסית של תמונות פלואורסצנטיות של ממברנה אנדותלית העוברת דפורמציה הדרגתית בתגובה ללחץ שלילי המופעל באמצעות מיקרו-פיפטה. הממברנה נשאבת בהדרגה אל תוך הפיפטה ואורך השאיבה עולה כפונקציה של הלחץ המופעל; סדרות זמן של הדפורמציה מראות כי שיבוש של f actin מגביר משמעותית את אורכי השאיבה של הבליטות תחת כל תנאי הלחץ.באמצעות גישה זו, התגלה כי קשיחות התאים עולה כאשר ממברנות תאיות מרוקנות מקולסטרול, בעוד שהעשרה בקולסטרול לא השפיעה. כאן מוצגים תא עשיר בקולסטרול, תא בקרה ותא מרוקן מקולסטרול לאחר שהגיעו לאורכי שאיבה מקסימליים של 15- מילימטרים של כספית. הבליטות החלו להתפתח בדרך כלל ב-10- מילימטרים של כספית, וניתן היה למדוד את זמני הגרימה לעיוות הממברנה עבור לחצים שליליים של 10, 15 ו-20 מילימטרים של כספית.כאן, אורכי השאיבה המקסימליים מוצגים כפונקציה של הלחץ המופעל. האורך הנורמלי המקסימלי בתאים מרוקנים היה נמוך באופן מובהק מזה של תאי הביקורת בלחצים של 15- millimeters of mercury ו-20- millimeters of mercury. הפעלת לחצים שליליים מעל 25 millimeters of mercury גרמה להיפרדות של הבליטה שנשאבה, שיצרה שלולית נפרדת.רמת הלחץ שהובילה להיפרדות הממברנה הייתה דומה תחת תנאי כולסטרול שונים, ותצפית זו הייתה בלתי צפויה. שכן מחקרים קודמים מראים כי העלייה ברמת הכולסטרול בממברנה מגבירה את הקשיחות של השכבות הליפידיות הכפולות של הממברנה. ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בשלוש עד שתי שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסוי בטכניקה זו, חשוב לזכור כי ניסוי זה מבוצע על תאים בודדים.לפיכך, יש לנתח בין שלושה לחמישה תאים לכל תנאי, לכל ניסוי, עבור סך כולל של שלושה ניסויים.

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים פרוטוקול עבור כיפוף תאים חיידקיים פילמנטיות מצורף מכסה משטח החלקה עם מלכודת אופטי למדידת קשיות כיפוף הסלולר.

מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

אנו מציגים שתי עצמאית, מיקרוסקופ מבוססי כלים למדידת דפורמציות גרעיני cytoskeletal המושרה, תאים בודדים חיים חסיד בתגובה לבקשה מאמץ עולמי או מקומי. טכניקות אלו משמשות כדי לקבוע קשיחות גרעיני (כלומר, deformability) וכן לחקור העברת כוח תאיים בין הגרעין לבין cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

המאפיינים המכאניים של glycocalyx אנדותל נמדדו על ידי כניסה באמצעות כדורים בגודל מיקרון על cantilevers AFM. תאי אנדותל בתרבית בתא מותאם אישית תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים לגרום ביטוי glycocalyx. נתונים נותחו באמצעות מודל סרט דק כדי לקבוע את העובי ומודולוס glycocalyx.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

מצעים עם נוקשות ב קילו פסקל-הטווח שימושיות ללמוד תגובת התאים נוקשות סביבת מיקרו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. שימוש רק מיקרוסקופ זריחה widefield, האלסטיות של ג'ל סיליקון רך יכול להיקבע באמצעות ההזחה עם כדור מתאים.

מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

חקר ההתנהגות התאית תחת לחץ מכני הוא חיוני להתקדמות במכניקה התאית ובמכנוביולוגיה. אנו מציגים את טכניקת Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA), שיטה חדשנית המשלבת גירוי מכני מבוקר עם ניתוח מקיף של איתות תוך תאי בתאים בודדים. טכניקה זו חוקרת מחקרים מעמיקים חדשים של מכנוביולוגיה של תאים חיים.

בדיקת שאיפת מיקרופיפטה פלואורסצנטית לחקר מכנוסנסינג של תאי דם אדומים

למדו שאיפת מיקרופיפטה למדידת נוקשות תאית בתאי אנדותל עורקיים. שיטה זו מאפשרת הערכת תכונות ויסקואלסטיות תאיות וחקר השפעת טיפולים שונים על מכניקה תאית ביולוגית.

שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

גלה סרטונים נוספים