טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות
22 במרץ 2012
המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.
סרטון זה מתאר פרוצדורה למעקב אחר אירועי איתות של קולטן תאי T באמצעות רכישה סימולטנית בערוץ כפול. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית כוללת (TIRF) או מיקרוסקופיית turf; ראשית, תאי T מעוברי טרנספקציה עם פלסמיד המקודד ל-ZAP 70 תגית GFP. מוכנה שכבה ליפידית דו-שכבתית נתמכת בזכוכית, המשלבת קומפלקסים של MHC עם פפטידים מעוגנים לליפידים, מולקולות היצמדות ומולקולות קו-סטימולטוריות.
תאי T שעברו טרנספקציה של ZAP 70 מתווספים לשכבה הכפולה כאשר קולטני תאי ה-T נקשרים למתחמי MHC פפטידיים. שרשראות ה-CD3 המשויכות לקולטן תאי ה-T עוברות פוספורילציה על ידי הקינז LCK ממשפחת SARC, והקינז zap 70 מגויס מהציטופלזמה. לאחר מכן, קולטן תאי ה-T מסומן פלואורסצנטית ומבוצע דימוי שבו התאים טבולים במצע בעל מקדם שבירה נמוך יותר מזכוכית הכיסוי, ומוארים על ידי קרן לייזר בזווית המעבירה השתקפות פנימית מלאה.
פעולה זו יוצרת גל נעלם (evanescent wave) בממשק שבין הזכוכית למים, אשר דעיכתו היא אקספוננציאלית לתוך התווך, ובכך היא מאפשרת עומק חדירה של 100 עד 200 ננומטרים. לפיכך, רק פלואורופורים הנמצאים בממברנה הפלזמית או קרוב מאוד אליה יעוררו. ניתוח של התמונות שהתקבלו חושף כי האיתות מתרחש במיקרו-צבירים של קולטן תאי T.
היתרון המרכזי של מיקרוסקופיית TIRF או מיקרוסקופיית קונפוקלית קונבנציונלית הוא קבלת רזולוציה טובה יותר, המאפשרת ויזואליזציה קלה של מקבצי סיגנלינג או קומפלקסים של סיגנלינג, כגון micro clusters של TCR. טראוויס קרייטס וצ'ן, שני פוסט-דוקטורנטים במעבדה שלי, ידגימו כיצד לבצע טרנספקציה של תאי T ראשוניים מעכבר באמצעות טכנולוגיית maxi nucleofection, ולאחר מכן לדגם אותם באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF M) שעבר סטימולציה באמצעות שכבה ליפידית של glass-supported lipid bilayer המכילה אנטיגן.
שיטה זו שימשה באופן נרחב לחקר השרטרים בתאי חיסון שונים, כולל תאי T, תאי B, תאי NK (הורגים טבעיים) ותאי מאסט. השיטה היא רב-גמישית וניתנת ליישום לחקר מרבית מערכות הרצפטורים בתאי יונקים, במיוחד כאשר השרטור מתרחש באשכולות. אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים בתחילה, מכיוון שתאי T קשים מאוד לטרנספקציה.
בנוסף, נדרשת תיאום מדויק כדי להבטיח שחיוניות תאי T ויעילות הטרנספקציה, איכות הבילר וכיול המיקרוסקופ יהיו ברמה הרצויה. השלב הראשון של הליך זה הוא טרנספקציה של תאי T ראשוניים, נאיביים או כאלה שהופעלו in vitro, עם פלסמידי ביטוי ומולקולות סיגנלינג מקודדות המסומנות ב-GFP, באמצעות ערכת AM maxa mouse T-cell nucleo effector. כל תאי ה-T ששימשו במחקר זה ביטאו את ה-A-N-D-T-C-R המזהה את הפפטיד MCC הנמצא על מולקולת ה-MHC IE של K. הליך הטרנספקציה המוצג כאן מבוצע בהתאם להמלצות היצרן.
עם זאת, מוצגים מספר טיפים לקידום החיוניות של תאי ה-T לאחר הטרנספקציה. הן החיוניות והן יעילות הטרנספקציה גבוהות יותר בתאי T שהופעלו in vitro מאשר בתאים נאיביים, ועל כן פרוטוקול זה משתמש בתאי T שהופעלו in vitro לפני התחלת העבודה. הכינו שני מיליליטר של מצע תאי T מועשר עבור כל טרנספקציה, על ידי ערבוב של 1.9 מיליליטר מצע המסופק בערכה, 20 µL מרכיב A, 20 µL מרכיב B, ו-100 µL של סרום עגל עוברי (fetal bovine serum) במבחנה של שני מיליליטר.
העבירו שני מיליליטרים של מצע לכל באר בלוח בעל 12 בארות. הניחו את הלוח באינקובטור לחה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר למצע להגיע לשיווי משקל; מות תאים יתרחש כתוצאה מרסוספנזיה של תאים שעברו טרנספקציה במצע קר או במצע שאינו ב-pH של 7.2. להכנת תערובת הטרנספקציה, ערבבו 82 µL של תמיסת NucleoEffector לתאי T של עכבר עם 18 µL של Supplement 2 וחמישה µg של DNA פלסמידי נקי מאנדוטוקסינים בריכוז שאינו נמוך מ-0.5 µg/µL, וערבבו היטב באמצעות הקשה.
העבירו חמישה עד 10 מיליון תאים לפ menutupבובת צנטריפוגה של 15 מיליליטר, וסובבו בצנטריפוגה ב-75 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השתמשו בשואב ואקום כדי להסיר כמה שיותר מהעלה (supernatant) כדי להשעות מחדש את משקע התאים בתערובת הטרנספקציה, ושאבו בעדינות ובאיטיות את משקע התאים שלושה עד ארבעה פעמים עד שלא יישארו גושים גדולים של תאים. בעזרת פיפטה, העבירו בזהירות את התשייה לתוך amaxa vete מאושר, תוך וידוא שאין בובות.
הגדירו את תוכנית ה-nuclear effector מסוג qve select X 0 0 1 במכשיר ה-nucleo effector. הכניסו את ה-vete למחזיק ה-Q vete ולחצו על הכפתור כדי להפעיל את התוכנית שנבחרה. לאחר מכן, העבירו מיד את ה-vete ואת מצע התרבית שעבר שיווי משקל מוקדם למ这篇文章 למכסה (hood).
באמצעות הפ pipette פלסטיק המסופקת, הוסף כ-500 microliters של המצע שעבר שיווי משקל למבחנה. לאחר מכן, הוסף את תרחיף התאים למצע בצלחת. בטיפות בודדות.
דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות כדי לאפשר ביטוי ברמה נמוכה של החלבונים המסומנים ב-GFP ולהפחית למינימום את הופעת ארטיפקטים הנובעים מביטוי יתר. בחלק זה מתוארת שיטה ליישור המיקרוסקופ עבור דימוי סימולטני בשני ערוצים, לפני הפעלת כל רכיבי המיקרוסקופ. הפעילו את המחשב ואת התוכנה.
לאחר מכן, ודאו שכל רכיבי החומרה מזוהים על ידי התוכנה. מכיוון שהתוכנה נפתחת ללא הודעות שגיאה, כל הרכיבים זוהו. דללו מיקרוליטר אחד של תמיסת ה-sub resolution.
הוסף את המיקרוספירות הפלואורסצנטיות הרב-צבעיות של Flores לשני מיליליטר של PBS לשימוש כסטנדרט לקולוקליזציה. לאחר מכן, הוסף 0.25 מיליליטר מתיתהול המיקרוספירות לכל באער של מערכת זכוכית כיסוי עם שמונה תאים של lab tech. הנח את מערכת שקופית התאים על הפלטפורמה מעל העדשה.
לאחר מכן, התאם את המיקוד של חרוזי הספיגה על הזכוכית בתצוגה המקדימה בזמן אמת. החלונית השמאלית מציגה את הערוץ שבו יהיו נראים תאים שעברו טרנספקציית GFP. החלונית הימנית תציג TCR מסומן במהלך ניסויי דימות של תאים חיים.
בעזרת כיוון ה-Y של ה-XY, Z fiber launch, כווננו את מיקום קרן הלייזר כך שהקרן תצא מהעדשה ותוקרן על התקרה. חשוב לבצע זאת כאשר העדשה נמצאת במיקום שבו מישור הזכוכית נמצא במוקד (focus). אם הקרן על התקרה מפוזרת, סימן שהקרן אינה מקבילה (collated).
כווננו את מיקרומטר ה-Z כדי להשיג קולמציה מלאה של בדיקת הקולמציה עבור כל אחד מקווי הלייזר שבהם ייעשה שימוש בניסוי. לאחר מכן, באמצעות מד הספק לייזר, כווננו את הספק הלייזר ל-20 עד 30 micro watts עבור כל ערוץ. תאי T רגישים ביותר לקרינת לייזר וההארה מוגבלת לסך כולל משולב של 50 micro watts.
בשלב הבא נגדיר את הזווית עבור ה-turf. סובב את מיקרומטר יישור ציר Y בבקר שיגור הסיב האופטי כדי להרחיק את קרן האור מהתקרה, עד שהזווית של הציר האופטי ביחס לעדשות העצם תתקרב ל-90 מעלות.
ברגע שזווית הקריטית להחזרה פנימית מלאה הושגה, אור הלייזר לא יצא עוד מהעדשה. כדי להעריך אם הושגה התאמה של ה"דשא" (turf alignment), התמקדו מעלה ומטה דרך מישור זכוכית הכיסוי. שימו לב כי כאשר החריזים שנספגו על פני השטח יוצאים מהמיקוד, ניתן לראות חריזים רבים צפים בתמיסה. כדי להשיג התאמת דשא טובה, יש להגדיל את זווית הקרן ביחס לעדשה.
ככל שזווית הקרן גדלה, חרו지를 שצפים סמוך לפני השטח מתחילים להיעלם, ועוצמתם של החרוזים שנספחו לממשק עולה. כעת, כאשר החרוזים שנספחו לממשק מוצאים מהמיקוד, לא נותרים חרוזים צפים בתמיסה הנראים לעין. בנקודה זו, המערכת מיושרת כראוי, שכן רק החרוזים שנספחו לכיסוי הזכוכית מסוגלים להיות במיקוד.
בשלב הבא, כדי ליישר את ערוצי הפלואורסצנציה האדום והירוק ביחס זה לזה, התמקדו בחרושגות והשוו את מיקומם של מאפיינים ניתנים לזיהוי בתמונות שהופקו בשני הערוצים. באמצעות ברגי המיקרומטר X ו-Y במעמד של אחת המצלמות, הביאו את המיקום היחסי של החרושגות לסמיכות המקסימלית האפשרית. שימו לב לחרושגה הבהירה ברביע השמאלי התחתון של שתי התמונות כדי להבטיח יישור מרחבי בין שני הערוצים.
מאפיין זה מובא לאותה מיקום יחסי בשני התמונות. צלם ושמור את התמונה משני הערוצים. תמונות אלו ישמשו כסטנדרט קולוקליזציה ליישור שני הערוצים.
דוגמה ליישור זה נראית כאן לפני ביצוע היישור. אחד הערוצים מסובב ביחס לשני, כפי שמוצג בתמונה זו שבה חופפות תמונות משני הערוצים של חרוזי התת-רזולוציה. לאחר ביצוע ההתאמות, התמונות מיושרות כפי שמוצג כאן.
ניתן לבחון באופן מעמיק יותר את איכות היישור על ידי השוואת תמונות של תאים חיים שעברו טרנספקציית GFP. שימו לב כי הפודיום של Laila משני הערוצים מיושר באופן מושלם, לאחר יישור שתי התמונות באמצעות הכיול שנקבע בעזרת המיקרו-חרוזי הפלואורסצנטיים.
לאחר הגדרת המיקרוסקופ, מכינים תאי זרימה המכילים שכבות ליפידיות דו-שכבתיות הנתמכות על זכוכית המציגות אנטיגן, ומבצעים turf M כדי להדגים תחילה תאי T שעברו TRANSFECTED המקיימים אינטראקציה עם התשתית. בהתאם לפרוטוקול שתיארו Ana ו-Dustin, מרכיבים תאי זרימה עם שכבות ליפידיות מישוריות שנוצרו על כיסוי זכוכית המכיל ליפידי Ni-NTA, את מולקולת ההיצמדות ICAM 1 וקומפלקסים של peptide MHC. IEFK טעונים ב-MCC משולבים בשכבה הדו-שבטית באמצעות תגי היסטידין.
המולקולה המעוררת-משלימה CD 80 מוטמעת. באמצעות עוגן GPI, מקמו את תא הזרימה עלבמת המיקרוסקופ וייצבו אותו על ידי חיבור התא ללוח מתאם עלבמת המיקרוסקופ באמצעות מוט מתיחה לקיבועו. לאחר מכן, חברו את גוף החימום שסופק על ידי היצרן לתא הזרימה כדי לשלוט בטמפרטורה שלו.
מקם את העדשה על השכבה הכפולה והגדר את מיקוד מישור השכבה הכפולה כדי לאפשר חימום של העדשה ותא הזרימה; הפעל את מחממי תא הזרימה והעדשה כדי להביא את טמפרטורת התא ל-37 °C. לאחר ארבע שעות של דגירה, העבר את תאי ה-T שהועברו בחתך לתוך מבחנה של 15 milliliters וסבב בצנטריפוגה במהירות של 80 ×g. השהה מחדש את התאים ב-300 µl של בופר H-B-S-B-S-A. לאחר מכן, הוסף H 57 FAB או H 57 single chain variable fragment לסימון ה-TCR עד לריכוז סופי של 10 µg/mL עבור fab או 20 µg/mL עבור ה-single chain variable fragment.
העבירו את התאים לתוך מבחנת פקס בנפח חמישה מיליליטר. לאחר מכן, באמצעות מזרק עם קצה החלקה של מיליליטר אחד, הזריקו את התאים לתא הזרימה דרך שסתום תלת-כיווני. הגדירו את תנאי הדימוי כך שרכישת התמונות החיה בערוץ הכפול תציג תצוגה מקדימה חיה של ערוצי ה-TCR וה-GFP, ומצאו שדה המכיל תאים שעברו טרנספקציה.
בשל הבדלי העוצמה בין ה-TCR ל-GFP, ייתכן שיהיה צורך להתאים את קנה המידה של התמונות בזמן אמת כדי שניתן יהיה להדמיות את התאים בשני הערוצים. כפי שקורה כאן, יש לאשר את תאורת ה-turf על ידי מיקוד כלפי מעלה של מישור הזכוכית כדי לזהות כל צביעה לטרלית של הממברנה. אם הממברנות הלטרליות אינן נכנסות למיקוד, הרי שיישור ה-turf תקין.
בתצוגה מקדימה חיה זו, צביעת ממברנה צדית ניכרת הן במישור של זכוכית הכיסוי והן כאשר זכוכית הכיסוי מוצאת מהמיקוד כדי להביא את המיקרוסקופ ליישור turf תקין. זווית הלייזר ביחס לעדשה מוגדלת, והממברנה הצדית יוצאת מהמיקוד. התחילו ללכוד תמונות בודדות ורצפי time-lapse במרווח של 10 שניות.
במשך חמש דקות, התאים הודגרו על תומכי זכוכית ושכבות דומה של INTA שהכילו שש מולקולות למיקרומטר רבוע של פפטיד טעון hist-tagged IEFK, 100 מולקולות למיקרומטר רבוע של ICAM 1 טעון hist-tagged ומצומד ל-Alexa 647, ו-100 מולקולות למיקרומטר רבוע של CD 80 מעוגן ל-GPI. בוצע מיקרוסקופי TIRF עם רכישת אות סימולטנית בשני ערוצים, בנוכחות רציפה של פרגמנט FAB של H57 מצומד ל-Alexa 546.
כדי לצבוע את TCR, צולמו התאים עד שעה לאחר המגע הראשוני עם השכבה הכפולה. מספר אשכולי ZAP 70 לכל תא נותח באמצעות תוכנה אוטומטית לספירת אשכולים. בכל מקרה נותחו לפחות 40 תאים.
הפפטידים שנטענו מצוינים בתוספת. ICAM one מתייחס לתאים על שכבות דו-שכביות המכילות 100 מולקולות לסמ"ר של Alexa 6 4 7 מצומד. His tagged ICAM one כפי שמוצג באיור, סיגנלינג תלוי zap 70 מתרחש במיקרו-צבירים של TCR ורק בתגובה לליגנדים אגוניסטים, כפי שניתן לראות בסרטון זה, שצולם בקצב של 10 שניות לפריים.
אותיות ה-TCR בתגובה לפפטידים אגוניסטים נשמרות על ידי יצירה רציפה של מיקרו-צבירים של TCR בפריפריה של אזור המגע, אשר מגייסים את ZAP 70. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הטרנספקציה של תאי T ראשוניים באמצעות טכנולוגיית maxa nuclear affection והדמיה נכונה של גיוס מולקולות סיגנל GFPT למיקרו-צבירי TCR באמצעות מיקרוסקופיית turf. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך שבע שעות אם היא מבוצעת כהלכה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתייחס בעדינות רבה לתאים הראשוניים. ככל שהתאים יהיו בריאים יותר בכל שלב בניסוי, כך יעלה יעילות הטרנספקציה ותוכלו ללכוד יותר תאים בדימות. תאי T הם בעלי ניידות גבוהה, וכתוצאה מכך, דימות רצוף של ערוצי TCR ו-GFP גורם לכך ששתי התמונות לא יתיישרו באופן מושלם עקב תנועתם של תאי T ושל מקבצי TCR מיקרוסקופיים.
כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו את מיקרוסקופ ה-turf לרכישה סימולטנית בערוץ כפול.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למעקב אחר אירועי איתות של רצפטורים של תאי T באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בהחזרה פנימית מלאה (TIRF). טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה של קומפלקסי איתות בתאי T, ומספקת תובנות לגבי הדינמיקה המרחבית והזמנית של אינטראקציות בין חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי מוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- הבנת המדורה התאית של חלבונים היא חיונית למחקר של מסלולי איתות.
- מיקרוסקופיית TIRF מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים.
- אירועי איתות בתאי T חיוניים לתגובות חיסוניות.
- בשיטות קודמות חסרה הרזולוציה הדרושה להדמיה יעילה של מיקרו-צבירים (microclusters).
מטרת המחקר
- להדגים מערכת מבוססת מיקרוסקופיית TIRF לחקר סיגנלינג של קולטני תאי T.
- לספק פרוטוקול לטרנספקציה של תאי T עם מולקולות סיגנלינג המסומנות ב-GFP.
- להדגיש את היתרונות של מיקרוסקופיית TIRF על פני שיטות קונבנציונליות.
שיטות בשימוש
- טרנספקציה של תאי T ראשוניים של עכבר עם ZAP-70 המסומן ב-GFP.
- הכנה של שכבה ליפידית דו-שכבתית נתמכת בזכוכית עם קומפלקסים של פפטיד-MHC.
- דימות באמצעות מיקרוסקופיית TIRF להדמיית מיקרו-צבירים של קולטן תאי T.
- ניתוח של אירועי איתות באמצעות רכישה סימולטנית בערוץ כפול.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מיקרו-צבירים (microclusters) של קולטני תאי T במהלך העברה של אותות.
- הדגמה של רזולוציה משופרת במיקרוסקופיית TIRF בהשוואה למיקרוסקופיית קונפוקלית.
- זיהוי אירועי העברת אותות מרכזיים ואינטראקציות בין חלבונים בתאי T.
- מתן טיפים לפרוטוקול לשיפור חיוניות תאי T ויעילות הטרנספקציה.
מסקנות
- מיקרוסקופיית TIRF היא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקת האיתות של תאי T.
- השיטה ישימה באופן רחב למערכות קולטן שונות בתאי יונקים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון איתות בתאי מערכת החיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
טכניקת מיקרוסקופיית TIRF זו מאפשרת דימוי בו-זמני ובזמן אמת של TCR ושל חלבוני איתות הקשורים אליו, ומספקת רזולוציה מרחבית וזמנית קריטית לאישור יעדים בשלבים מוקדמים באימונולוגיה. באמצעות ויזואליזציה של היווצרות מיקרו-צבירים של TCR ואירועי איתות במורד המסלול, כגון גיוס של Zap70, השיטה תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית של השערות טיפוליות הכוללות מסלולי הפעלה של תאי T. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על אינטראקציות בין חלבונים בממברנת הפלזמה תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות לגבי שילוח TCR על ידי ויזואליזציה של גיוס בזמן אמת של חלבוני שילוח כגון Zap70 למיקרו-צבירים של TCR.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על הפעלת קינאז ופוספורילציה של חלבוני מתאם בתאי T חיים.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי קישור בין מעורבות הליגנד לבין היווצרות קומפלקס שילוח במורד המסלול, באמצעות קריאה כמותית מבוססת דימוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים, כגון ספירת אשכולות Zap70 לתא באמצעות אנליזה אוטומטית, מה שמאפשר תנאי סריקה הניתנים לשחזור.
- סקילביליות: רכישה סימולטנית בערוץ כפול מאפשרת ניטור מקבילי של מעורבות רצפטורים וגיוס חלבוני סיגנלינג, ובכך משפרת את התפזורה להערכת תרכובות או ליגנדים.
- שחזור: פרוטוקולים ליישור המיקרוסקופ באמצעות סטנדרטים של מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות מבטיחים רישום ערוצים עקבי בין ניסויים ומשתמשים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין השלב המוקדם של הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לבחינת דינמיקת האותות של TCR תחת תנאי גירוי מוגדרים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה האם האותות שנצפו תלויים בליגנדים אגוניסטיים והאם הם מתרחשים באופן ספציפי במיקרו-צבירי TCR, ובכך מפחיתה עמימות בפירוש המסלול.
- סנכרון עם סמנים ביולוגיים: תומכת בזיהוי אירועי העברה של אותות התלויים בפוספורילציה, שעשויים להיות במתאם עם תגובות פונקציונליות של תאי T ותוצאות התמיינות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לאופטימיזציה מוקדמת של מובילים (lead optimization), ובמיוחד עבור אימונו-מודולטורים המשפיעים על סיגנלינג של קולטן T-cell.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות להדמיה של הארגון המרחבי והדינמיקה הזמנית של קומפלקסי איתות הקשורים ל-TCR.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות מבוססות הדמיה (למשל, היווצרות אשכולות Zap70) התומכות בהשוואה בין יעילות ליגנדים שונים או הפרעות גנטיות.
- אנליזה: מספקת תוצאות רב-ערוציות וסימולטניות של מיקום קולטנים וגיוס חלבוני איתות, מה שמאפשר קורלציה בין המעורבות להפעלה.
- מחקר תרגומי: תומך ברציפות פרה-קלינית על ידי מידול של היווצרות סינפסה אימונולוגית על שכבות ליפידיות נתמכות עם הצגת אנטיגן מוגדרת.
- שימוש חוזר בארגון: ניתן להתאמה למערכות קולטנים שונות בתאי יונקים שבהן איתות מתרחש באשכולות, ובכך מקדם תועלת חוצת-פרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באותות TCR על ידי ויזואליזציה ישירה של גיוס Zap70 למיקרו-צבירים (microclusters) בעת קישור לאגוניסט.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולי טרנספקציה סטנדרטיים, הכנת שכבת ליפידים דו-שכבתית והליכים ליישור ערוץ כפול.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go בפיתוח אימונותרפיה על ידי אספקת תובנה מכניסטית מוקדמת לגבי קישור למטרה ויצירת אות.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעודוף של מועמדים המכוונים ל-TCR בהתאם לסיכון, על בסיס כשירות אותית מאושרת במערכת המקשורה להקשר פיזיולוגי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנספקציה של תאי T ראשוניים ובדימיון של תאים חיים תחת תנאים סביבתיים מבוקרים.
- תלוי במערך מיקרוסקופיה התואם ל-TIRF עם יכולת רכישה בו-זמנית של שני ערוצים ודיוק בכיול הלייזר.
- מחייב סטנדרטיזציה של הרכב השכבה הליפידית והצגת האנטיגן כדי להבטיח מעורבות עקבית של TCR לאורך הניסויים.
- כולל אופטימיזציה של יעילות הטרנספקציה והחיוניות, במיוחד בהתחשב ברגישותם של תאי T ראשוניים למניפולציות ולארטיפקטים של ביטוי-יתר.
- מוגבל על ידי הצורך בטיפול עדין כדי לשמור על חיוניות התאים ולמנוע אי-דיוק בכיול הנגרם מסחיפה במהלך דימיון Time-lapse.
