Name: Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: למדו קריוטיפינג ספקטרלי לזיהוי חריגות כרומוזומליות במודלים של אדם ועכבר עם מחלת כליות פוליציסטיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של שינויים מבניים ומספריים בכרומוזומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות בריאן Muntean, שאו הנה מאקי טקהאשי ובלייר מל לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (DK080640) ואת אוניברסיטת טולדו &amp; ProMedica פרס גירוי Translational מחקר של ד&quot;ר Surya נאולי.

1. התא טיפול מקדים והכנה metaphase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים גדלים שינוי של Dulbecco בינוני של הנשרים (DMEM) המכיל 10-15% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור, עד שהם מגיעים 70-80% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים עם פתרון colcemid ב 0.05 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הבינוני המכיל את כל התאים הצפים בתוך 50 מ&quot;ל צינורות סטריליים בז צנטריפוגות. שוטפים את התאים בצלחת עם sterile1X-PBS. לאחר דוגרים עם טריפסין סטרילי עבור 1-2 דקות, הקציר לאסוף את התאים הנותרים לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הצינורות ב 1000 סל&quot;ד במשך 5 דקות, לשאוב supernatant לעזוב 0.5 מ&quot;ל לשחרר גלולה ידי מצליף עם האצבע בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי בגודל גלולה, מוסיפים 5-10 מ&quot;ל של תמיסת KCl hypotonic של 0.56% ב DH 2 O ו דגירה ההשעיה על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של מתנול / חומצה אצטית(03:01 Vol / Vol) לכל מ&quot;ל של תרחיף תאים hypotonic והפוך את הצינור בעדינות לערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת בסל&quot;ד 1200 דקות 5 ולאסוף גלולה כצעד 1.4, ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל מתנול רעננה / חומצה אצטית (03:01 כרך / כרך א &#39;) dropwise הפתרון מקבע בעוד מצליף גלולה ברציפות. הליך זה הוא קריטי, כך מתפשט metaphase לא יהיה לכוד בתוך גושים של תאים אשר היה לסכן את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת שוב בסל&quot;ד 1200 5 דקות ומוסיפים 5-10 מ&quot;ל של מתנול קר כקרח / מקבע חומצה אצטית לאורך הקיר של הצינור. בשלב זה, אם יש צורך, התאים ניתן לאחסן את הפתרון מקבע בצינור להדק ונחתם ב -20 ° C לטווח קצר או -80 ° C לטווח ארוך (שנים) לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות נקיים באתנול מוחלטת, ואז לטבול שקופית 2 DH O עבור approximately10X על מנת ליצור מעטפת של מים על פני השטח של השקופית. מניחים את השקף על צלחת זכוכית ירידה של 15 20μl ההשעיה תא (משלב 1.8) מ 10 &quot;מעל השקופית. מניחים את שקף באמבט מים נקבע על 65-70 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופיות מתחת למיקרוסקופ אור באמצעות יעדים יבשים 10X ו 40X מוודא שיש הוא הכרומוזומים metaphase ו המרווחים הם מחולקת באופן שווה. לבדוק את קיומו הציטופלסמה סביב הכרומוזומים. אם הציטופלסמה היא להמשיך הנוכחי עם טיפול מקדים שקופיות (העיכול פפסין), אם הציטופלסמה לא קיים ואת הכרומוזומים יש מורפולוגיה טוב, אז אין צורך המקדים שקופיות. </li></ol> 2. Slide המקדים (טיפול עכלן) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 120 μl של פתרון RNase 1:200 (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מומס 2X-SSC על 24 מ&quot;מ coverglass מיקרוסקופ x 60 מ&quot;מ ו להפוך את פני השקופית metaphase על coverglass אז בעדינות ללא מרחב הפנים שקופיות metaphase מעלה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את coverglass מבלי לשרוט את השקופית ולשטוף במאגר 2X-SSC בצנצנת coplin כל 5 דקות במשך 15 דקותעם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5-15 μl של פתרון המניות עכלן (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב DH 2 O) לתוך מבחנה נקייה ולאחר מכן להוסיף 100 מ&quot;ל של prewarmed (37 ° C) 0.01M HCl. חשוב עכלן מתווסף לתוך נקי 1 כוס ולא ישירות פתרון ה-HCL, אחרת זה לא מתמוססים פתרון. דגירה שקופיות בצנצנת coplin המכיל את הפתרון HCl / עכלן על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. שלב זה הוא קריטי מאוד לעיכול יותר מדי יגרום הכרומוזומים להיות overdigested מדי לעיכול מעט יעזוב הציטופלסמה לא מעוכל אשר עשוי להוביל מחייב הלא ספציפית של החללית ולהפריע האות ההכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית בצנצנת המכילה 100 מ&quot;ל coplin 1X-PBS דקות 5 פעמיים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית בצנצנת המכילה 100 מ&quot;ל coplin 1X-PBS/MgCl 2 דקות 5 בטמפרטורת החדר (50 מ&quot;ל של 1M MgCl 2 ב 950 מ&quot;ל של 1X-PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקופית צנצנת coplin containinז 100 מ&quot;ל פורמלדהיד 1% עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (1.7 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37% ל -100 מ&quot;ל של 1X-PBS/MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית בצנצנת המכילה 100 מ&quot;ל coplin 1X-PBS דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב שקופיות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות עדשה יבש 40X כדי להבטיח את השקופיות מתעכל כראוי הציטופלסמה לא קיים ואת המורפולוגיה כרומוזום נשמר. בחר אזור הכלאה באמצעות עט היהלומים. </li></ol> 3. כרומוזום ו החללית denaturation ואת ההכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון denaturing טרי (70% formamide/2X SSC, pH 7.0) ו prewarm ל 70-80 מעלות צלזיוס בתוך צנצנת coplin ממוקם במקום אמבט מים שקופיות בצנצנת coplin המכיל את הפתרון denaturing באמבט מים 70 ° C על כרומוזומים העכבר ו -80 מעלות צלזיוס במשך הכרומוזומים אדם בשנות ה -30 דקות, 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקם את השקופית באתנול קפוא 70% עבור 3 דקות לאחר מכן 80% אתנול ו 100% עבור 3 דקות כל אחד ואוויר יבש. לבחון את השקופיתהמורפולוגיה של כרומוזום. מורפולוגיה כרומוזום טוב הוא כונה על ידי הכרומוזומים כהים ולא &quot;שלב האור&quot;, או הילה כרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את החללית SkyPaint (ערכת צבע השמים: בקבוקון # 1) על 37 מעלות צלזיוס עם רועדת על המערבולת 20 דק &#39;, ו צנטריפוגות בקצרה בסל&quot;ד 1000 למשך מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל בדיקה ב thermocycler מתוכנת עבור מחזור שני שלבים על 85 מעלות צלזיוס במשך מחזור 5 דקות לאחר מכן 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות כדי לאפשר בדיקה שכותרתו-DNA של preannealing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10μl של החללית מפוגל על ​​שטח של הכלאה ומכסים 22 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ coverglass לוודא שלא ללכוד בועות אוויר. סוגרים את הקצוות של coverglass במלט גומי דגירה בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות. </li></ol> 4. בדיקה לגילוי פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverglass בזהירות ומניחים את השקופית בצנצנת coplin המכיל prewarmed (45 ° C) כביסה פתרון אני (לפוראמיד 50% מוכן טרי 2X SSC). לשטוף 5 דקותשלוש פעמים ב 45 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד בסל&quot;ד 45 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שקופית כביסה הפתרון השני (1X SSC) על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות פעמיים עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שקופית כביסה פתרון III (% 4X SSC/0.1 Tween 20) 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 80 μl של ריאגנט חוסם (ערכת צבע השמים: בקבוקון # 2), במקום coverslip ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השקופית ולאפשר נוזל לנקז. החל 80 μl של מגיב Cy5 מכתים (מרוכז זיהוי נוגדן CAD הערכה: בקבוקון # 3), להחיל coverglass ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית עם הכביסה הפתרון השלישי על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות שלוש פעמים עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 80 μl של מגיב Cy5.5 מכתים (מרוכז זיהוי נוגדן CAD הערכה: בקבוקון מס &#39;4), במקום coverglass ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית עם הכביסה הפתרון השלישי על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות שלוש פעמים עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את השקופית ולאפשר נוזלים<html> לנקז. החל 20 μl של מגיב DAPI נגד דהייה (ערכת צבע השמים: בקבוקון # 5) ומקום 24 מ&quot;מ coverglass מיקרוסקופ x 60 מ&quot;מ. מוציאים בזהירות את בועות אוויר שאולי נוצרו. שקופיות ניתן הדמיה באופן מיידי או לשמור על 4 מעלות צלזיוס בחושך לא יותר משבוע 1. </li></ol> 5. תמונה הרכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת התמונה נעשית על ידי הצגת שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס מצוידת בעדשה טבילה 60x שמן, קוביית ספקטרלית (אישית מעוצבת משולשת לעבור הלהקה מסנן), מסנן DAPI ואת מודול interferometer sagnac עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקטרליים למוצרי Karyotypes בוצעו באמצעות Sky View תוכנה (יישומי דימות ספקטרלי גרסה 1.62), לאחר ידנית של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוח התמונות, הכרומוזומים ניתן לראות תמונות צבע (עם צבעי ניאון ספציפיים), תמונות צבע פסאודו (עם צבעים לסיווג) ו הפוכים תמונות DAPI (דפוס רצועות ספציפי). </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. נציג תוצאות הליך SKY מלאה בדרך כלל לוקח בערך פעם בשבוע (איור 1). זה כולל רכישת התמונה וניתוח ובלבד התאים metaphase נמצאים אספקה ​​נאותה. ניתוח Karyotyping מגלה קריוטיפ עכבר רגיל (40, XY) של תאים מעכברים סוג בר (איור 2 א). לעומת זאת, תאים Pkd1 - / - עכבר (מודל PKD העכבר) מראה גידול משמעותי במספר הכרומוזומים וכן מומים מבניים, כגון מחיקות כרומוזומים (כרומוזום מס &#39;8) ו (טרנסלוקציות # כרומוזומים 11 ו 19) (איור 2b). אנחנו גם ניתח רקמות כלי דם מן החולים ADPKD. מחקר שנערך על ידי פשוט לספור את מספר הכרומוזומים ציינו כי לא ADPKD וכמה דוגמאות כלי הדם ADPKD היו מספרים כרומוזומליות נורמליות של 23 זוגות (איור 2 ג). באופן כללי, עם זאת, צפינו כישלון של הפרדה כרומוזומלית, וכתוצאה מכך 46 זוגות של כרומוזומים בדגימות DPKD במקום 23 זוגות (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים זרימה SKY פרוטוקול. תרשים זרימה של פרוטוקול SKY מדגים צעדים כדי להשלים את הניסוי החל טיפול מקדים התא ההכנות metaphase לרכישת התמונה וניתוח. ציר הזמן המשוער של שבוע מוצג בצד שמאל עם צעד אחר צעד את התהליכים עבור כל יום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> איור 2. Karyotyping רפאים הנציח על שורות תאים של העכבר או מבודדים טרי תאים ראשוניים אדם. צבע ותמונות DAPI כפולות של כרומוזומים בודדים מוצגים לפני מיון כרומוזומלית. לאחר מיון, הכרומוזומים מופיעים בטבלה &quot;סיווג&quot;. תמונה) השמיים של התפשטות metaphase של העכבר סוג בטבע מכיל קריוטיפ תקין (40, XY). ב) </strong&gt; SKY תמונה של התפשטות metaphase Pkd1 מ - / -. העכבר מראה מספר כרומוזומים לא תקין (68 במקום 40) וכן מומים כרומוזום כגון מחיקות כרומוזומים (כרומוזום מס &#39;8) ו translocations כרומוזום (כרומוזומים 11 ו - # 19) ג) SKY תמונה של התפשטות metaphase מרקמת הדם של החולה לא ADPKD יש קריוטיפ תקין (46, XX). ד) תמונת השמיים של התפשטות metaphase מרקמת הדם של החולה ADPKD מכיל קריוטיפ תקין (92, XXXX). חלקים של הנתונים דווחו קודם לכן ולעשות בהם שימוש חוזר ברשות 14.

<ol><li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li>
<li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li>
<li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+of+human%2C+mouse%2C+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).</li>
<li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li>
<li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li>
<li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics+and+Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li>
<li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li>
<li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRied%2C+T+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22">Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany)</a>. 75, 801-814 (1997).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li>
<li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li>
<li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה cytogenetics השתמשו בלימוד יצירות גנומית כרומוזומלית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, ואת גילוי של בדיקות אלה נרכשים דרך interferometer sagnac. תהליך SKY מלאה בדרך כלל לוקח בערך שבוע, והיא כוללת מספר שלבים עיקריים (איור 1). SKY משתמשת בפרוטוקול סטנדרטי, אשר תואר לראשונה על ידי פדייה, נאש ואח&#39; 3. פרוטוקול מאז מותאם על ידי מעבדות cytogenetics שונים, כולל שלנו. <p class="jove_content" style=";te...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech בע&quot;מ </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> העובר שור בסרום (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / סטרפטומיצין </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HCl </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> צבע SKY ערכת בדיקה (האדם) </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> צבע SKY ערכת בדיקה (עכבר) </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים מרוכזת איתור ערכת </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> עכלן </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ml </td><td></td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> Mallinckrodt בייקר </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> להכין ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ 24x60mm </td><td> VWR Vista חזון </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> גומי מלט </td><td> אלמר של (הפצה מסחרית מקומית) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ההכלאה / humidifiedchamber / מגש </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> לשים מגבות נייר רטובות בתחתית </td></tr><tr><td> ThermoCycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> רועד פלטפורמה / Orbital שאכר </td><td> Bellco ביוטכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אמבטיה / מים רועדת </td><td> דיוק מדעי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI קוביית המסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY קוביית המסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Spectral Imaging יישומית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תא הפוכה תרבות מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> Nikon TS100 Eclipse </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> אולימפוס </td><td> IX70 </td><td> 60x שמן </td></tr></tbody></table>

karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

השיטה המקובלת לזהות ולסווג כרומוזומים בודדים תלוי בדגם פסים ייחודי של כל כרומוזום בעוד כמה מינים ספציפיים שאנו מנתחים 1, 2. זו טכניקה קלאסית פסים, לעומת זאת, אינה אמינה בזיהוי סטיות כרומוזומליות מורכבים, כגון אלה הקשורים בסרטן. כדי להתגבר על המגבלות של טכניקה פסים, Karyotyping ספקטרלית (SKY) הוא הציג לספק מידע אמין יותר על אי תקינות הכרומוזומים. SKY היא הקרינה ססגוניות in-situ הכלאה (דגים) טכניקה לזהות כרומוזומים metaphase עם מיקרוסקופ רפאים 3, 4. SKY הוכח להיות כלי רב ערך לניתוח cytogenetic של מגוון רחב של מומים כרומוזום הקשורים למספר רב של מחלות גנטיות ומחלות ממאירות 5, 6. SKY כרוכה בשימוש של בדיקות ה-DNA ססגוניות fluorescently שכותרתו שהוכנו oligonucle מנוונתprimers otide על ידי PCR. לכן, כל כרומוזום יש צבע ייחודי רפאים לאחר ההכלאה in-situ עם בדיקות, אשר שכותרתו דיפרנציאלי בתערובת של צבעי ניאון (Rhodamine, טקסס רד, Cy5, FITC ו Cy5.5). בדיקות המשמשות SKY מורכב של עד 55 בדיקות ספציפיות כרומוזום 7-10. הליך SKY כרוכה במספר שלבים (איור 1). SKY דורש זמינות של תאים עם מדד mitotic גבוהה מן הרקמות או חולה או דם. הכרומוזומים של תא בודד מתא בודד או העיקרי טרי או שורת תאים מפוזרים על שקופיות זכוכית. התפשטות זו כרומוזום מסומן עם שילוב שונה של צבעי ניאון ספציפיים עבור כל כרומוזום. בדיקה לאיתור ורכישת תמונה, מערכת דימות ספקטרלי מורכב interferometer sagnac ומצלמת CCD. זה מאפשר מדידה של ספקטרום האור הנראה הנפלט המדגם לרכוש תמונת רפאים הלוך ושובמ כרומוזומים בודדים. HiSKY, תוכנה להשתמש כדי לנתח את התוצאות של תמונות שנתפסו, מספק זיהוי קל של אנומליות כרומוזום. התוצאה הסופית היא metaphase ו סיווג קריוטיפ התמונה, שבה כל זוג כרומוזומים יש צבע מיוחד (איור 2). זה מאפשר זיהוי קל של זהויות כרומוזום translocations. לפרטים נוספים, בקר באתר יישומי הדמיה ספקטרלית ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY שימש לאחרונה לזיהוי ההפרדה פגמים כרומוזום הפרעות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), מחלה גנטית המאופיינת בתפקוד ב cilia העיקרי 11-13. באמצעות טכניקה זו, הפגנו נוכחות של הפרדה כרומוזום נורמלי פגמים כרומוזומליים בחולים ADPKD ומודלים עכבר 14. ניתוחים נוספים באמצעות SKY לא רק מאפשר לנו לזהות את מספר הזהות ואת כרומוזומליות, אלא גם כדי לזהות במדויק סטיות כרומוזומליות מורכבים מאוד כגון מחיקות כרומוזום טרנסלוקציות (איור 2).

Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה מתקדמת cytogenetics לזהות סטיות כרומוזומליות גנומית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, המאפשרים סיווג של כרומוזומים כל. SKY יכול גם לזהות סטיות כרומוזום מורכבים ופגמים הפרדה בעכברים ובבני אדם עם מחלות שונות, לרבות מחלת כליות פוליציסטיות.

Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

השיטה המקובלת לזיהוי וסיווג של כרומוזומים בודדים נשענת על כך שתבנית הפסים הייחודית של כל כרומוזום במין מסוים היא...

מטרת פרוצדורה זו היא לסמן כרומוזומים באמצעות פרוbes צובעים (paint probes) על מנת לזהות אבנורמליות כרומוזומליות ופגמים בסגריגציה בעכברים ובבני אדם עם מחלת הכליות הפוליקיסטית. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף תאים מבני אדם או עכברים וטיפול ב-smid, ולאחר מכן קיבוע והכנה של פריסות מטאפאזה על סליידים של זכוכית. לאחר מכן, הסלייד עובר טיפול מקדים להסרת RNA וציטופלזמה עודפים שעלולים להפריע להיברידיזציה.תהליך זה מבוצע באמצעות עיכול עם RNAse ופפסין, בהתאמה. לאחר מכן מבצעים דנטורציה של הכרומוזומים והגשושית (probe), ולאחריה היברידיזציה לסימון הכרומוזומים. השלב הסופי הוא זיהוי הגשושית באמצעות צבעים פלואורסצנטיים.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות חריגות במספר הכרומוזומים ובמבנהם באמצעות פלואורסצנציה, מיקרוסקופיה, ולכידה וניתוח תמונות באמצעות תוכנת Skyview. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טכניקות כיפוף קלאסיות של GIMs, הוא שהיא מספקת מידע נוסף על חריגות כרומוזומליות מורכבות, כגון טרנסלוקציות כרומוזומליות וסידורים מחדש מורכבים של כרומוזומים, שלא ניתן לאפיין באמצעות טכניקות כיפוף קלאסיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של מחלת הכליות הפוליציסטית, כגון המנגנון של היווצרות כיסטות בכליות.ד"ר ויאם אבו תדגים את הפרוצדורה, בעזרתו של פוסט-דוקטור בכיר ומוכשר מהמעבדה שלנו. יש לגדל תאי אנדותל ב-DMEM המכיל 10 עד 15% fetal bovine serum ו-1% penicillin streptomycin בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide עד שהתאים מגיעים ל-70 עד 80% confluence. לאחר מכן, יש לטפל בתאים בפתרון Cole בריכוז סופי של 0.05 mg/mL למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C לפני האיסוף. כדי לאסוף את התאים, יש לאסוף תחילה את המצע המכיל תאים צפים לשפופרות צנטריפוגה סטריליות של 50 mL.שטפו את התאים בצלחית פעם אחת ב-PBS סטרילי לאחר דגירה עם trips סטרילי למשך דקה עד שתיים, קצרו ואספו את התאים שנותרו לאותה מבחנה. לאחר השקעת התאים על ידי סבוב ב-1000 rotations per minute למשך חמש דקות, שאבו את רוב הנוזל מהמבחנה והשאירו כ-0.5 milliliters מעל המשקע. שחררו את משקע התאים על ידי נקישה על המבחנה.בשלב הבא, בהתאם לגודל המשקע, הוסיפו 5 עד 10 milliliters של תמיסה היפרטונית של 0.56% potassium chloride במים מזוקקים והדגירו את התמיה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 עד 45 דקות. לאחר ההדגרה, השתמשו בפיפט קטן של one milliliter כדי להוסיף טיפה אחת של תמיסת קיבוע קרה מהקרח לכל one milliliter של תמיחת תאים היפרטונית. לאחר מכן, הפכו את המבחנה בעדינות כדי לערבב, לאחר צנטריפוגציה של התאים למשך חמש דקות במהירות של 1,200 rotations per minute.שאבו את הנוזל העליון כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, הוסיפו באיטיות 1 mL של תמיסת קיבוע טרייה תוך כדי ניעור עדין של המשקע. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 4 mL נוספים של תמיסת קיבוע לדופן המבחנה.נוהל זה קריטי כדי להבטיח שפריסות המטפאזה לא יילכדו בתוך גושי תאים. לאחר חזרה על שלב הצנטריפוגציה ושאיבת הנוזל העליון (supernatant), החליפו את ה-5 עד 10 מיליליטר של המקבע על ידי טפטוף איטי של המקבע לאורך דפנות המבחנה. בשלב זה, ניתן לאחסן את התאים במבחנה מהודקת ואטומה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר, או בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך, עד למועד המשך הפרוצדורה.כאשר תהיו מוכנים להמשיך, בדקו את מספר כרומוזומי המטפאזה בהכנת התאים. נקו את הזריקה באתנול מוחלט. לאחר מכן, טבלו את הזריקה במים מזוקקים כ-10 פעמים כדי ליצור מעטפת מים על פני השטח של הזריקה, הניחו את הזריקה על לוח זכוכית וטפטפו 15 עד 20 µL של תמיחת תאים מגובה של כ-10 אינץ' מעל הזריקה.הנח את השקופית באמבט מים שחומם ל-65 עד 70 °C למשך דקה אחת עד שתיים והמתן לייבוש. בדוק את השקופית תחת מיקרוסקופ אור באמצעות עדשות יבשות בהגדלה של 10 ו-40. ודא כי קיימים כרומוזומי מטאפאזה וכי הפריסות מפוזרות באופן אחיד. בדוק את הציטופלזמה המקיפה את הכרומוזומים.אם נוכחת ציטופלזמה כפי שניתן לראות כאן, המשיכו לקדם-טיפול של השקופית. אם לא נוכחת ציטופלזמה ולכרומוזומים מורפולוגיה תקינה, אין צורך בקדם-טיפול של השקופית ב-120 µL של תמיסת RNA בריכוז 20 mg/mL שהוכנה טרי בדילול של 1:200 המומסת ב-2X SSC על זכוכית כיסוי בגודל 24 mm על 60 mm.הפוך את שקף המטאפאזה כך שפניו יהיו כלפי מטה על זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, הפוך בעדינות את שקף המטאפאזה כך שפניו יהיו כלפי מעלה. הנח את השקף בתוך תא לח, הדגר אותו בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות.עם סיום זמן האינקובציה, הסר בזהירות את זכוכית הכיסוי מבלי לשרוט את הפיתח, ושטוף פעמיים בבופר SSC בתוך כלי שטיפה, שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם תוך כדי ניעור. במקביל, הוסף לביקר נקי 5 עד 15 µL של 100 mg/mL pepin במים מזוקקים, ולאחר מכן הוסף 100 mL של 0.01 M חומצה כלורית שחוממה מראש ל-37 °C. חשוב להוסיף את ה-PEPs לביקר הנקי תחילה, אחרת הם לא ימוסו.העבירו תמיסה זו לצנצנת Coplan. דגרו את שקופית השטיפה בצנצנת הצימוד בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לא יותר משלוש עד חמש דקות לאחר העיכול. שטפו את השקופית פעמיים בצנצנת Copin המכילה 1X PBS למשך חמש דקות בכל פעם תוך써 ניעור.לאחר מכן, בצעו שטיפה של חמש דקות בתוך כלי Copin המכיל PBS מועשר במגנזיום כלוריד. לאחר מכן, בצעו דגירה של 10 דקות בתוך כלי Copin המכיל 1% formaldehyde, ואחריה שטיפה סופית בתוך כלי Copin המכיל 1X PBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, דהידרטציה של השקופיות בכלי Copin המכילים סדרה של אתנול בריכוזים של 70%, 80% ו-100% למשך שתי דקות בכל ריכוז, ולאחר מכן ייבוש באוויר.בחנו את השקופית תחת מיקרוסקופ אור באמצעות עדשה יבשה בעוצמה של 40 פעמים, כדי לוודא שהשקופיות עברו עיכול תקין, שאין נוכחות של ציטופלזמה ושמורפולוגיית הכרומוזומים נשמרה. לבסוף, בחרו אזור להיברידיזציה באמצעות עט יהלום. לאחר הכנה טרייה של תמיסת הדה-נטורציה, העבירו אותה לכלי Copin וחממו אותה מראש ל-70 °C במקלחית.לאחר מכן, הנח את הזריקה בתוך צנצנת קוצ'ין (cochin jar) המכילה את תמיסת הדנטורציה שחוממה מראש במקבץ מים בטמפרטורה של 70 °C למשך 30 שניות עד דקה אחת. מיד לאחר הדגירה, העבר את הזריקה לאתנול 70% קר מאוד למשך שלוש דקות, לאחר מכן לאתנול 80% ולאתנול 100% למשך שלוש דקות כל אחד, ובסוף ייבש באוויר. בחן את הזריקה כדי לבחון את מורפולוגיית הכרומוזומים, תוך חיפוש כרומוזומים כהים שאינם נראים בהירים או מבריקים.מציין כרומוזום או מורפולוגיה תקינים. חמם את ה-sky paint. דגור ב-37 degrees Celsius עם ניעור למשך 20 דקות.לאחר מכן, ערבבו במיקסר Vortex וסבבו סבב קצר בצנטריפוגה במהירות של 1000 סל"ד למשך דקות. דנאטורו את הגשש (probe) בתרמוסייקלר בטמפרטורה של 85 °C למשך חמש דקות, ולאחריה דגירה בטמפרטורה של 37 °C. למשך שעה אחת, מרחו 10 µL מהגשש שעבר דנטורציה על אזור ההיברידיזציה וכסו בזכוכית כיסוי בגודל 22 mm על 40 mm.יש לוודא שלא נלכדו בועות אוויר, לאטום את שולי הזכוכיתית בעזרת דבק גומי, ולאחר מכן להדגיר בתא לח לפני 37 °C למשך 48 עד 72 שעות. יש להסיר את הזכוכיתית בזהירות ולהניח את השקף בכלי צימוד המכיל תמיסת שטיפה שהוכנה טרי, אשר חוממה מראש ל-45 °C. יש לשטוף במשך חמש דקות, שלוש פעמים ב-45 °C, במקלח רטט במהירות של 45 סל"ד.לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים בתמיסת שטיפה שתיים בטמפרטורה של 45 °C למשך חמש דקות בכל פעם בליווי ניעור, ולאחריהן חמש דקות בתמיסת שטיפה שלוש בטמפרטורה של 45 °C עם ניעור. לאחר מכן, מרחו 80 µL של רכיב חסימה (blocking reagent). לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי והד기로 באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.הסיר את זכוכית הכיס ואפשר לנוזל להתנקז. הוסף 80 µL של סביבת צביעה sci-fi. הנח זכוכית כיס והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 דקות. לאחר ההדגרה, שטוף את השקופית עם תמיסת שטיפה 3 בטמפרטורה של 45 °C למשך חמש דקות, שלוש פעמים, תוך כדי ניעור.בשלב הבא, מרקו 80 µL של תמיסת צביעה PS 5.5. הניחו זכוכית כיסוי והדגירו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 דקות. לאחר האינקובציה, שטפו שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה 3 כפי שבוצע קודם לכן. לבסוף, הטו את השקופית ואפשרו לנוזל להתנקז.יש להוסיף 20 µL של ריאגנט Antifa dappy ולהניח בזהירות זכוכית כיסוי במידות של 24 מ"מ על 60 מ"מ על גבי המיקרוסקופ. יש להסיר בועות אוויר שייתכן שנוצרו. ניתן לדגום את השקופיות מיד או לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך תקופה שאינה עולה על שבוע אחד. תמונת מיקרוסקופ זו של פריסת מטאפזה נורמלית מעכבר מסוג wild type צולמה באמצעות מיקרוסקופ Olympus המצויד בעדשת שמן בהגדלה של 60x.מסנן חסימה משולש (triple band pass filter) בעיצוב מותאם, המכונה קובייה ספקטרלית (spectral cube), מסנן dappy ומודול אינטרפרומטר sac עם מצלמת CCD. קריוטיפים ספקטרליים בוצעו באמצעות תוכנת skyview. הפאנל השמאלי העליון מציג את פריסת המטפאזה המסומנת, והפאנל הימני העליון מציג תמונת שדה בהיר (brightfield) של הפריסה.הפאנל התחתון מציג את הכרומוזומים מסודרים בסדר עולה באמצעות תוכנת skyview. תמונת sky זו של פריסת מטאפאזה מעכבר knockout הומוזיגוטי ל-pkd 1 מראה מספר כרומוזומים חריג, כאשר נוכחים 68 כרומוזומים במקום 40. כמו כן נראות הפרעות כרומוזומליות כגון מחיקה של כרומוזום שמונה, או טרנסלוקציות, כגון אלו שבין כרומוזומים 5 ו-16, וכן בין כרומוזומים 11 ו-19.תמונת SKY זו של פריסת מטאפאזה של כרומוזומים אנושיים מרקמה וסקולרית של מטופל שאינו סובל מ-A-D-P-K-D, מראה קריוטיפ נקבי תקין של 44 אוטוזומים ושני כרומוזומי XXX. תמונת SKY סופית זו מציגה פריסת מטאפאזה מרקמה וסקולרית של מטופל עם A-D-P-K-D בעל קריוטיפ חריג של 88 אוטוזומים וארבעה כרומוזומי מין XXXX. מאסטר אחד.ניתן לבצע טכניקה זו בחמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

מתואר השימוש ב-MRI שדה גבוה במיוחד כדרך לא פולשנית להשגת מידע פנוטיפי של מודלים של מכרסמים למחלת כליות פוליציסטית ולניטור התערבויות. בהשוואה לגישה ההיסטולוגית המסורתית, ניתן לרכוש תמונות MRI in vivo, מה שמאפשר מעקב אורכי.

שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור phenotyping ותרופות

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

פרוטוקול זה מדגים אולטרסאונד רובוטי (ארה"ב) כחלופה מעשית, חסכונית ומהירה לשיטות תמונה מסורתיות לא פולשניות.

שימוש באולטרסאונד רובוטי 3D לניתוח In Vivo של כליות עכבר

אנו מתארים טכניקה שבה קטע של אב העורקים בבטן מעכבר הושתל orthotopically ממש מתחת לעורקי הכליה בנמען אלוגנאית או syngeneic. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במחקרים בם השתלה של עורקים גדולים של גודל אחיד נחשבת יתרון.

השתלת אב עורקים בעכברי orthotopic לחקר מחלת כלי דם

למדו קריוטיפינג ספקטרלי לזיהוי חריגות כרומוזומליות במודלים של אדם ועכבר עם מחלת כליות פוליציסטיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של שינויים מבניים ומספריים בכרומוזומים.

Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

גלה סרטונים נוספים