שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

מטרת הניסוי הבא היא לנתח תכונות ויסקו-אלסטיות תאיות תחת תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. דבר זה מושג על ידי הפעלת לחץ שלילי על ממברנת התא באמצעות מיקרו-פיפט המחובר למתמר לחץ, שנבנה מקפילרות זכוכית באמצעות שובר מיקרו-פיפט. הפיפט מורכב על מיקרו-מניפולטור עדין הממוקם על במה של מיקרוסקופ הפוך, וקצה הפיפט מובא לסמיכות רבה לתא.

בשלב הבא, נוצר איטום בין קצה הפיפטה לממברנת התא, ולאחר מכן נמדדת עיוות הממברנה אל תוך הפיפטה בתגובה לצעד של לחץ שלילי המופעל על התא. התוצאות המתקבלות מראות את ההשפעות של טיפולים שונים על תכונות ביומכניות תאיות, בהתבסס על מידת עיוות הממברנה בתגובה לכוח מוגדר היטב. מטרת המעבדה שלנו היא לחקור את ההשפעה של דיסליפידמיה על תכונות ביופיזיות וביומכניות של תאי אנדותל כלי דם, והיום נציג בפניכם שיטה הנקראת micropipet aspiration המשמשת אותנו למדידת קשיחות תאים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על ההבנה הבסיסית של ביומכניקה תאית במנגנונים מרובים, כגון אנגיוגנזה, חישוש מכני, נדידה ועוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביומכניקה תאית, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון ממברנות מודל, אברונים תוך-תאיים או רקמות. כדי להדמיות את ממברנת התא ולצפות בבליטת הממברנה אל תוך הפיפטה, צובעים ממברנות של תאי אנדותל כלי דם בצבע פלואורסצנטי ליפופילי.

כדי להתחיל, דללו את צבע המלאי לריכוז עבודה באמצעות תמיסת PBS מחוממת; סונוקציה לתערובת למשך חמש דקות כדי לפרק את מקבצי ה-D. לאחר סבב של חמש דקות במיקרו-צנטריפוגה, הסירו את העליון; שטפו תאי אנדותל וסקולריים על ידי הוספת 0.5 milliliters של PBS. לאחר חמש דקות, שאבו את התמיסה והמשיכו בשתי שטיפות נוספות.

לאחר מכן, הוסף את תמיסת ה-dice לתאים והדגר למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההדגרה, שטוף שוב את התאים עם PBS כפי שבוצע קודם לכן. מיקרו-פיפטות מיוצרות על ידי חימום של קפילרה מזכוכית במרכזה.

כאשר הזכוכית מתחילה להמס, שני חצאי הנימים נמשכים זה מזה ליצירת שתי מיקרו-פיפטות. קצות הפיפטות המשמשות בניסויים אלו נעים בדרך כלל בין 2 ל-6 מיקרון בקוטר חיצוני, בהתאם לגודל התא; צורת הקצה צריכה להיות בקירוב של צינור גלילי לפני הכנסת ניב הזכוכית למכשיר משיכת הפיפטות.

בהדגמה זו, נעשה שימוש במכשיר למשיכת פיפטות אופקי מדגם Suter P 97 עם תוכנית מותאמת. מכשיר משיכה זה מציע אפשרויות תכנות מרובות לשינוי המהירות ופרמטרים אחרים של המשיכה. התקדמו להפעלת תוכנית המשיכה.

לאחר משיכת כל מיקרו-פיפט, יש לוודא את צורת החוד תחת המיקרוסקופ. לאחר ליטוש החוד באש, מלאו את המיקרו-פיפט בתמיסת סלין פיזיולוגית כגון PBS או במצע גידול שאינו פלואורסצנטי. חשוב לציין כי התמיסה צריכה להיות מועשרת ב-30% serum, מה שיאפשר לממברנת התא לנוע בצורה חלקה לתוך הפיפט. בהדגמה זו, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם יכולות דה-קונבולוציה תלת-ממדית (3D deconvolution), המחובר למצלמת וידאו ולמחשב, למתמר לחץ, לתחנה נטולת רעידות ולמיקרו-מניפולטור, כדי להתחיל להעביר תאים לתא שאיבה מיקרוסקופי על ידי הרמת התאים מהמצעים שלהם והעברתם באמצעות פיפטה לתא אורך רדוד המותקן על המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך.

הרציונל לשימוש בתא אורך רדוד הוא לאפשר למיקרו-פיפט לגשת לתאים בזווית רדודה מאוד, קרובה ככל האפשר לאופקית. זאת כדי לאפשר את הדמיון של הממברנה שנמשכה לתוך המיקרו-פיפט במישור מיקוד בודד. הכניסו מיקרו-פיפט מלא למחזיק פיפט המחובר למתמר כוח (power transducer) באמצעות צינור גמיש, שקוטרו מותאם למחבר של מחזיק הפיפט כדי להבטיח התאמה הדוקה.

בתחילת כל ניסוי, יש להשוות את הלחץ בפיפט ללחץ האטמוספרי, ולהרכיב את הפיפט על מיקרו-מניפולטור המאפשר בקרה מדויקת של תנועות הפיפט בטווח של מיקרונים. יש למקם את הפיפט בזווית רחבה ביחס לתחתית התא ולהביא את קצה הפיפט למרכז שדה הראייה. את גוף הפיפט (shank), שהוא החלק הגלילי של קצה הפיפט שבו נשאבת הממברנה, יש ליישר באופן אופקי למישור המוקד.

כדי להשיג את המיקום הראשון, הנח את הפיפטה בזווית השטוחה ביותר האפשרית ולאחר מכן כופף את גוף הפיפטה כנגד תחתית התא. מכיוון שגוף הפיפטה דק מאוד, הוא גמיש מספיק כדי להחליק על תחתית התא תוך כדי התקרבות לתא. הורד לאט את המיקרו-פיפטה אל צדו של תא בודד באמצעות המניפולטור הגס, עד להגעה לאזור מישור המיקוד של התא.

לאחר מכן, בעזרת המניפולטור העדין, העבירו את המיקרו-פיפט לקצה התא עד שקצה הפיפט נוגע בעדינות בממברנה. צלמו תמונה אחת כדי לבחון את מיקום הפיפט. אטמים טובים נוצרים כאשר כל קצה הפיפט נמצא במגע מלא עם פני השטח של התא והמגע יציב.

בשלב הבא, הפעל שלב של לחץ שלילי באמצעות המתמר ושמור עליו עד להתייצבות בליטת הממברנה. כמות הלחץ הדרושה לשאיבת הממברנה אל תוך הפיפטה משתנה בהתאם לסוג התא ולתנאים ניסויים ספציפיים. עיוות ראשוני נצפה בדרך כלל בעת הפעלת לחץ בטווח של מינוס 2 עד מינוס 15 millimeters of mercury.

עם הפעלת הלחץ, הממברנה מעוצבת בהדרגה לתוך הפ pipette עד להתייצבותה באורך מסוים. תהליך זה נמשך בדרך כלל שתיים עד שלוש דקות; במהלך זמן זה, יש לצלם תמונות של דפורמציית הממברנה בכל 30 שניות כדי לעקוב אחר התקדמות הממברנה שנמשכת לתוך ה-pipette. לבסוף, הגבירו את הלחץ לרמה הבאה בצעדים של 2 עד 5 mmHg.

חזור על הפרוצדורה כולה עד שהבליטה של הממברנה תתנתק מהתא ותיכנס לתוך הפיפטה, ובנקודה זו הניסוי ייעצר. כדי לכמת את מידת העיוות של הממברנה, נמדד אורך השאיבה מקצה הפיפטה ועד לשיא ההיקף של בליטת הממברנה. פיפטה גדולה יותר תפעיל כוח רב יותר על ממברנת התא באותה רמת לחץ, כדי להתחשב בשונות בין קטרי הפיפטות.

אורך השאיבה מנורמל לקוטר הפיפטה שנמדד עבור כל ניסוי כדי לתקף את השימוש בטכניקת מיקרו-שאיבה עבור תאים המחוברים למצע; בניסוי נבדק כי שיבוש של F actin מוביל לירידה בנוקשות התאים של תאי אנדותל מאורטות של בקר כפי שהוערכה בגישה זו. כאן מוצגת, כצפוי, סדרה טיפוסית של תמונות פלואורסצנטיות של ממברנה אנדותלית העוברת דפורמציה הדרגתית בתגובה ללחץ שלילי המופעל באמצעות מיקרו-פיפטה. הממברנה נשאבת בהדרגה אל תוך הפיפטה ואורך השאיבה עולה כפונקציה של הלחץ המופעל; סדרות זמן של הדפורמציה מראות כי שיבוש של f actin מגביר משמעותית את אורכי השאיבה של הבליטות תחת כל תנאי הלחץ.

באמצעות גישה זו, התגלה כי קשיחות התאים עולה כאשר ממברנות תאיות מרוקנות מקולסטרול, בעוד שהעשרה בקולסטרול לא השפיעה. כאן מוצגים תא עשיר בקולסטרול, תא בקרה ותא מרוקן מקולסטרול לאחר שהגיעו לאורכי שאיבה מקסימליים של 15- מילימטרים של כספית. הבליטות החלו להתפתח בדרך כלל ב-10- מילימטרים של כספית, וניתן היה למדוד את זמני הגרימה לעיוות הממברנה עבור לחצים שליליים של 10, 15 ו-20 מילימטרים של כספית.

כאן, אורכי השאיבה המקסימליים מוצגים כפונקציה של הלחץ המופעל. האורך הנורמלי המקסימלי בתאים מרוקנים היה נמוך באופן מובהק מזה של תאי הביקורת בלחצים של 15- millimeters of mercury ו-20- millimeters of mercury. הפעלת לחצים שליליים מעל 25 millimeters of mercury גרמה להיפרדות של הבליטה שנשאבה, שיצרה שלולית נפרדת.

רמת הלחץ שהובילה להיפרדות הממברנה הייתה דומה תחת תנאי כולסטרול שונים, ותצפית זו הייתה בלתי צפויה. שכן מחקרים קודמים מראים כי העלייה ברמת הכולסטרול בממברנה מגבירה את הקשיחות של השכבות הליפידיות הכפולות של הממברנה. ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בשלוש עד שתי שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסוי בטכניקה זו, חשוב לזכור כי ניסוי זה מבוצע על תאים בודדים.

לפיכך, יש לנתח בין שלושה לחמישה תאים לכל תנאי, לכל ניסוי, עבור סך כולל של שלושה ניסויים.