Name: התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: חקור פיתוח מיני ופרישת אסקוספורות ב-Fusarium graminearum באמצעות שיטות ויזואליות. למד כיצד לייצר פריתקיה, לערוך הכלאות גנטיות ולסרוק מוטנטים בפטרייה זו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (MCB-0923794 אל רגל).

1. ייצור גופי פרי מיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזר המרכז לחסן אגר 10 ב צלחת קוטר 6.0 ס&quot;מ פטרי עם המתח הפורה של פ graminearum (המלץ PH-1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחוסן מנות תחת אורות הניאון הבהירים בטמפרטורת החדר (18-24 ° C) ולאפשר לגדול עד תפטיר הגיע לקצה החיצוני של צלחת פטרי (3-5 ימים). בית אורות ניאון מסחריים לעבוד בסדר עבור גירוי הגוף הפרי היווצרות השחרור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות עם קיסם mycelia אוויר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 1.0 מ&quot;ל 2.5% Tween 60 א.ק. אל פני השטח עם הוקי כוס סטרילית או בסופו מעוגל של מוט זכוכית סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחות לאור. אל תוסיף Parafilm על צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 שעות, את פני השטח של הצלחות צריך מראה מבריק. אם mycelia מופיע שוב, משטח גירוד מחדש להחיל Tween-60 הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב התפתחות גופי פרי מיניים במהלך השבוע הבא. שלבי הביניים שלפיתוח perithecium ניתן לקצור ידי בעדינות לגרד את פני השטח של אגר ופלאש להקפיא RNA החילוץ (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגים למבוגרים יצטברו על מכסה של צלחת ביום 7. בהתחלה אלו יהיו רק לעין תחת מיקרוסקופ לנתח, אבל מיום ליום 9, הם צברו לצפיפות מספיק כדי להיות גלוי לעין בלתי מזוינת. </li></ol> 2. Ascospore Assay פריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6 אחרי יישום של פתרון Tween, חתכו 1 ס&quot;מ קוטר המעגל מתוך אגר עם מקדח עץ. לחלופין, אזמל ניתן להשתמש כדי להסיר קטע בגודל דומה. המעגל יכול להיות פרוס לשניים, וכל חצי דגש על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט החלקים כך את פני השטח המכיל את גופי פרי ניצב לפני השטח של שקופית, וכן נבגים נורים לאורך בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף בתא לחות במשך הלילה תחת אורות. נבגים יצטברו עלהשקופית ולהיות גלוי לעין בלתי מזוינת למחרת בבוקר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגים שנצברו ניתן לשטוף שקופיות עם מים לכמת אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוטנציאליים מעכבי שחרור ascospore ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו על ידי הוספת אותם בצד האחורי של הבלוק אגר במהלך הרכבה של assay. מעכבי כמה ערוץ יון להפחית הפרשות כבר ושם ישקלו לו ויעריכו בעבר עם הטכניקה הזו 15. </li></ol> 3. דור של צאצאיהם רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום לחצות ידי יחסנו אגר גזר עם שני זנים של פ graminearum (1 + ניט ואחד ניט-), הצבת נקודות חיסון בצדדים מנוגדים של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העובש מילאו את פני השטח, לגרד את החלק האווירי וליישם Tween-60 הפתרון כפי שתואר לעיל. השתמש הסמן לציין בצד של צלחת פטרי שבה העובש להיפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור תרבויות לאור דגירה עד פיתחו גופי פרי מיניים, ו cirrhi לא להיותאקדח כדי ליצור מתוך גופי פרי מיניים יחד בצומת בין שתי התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, להכניס להציג גופי פרי מיניים יחד בצומת של שתי התרבויות. באמצעות סיכה חרק, עיקור וטבל במים סטריליים, לגעת cirrhus לאורך הגבול הזה בקלילות עם קצה של סיכה. לחות על הפין צריך לאפשר cirrhus את להיצמד סיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את קצה הפין עם cirrhus עליו מים סטריליים 200 μl בצינור Eppendorf לשטוף את הנבגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכת להבה, ללחלח את זה שוב לקחת עוד cirrhus. פיק 10-15 cirrhi, ומקום אחד בצינור נפרד של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מערבולת בקצרה מכיל מושעה cirrhi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 60 μl של השעיה נבג עם טפטפת ומניחים על המדיום MMTS 1 ב 9 ס&quot;מ צלחת פטרי. מורחים בעזרת מקל הוקי סטרילית. ההשעיה נבג הנותרים ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבוע replated במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubate בטמפרטורת החדר (אור לא הכרחי) למשך 3-5 ימים עד מושבות קטנות מאוד להופיע (איור 3). יהיו שני סוגים של פנוטיפים בין המושבות. את מתישה מושבות העובש תהיה דלילה יותר המושבות + מטומטם. Cirrhi מ רקומביננטי גופי פרי מיניים יראה את שני פנוטיפים המושבה ביחס שווה בקירוב. מחק את צלחות עם מושבות של הפנוטיפ רק אחת עליהם. שימו לב, לעיתים יותר משני פנוטיפים לגרום עקב הפרדה של גורמים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מושבות V8 או אגר גזר לאחסון. הבדיקה מושבות על אגר DOX של Czapek (את מתישה זנים לא יגדל על DOX Czapek של) ועל מחשב כף יד עם כלורי (0.5 מ &#39;אשלגן כלורי, לצלילי + מטומטם לא יגדל על מחשב כף יד עם כלורי) כדי לאשר את הפנוטיפ הנכון. לבחון את המושבות עבור התכונות הרצויות. </li></ol> 4. נציג תוצאות ייצור גופי פרי מיניים המטרה היא להיות הדשא של<html> גופי פרי מיניים ללא mycelia או נבגים לכאורה. פני השטח של התרבות יופיע דומה קטיפה שחורה (איור 1). ב 24 שעות לאחר היישום של Tween את פני השטח של אגר צריך ברק קל. אם mycelia להופיע שוב, ואז הצלחת לא יכול היה לגרד מספיק כדי לגרום להתפתחות perithecium. Ascospore פריקה תמיד מספקים assay שלך כמה בלוקים של אגר מהלחץ wild-type. אם אלה לא אש, אז גם גופי פרי מיניים שלך צעיר מדי, מבוגר מדי. אם הם מבוגרים מדי, אז העובש רבים יופיעו על פני השטח של תרבות ונותן לו גוון לבנבן. אם זה לא המקרה, הם עשויים להיות צעיר מדי, assay יש לנסות שוב בעוד 24 שעות. מדי פעם, תרבויות לא למלא היטב, הניסוי יהיה צורך לחזור. הקפד לבצע את assay בתנאי תאורה נאותים. רקומביננטי הצאצאים &gt; גופי פרי מיניים רקומביננטי צריך לעשות את רוב גופי פרי מיניים יחד בצומת בין שני זנים. אנחנו בדרך כלל לעבד 10 cirrhi מהצלב ולפחות 4-6 של אלה צריכים להיות רקומביננטי. לעתים רחוקות, המוטציה מונעת זן מן ההזדווגות. אם אחד ההורים יש פנוטיפ צמיחה חריגה, אז יותר מ 2 פנוטיפים יכולים להיות נוכחים בין מושבות על MMTS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> באיור 1. שלבי ההתפתחות perithecium על אגר גזר. H שמאל, 72 לאחר יישום Tween. הערה פיגמנט אדום גופי פרי מיניים צעיר מאוד גלוי בתור גרעינים שחורים על פני השטח. נכון, ב 144 שעות, גופי פרי מיניים בוגרים יצרו. שים לב כמעט מלאה העדר mycelia שטחית בתרבויות הצדדים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> 2. איור פריקה assay. התוספת כתום אגר גזר מכוונת כך thaנבגים טי משוחררים בכוח גופי פרי מיניים בוגרת על פני השטח שלו יכול להצטבר על פני השטח של שקופיות זכוכית. 15 שעות זמן הצטברות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> איור 3. הבדלים בין צמיחה ניט + ו מתישה מושבות על מצע MMTS סלקטיבית. את מתישה המושבות (ראשי חץ) קטנים יותר. את + מושבות מטומטם (חיצים) להראות צמיחה איתנה. התמונה צולמה לאחר 7 ימים.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

פ graminearum מותאם במיוחד ללימוד פיתוח גוף הפרי בשל הזמינות של הגנום היטב המבואר ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> : 4), ואת הזמינות של Affymetrix- מבוסס microarray 6. זו יש להקל את היכולת לזהות גנים חשובים להזרמת ascospore 7,11,3. השיטות שהוצגו כאן יאפשר החוקר להתמקד קבוצה בדידה של שלבים התפתחותיים ופונקציות לניתוח גנטי של גופי פרי של פ graminearum. השיטות גם להתאמה בקלות פטריות קשורות יכול להיגרם פירות בתרבות, והוא יכול לשמש כאמת מידה להתפתחות במגוון רחב של סוגים אחרים בגוף פטרייתיים הפרי. היכולת להעריך את הפנוטיפ ירי נבג יכול להיות עדין מינים שבהם נבגים קטנים וקשה לראות, כגון <eמ&gt; פ graminearum. אוסף של נבגים בשקופית נקי מאפשר גם הערכה חזותית, והערכה כמותית, כמו נבגים ניתן לשטוף שקופיות ונרשמת. כמה מינים פטרייתיים לייצר הרירית המקיף שלהם נבג נבגי לא ניתן שטפה, אבל יש מנה מיקרוסקופית כפי שהם יישארו בשקופית. מצאנו שזה נכון של Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum זן PH-1 </td><td> פטרייתי גנטיקה צילומים מרכז, קנזס </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> אגר DOX Czapek של </td><td> Difco, בקטון דיקינסון </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

התפתחות מינית והפרשות ascospore ב fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum הפכה מערכת מודל ללימודי פיתוח של פטריות פתוגניות פילמנטיות. פ graminearum בקלות מייצר גופי פרי, המכונים גופי פרי מיניים, על אגר גזר. גופי פרי מיניים מכילים מספר רב של סוגי רקמות, המיוצר בשלבים מסוימים של פיתוח perithecium. אלה כוללים (לפי סדר הופעתם) היווצרות התיבות perithecium (המעוררים העובש ascogenous), הקיר החיצוני, paraphyses (mycelia סטרילית אשר תופסים את מרכז perithecium עד asci לפתח), asci, ואת ascospores בתוך asci 14. ההתפתחות של כל אחד רקמות אלו מופרדים על ידי כ 24 שעות, כבר בסיס של מחקרים transcriptomic במהלך התפתחות מינית 12,8. עיין Hallen et al. (2007) לתיאור מעמיק יותר של ההתפתחות, כולל תמונות של כל שלב. כאן, אנו מציגים את שיטות להפקת והקציר סינכרוניLY פיתוח מדשאות גופי פרי מיניים ללימודי הזמני של ויסות הגנים, פיתוח תהליכים פיזיולוגיים. למרות השיטות האלה נכתבים במיוחד לשימוש עם פ graminearum, טכניקות ניתן להשתמש במגוון רחב של מחלות נוספות, ובלבד הפרי יכול להיגרם בתרבות ויש כמה בתיאום לפיתוח. יש לנו להתאים לאחרונה בפרוטוקול זה כדי ללמוד את ההתפתחות המינית של פ verticillioides. אמנם גופי פרי מיניים אדם יש הרים יד על מין זה, כי הדשא של פיתוח גופי פרי מיניים לא יכול היה להיגרם, התהליך עובד היטב לחקר ופיתוח (Sikhakolli ואת שביל, לא פורסם). התפקיד החשוב ביותר של גופי פרי פטרייתי הוא פיזור נבגים. ברבות מיני Ascomycota (נאד לייצר פטריות), נבגים נורים מתוך נאד, עקב הדור של לחץ turgor בתוך נאד, נהיגה פליטה של ​​נבגים (נוזל epiplasmic) דרךנקבובית עצה נאד 2,7. המחקרים שלנו של הפרשות ascospore בכוח גרמו לפיתוח של &quot;assay הפרשות נבג&quot;, שבו אנו משתמשים כדי לסנן על מוטציות בתהליך. כאן אנו מציגים את פרטי assay זה. פ graminearum הוא homothallic, וכך יכול להיווצר גופי פרי בהיעדר בן זוג תואם. היתרון של homothallism היא כי מעבר אין צורך לייצר צאצאים הומוזיגוטים עבור תכונה מסוימת, פן כי יש להקל את לימוד התפתחות מינית מין זה 14,7. עם זאת, זנים heterothallic נוצרו, שניתן להשתמש בהם עבור המעבר 5,9. אפשר גם לחצות זנים homothallic לקבל מוטנטים של גנים מספר 1 זן 1. הדבר נעשה על ידי coinoculating 1 צלחת פטרי עם 2 זנים. יחד לנקודת המפגש, רוב גופי פרי מיניים יהיו רקומביננטי (בתנאי מוטציה באחד הזנים ההורים לא לעכבoutcrossing). הגיל גופי פרי מיניים, הם להפריש ascospores בהמוניהם במקום בכוח למלא אותם. Exudate נבג שנוצר (המכונה cirrhus) יושב בקצה perithecium והוא יכול בקלות להסיר להתאוששות של נבגים בודדים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול כדי להקל על זיהוי רקומביננטי גופי פרי מיניים ואת ההתאוששות של הצאצאים רקומביננטי.

צלבים מיניים ובידוד של הצאצאים רקומביננטי הם כלי מחקר חשובים פטריות פילמנטיות,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, הטכניקות הדרושות בהצלחה לבצע את התהליכים האלה מוצגים.

התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum</em

*Fusarium graminearum* הפך למערכת מודל למחקרים על התפתחות ופתוגניות של פטריות Filamentous. *F. graminearum* מייצר בקלות רבה את...

המטרה הכללית של הליך זה היא ללמוד כיצד להפיק ולשלוט בפיתוח של parathesia ולבחון פריקה של APO בתרבית. הדבר מושג תחילה על ידי השראה של תרבית בצמיחה פעילה כדי להתניע את הפיתוח המיני. השלב השני הוא ביצוע בדיקה לפריקה פעילה של נבגים, ולאחר מכן מפיקים parathesia רקומביננטיים.השלב הסופי הוא להעריך את הצאצאים עבור פנוטיפים המעידים אם התרחשה רקומבינציה או לא. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתוצאות לסריקת מוטנטים בהתפתחות מינית או ליצירת מוטציות מרובות בתוך זן אחד. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כיוון שהשלבים קשים לתיאור, ולמרות שהם פשוטים, יש לבצעם בדיוק כדי להשיג פליטת נגוברים אופטימלית ויצירה עקבית של parathesia.התחל בהזרקת נבגים של זן פורה של f gramine במרכז של גזר חתוך בקידוח (carrot auger) בתוך צלחת פטרי בקוטר שישה סנטימטרים. דגור את הצלחות המוזרקות תחת תאורת פלורסצנט מסחרית סטנדרטית ובהירה בטמפרטורת החדר.אפשרו לפטריות לגדול במשך שלושה עד חמישה ימים עד שהמיצליום יגיע לשולי הצלחת. תחת המנדף, גרדו בעדינות את פני השטח של התרבית באמצעות קיסם סטרילי כדי להסיר את המיצליום האווירי.לאחר מכן, מרח מיליליטר אחד של חומר פעילי שטח (surfactant) על המקדח ושפשף אותו אל פני השטח באמצעות הקצה הכפוף או הבולבס של מוט זכוכית סטרילי. אל תמרח פריל (perfil). החזר את הצלחות תחת התאורה.לאחר 24 שעות, פני השטח של הצלחות צריכים להיראות מבריקים. אם המיסליום מופיע שוב, גרדו את פני השטח, מרחו שוב תמיסת tween 60 וחשפו אותם לאור למשך 24 שעות נוספות. כעת עקבו אחר התפתחות הפראטסיה למשך שבוע.פרתזיות צעירות נראות כגרגרים שחורים על פני השטח של המקדח. בהשוואה לפרתזיות בוגרות, כמעט לא אמורים להופיע מיצליום שטחי.עד היום השביעי מצטברות נבגים בשלים על מכסה הפטריה, ועד היום התשיעי, הנבגים צפופים כל כך שהם נראים ללא הגדלה. כדי לאסוף את השלב הביניים, גוררים בעדינות את פני השטח של ה-auger באמצעות סכיך ומעבירים את ה-parathesia למבחנה קריוגנית. ניתן לאחר מכן להקפיא את המבחנה בהקפאה מהירה (flash frozen) לצורך מיצוי RNA שישה ימים לאחר יישום החומר הפעיל.גזרו עיגול בקוטר של one centimeter מהאגר (auger) באמצעות פטיש עץ, מקדחה או סקלפל. חתכו את העיגול לחצי והניחו את החצאים על זכוכית מיקרוסקופ; כוונו את החלקים כך שהמשטח המכיל את גופי הפרי יהיה ניצב למשטח הזכוכית, והנבגים יופנו לאורך הזכוכית. בשלב זה, אם נדרש מעכב נבגים (acro spore inhibitor), יש למרוח אותו על גב בלוק האגר.ניתן להשתמש בטכניקה זו לסריקת כימיקלים המעכבים פריקה ולסריקת מוטציות גנטיות הגורמות לאובדן היכולת לשגר נבגים; ביצענו בהצלחה את שתי הפעולות. כעת, דגרו את השקף למשך לילה בתא לחות פשוט בטמפרטורת החדר תחת תאורה. עם התפרצות גופי ההפריה, יצטברו נבגים על השקף והם יהיו גלויים שם בבוקר.כעת ניתן לשטוף את הנבגים שהצטברו מהזכוכית אל תוך צלחת נקייה ולכמת אותם. התחילו בהקמת הכלאה גנטית בין שני זנים של f gramine arum על ידי הזכרתם בצדדים מנוגדים של צלחת פטרי עם מקדח גזר. כפי שתואר בעבר, גדלו את הפטריות עד שההיפים מילאו את הפנימיות.גרדו את החלקים האוויריים ומריאו תמיסת T בין 60. בתרחיש זה, סמנו את הצלחת במקום שבו ההיפים נפגשים. החזירו את התרביות לאור והדגירו אותן למשך כשבעה ימים, עד להתפתחות הפרתזיה ותחילת היווצרות ה-Siri מהפרתזיה לאורך נקודת המפגש בין התרביות.ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשלב מוטציות מרובות במאבב אחד. ראוי לציין כי ניתן לבחור הן את knit plus והן את knit minus, מה שהופך אותו לסמן ברירה (selectable marker) שימושי מאוד. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, הבא למבט את הפרתזיה לאורך נקודת המפגש של שתי התרביות.לאחר מכן אתרו את עין החיפוש. כעת טבלו סיכה לחרקים שעברה סטריליזציה במים סטריליים והשאיחו את הסיכה בנזילה שנוצרה בגבול שבין התרביות. ה-SRIs אמורים להידבק ללחות של הסיכה.לאחר מכן, שטפו את קצה הסיכה ב-200 µL של מים סטריליים הנמצאים בתוך פרועת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL. עקרו את הסיכה בלהבה, הרטיבו אותה שוב, ודגמו sru נוסף. בחרו בין שלושה לחמישה Siri והעבירו את כולם לפרועת נפרדת.כעת ערבבו קצרות במערבל וורטקס. עבור כל מבחנה המכילה תרחיף נבגים, פרסו 60 µL מתרחיף הנבגים על צלחת פטרי בקוטר תשעה מילימטרים.בעזרת מצע MMTS, דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר עם או ללא תאורה, ואחסנו את שארית תגלי השוואות הנבגים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. לאחר שלושה עד חמישה ימים, יופיעו על הצלחת מושבות קטנות מאוד. ניתן להעריך פנוטיפ אחד תחת מיקרוסקופ.למושבות שליליות ל-Knit יהיו היפים דלילים יותר מאשר למושבות חיוביות ל-Knit. השליכו פלטות המכילות רק אחד מהפנוטיפים. ל-Siri מ-recombinant parathesia יש את שני פנוטיפי המושבות בפרופורציה שווה בקירוב.שמרו על מנות אלו. לעיתים מופיעים פנוטיפים אחרים כתוצאה מהפרדה של גורמים אחרים כגון מושבות, שהן בינוניות בין חיוביות לקשר (knit positive) לשליליות לקשר (knit negative); למטרות אחסון, העבירו את המושבות מהמנות הרקומיננטיות למנת V eight או למנת גזר agar כדי להמשיך את המחקר באמצעות בחינת פנוטיפים אחרים; זרעו את המושבות על מנת Chap X dock's agar ועל מנות PDA המכילות chlorate. Parathesia גדלו כמרבד דמוי קטיפה שחורה ללא מיצליים או נבגים.24 שעות לאחר מריחת ה-tween, על פני השטח של הברגה (auger) נראה ברק קל. אם מيسيליום (Mycelia) הופיע מחדש, ייתכן שהצלחת לא נגרדה מספיק כדי להשרות התפתחות של פראתזיה (parathesia). מספר בלוקים של ברגה עם גופי פרי מזן פרא (wild type) הוכנו להשבצת נפיצות על שקופיות זכוכית לצורך תצפית.הוכן תאורה מתאימה להפעלה. פראתזיות (Parathesia) שהיו צעירות מדי או זקנות מדי לרוב לא הגיבו. כאשר היו זקנות מדי, הופיעו היפים (hyphy) רבים על פני השטח של התרבית, והעניקו לה גוון לבנבן.כאשר גופי הפרי היו צעירים מדי, הם לא הגיעו לשלב הפריחה והניסוי חזר על עצמו. לאחר 24 שעות, כאשר נאספו 10 Siri מההכלאה, לפחות שישה היו בדרך כלל רקומביננטיים, כפי שנמדד על פי שילוב של פנוטיפים מסוג knit negative ו-knit positive. לעיתים רחוקות מאוד, מוטציה מנעה מזן מסוים להתרבית.אם לאחד ההורים היה פנוטיפ גדילה בולט, אזי יותר משני פנוטיפים היו נוכחים בקרב המושבות על MMTS. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתחיל עם תרבית שנשמרה היטב ולא הועברה באופן סדרתי לאורך זמן. יש להתחיל תמיד עם תרבית שגודלה ממלאי מקפיא יציב.

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי לחקור את תהליכי ההתפתחות של ascospores ב Gibberella zeae, נוהל איסוף בתנאים סטריליים מצולם על מנת להפיק את הרמה הגבוהה ביותר של מידע עבור תיאור פרוטוקול. זה אמור להקל על שחזור של הניסוי, היבט חיוני כאשר ביטוי מלא הגנום בדיקות פרופיל מיושמים.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

בעיות בעיבוד דגימות ביולוגיות לתצפית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כוללות קריסת תאים, טיפול בדגימות ממיקרו-סביבות רטובות והרס תאים. פרוטוקולים בעלות נמוכה ומהירים יחסית המתאימים להכנת דגימות מאתגרות כגון מריסטמים פרחוניים, ציסטות אומיצט ופטריות (Agaricales) נאספים ומפורטים כאן.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.

נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי

כאן אנו מציגים פרוטוקול בסיסי לאינדוקציה של הזדווגות P. blakesleeanus .

הכלאות מיניות עם Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

תאים סרטניים החלב להביע בלוציפראז מושתלים תת עורי בעכברים דמיינו באמצעות דימות אופטי כדי לפקח על גדילה והתפתחות הגידול הלא פולשני במחקר האורך.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

טכניקה נדרש לדמיין את הלב הפועם של הזחל...

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

חקור פיתוח מיני ופרישת אסקוספורות ב-Fusarium graminearum באמצעות שיטות ויזואליות. למד כיצד לייצר פריתקיה, לערוך הכלאות גנטיות ולסרוק מוטנטים בפטרייה זו.

התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum

גלה סרטונים נוספים