תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו בvivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד את תגובות היחידה הבודדת in vivo מאוכלוסייה מזוהה של נוירונים במערכת מודל לא גנטית. זה מושג על ידי ביצוע תחילה של קרניוטומיה כדי לחשוף את אזור המוח המעניין. השלב השני הוא להשתמש בחוטי טונגסטן כדי למקם את הצבע הפלואורסצנטי באזור שאליו מקרינים נוירוני המטרה.

לאחר מכן, הצבע מועבר לאחור, וכתוצאה מכך תיוג סלקטיבי של נוירוני ההקרנה. השלב האחרון הוא להקליט מהאקסון המסומן של נוירון ההקרנה הבודד. בסופו של דבר, הקלטות חוץ-תאיות של יחידה אחת משמשות כדי להראות כיצד נוירונים חושיים מרכזיים במעגל שלם מגיבים לגירוי החושי ב-evo.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לאופן שבו מעגלים נוירולוגיים מזהים הבדלים תת-אלפיות שנייה בתזמון הקלט הסינפטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא היכולת למקד נוירונים בודדים או אפילו אקסונים ומערכות שאינן נגישות גנטית. דגים חשמליים שבועיים משתמשים באותות חשמליים לתקשורת וניווט.

הם מבחינים באותות מדגים שונים באמצעות הבדלים של תת-אלפית השנייה בתזמון הכניסות הסינפטיות. שאלנו כיצד נוירוני השוואת הזמן המשוער במעגל החישה האלקטרוני שלהם מסוגלים לזהות הבדלי תזמון קטנים כל כך. אך ניתן ליישם טכניקה זו גם על מערכות אחרות כגון מסלולים חושיים חזותיים ושמיעתיים.

קשה במיוחד לנוזל מתאים אלה בגלל הגודל הקטן והצפוף ברקמה שמסביב והטרמינלים הפרה-סינפטיים המכסים את רוב בטן התא הזרקת צבע תוך תאי במהלך הקלטת תא שלם. במבחנה מתייג תא בודד כדי להנחות הקלטות ממוקדות מאותו אקסון. באופן דומה, הובלה לאחור לאחר הזרקת צבע חוץ-תאית מספקת אמצעי לתיוג סלקטיבי של נוירוני ההקרנה באזורי מוח שטחיים.

זה יכול לשמש כדי לספק הדרכה חזותית להקלטות יחידה בודדת in vivo. כדי להכין את המחט המקודדת D יש לחדד תחילה חוט טונגסטן בקוטר 160 מיקרומטר לקוטר קצה המחט הסופי של חמישה עד 50 מיקרומטר. ואז בלילה שלפני הניסוי קודד את קצה המחט בתמיסה של שני מילי-מולרית של 10,000 משקל מולקולרי של דקסטרן צימד צבע רצפה של אלקסה כדי לגרום להרדמה כללית.

מניחים את הדג במי מיכל עם תמיסת MS 2 22 ב-300 מיליגרם לליטר, משתקים ומשתיקים חשמלית את הדג על ידי הזרקת 100 מיקרוליטר של צף ב-3 מיליגרם למיליליטר לתוך שרירי גוף הגב. לאחר מכן, מלאו את תא ההקלטה במי מיכל והניחו את הצד הגחוני של הדג כלפי מטה על הפלטפורמה במרכז החדר. לאחר מכן העבירו את תמיסת MS 2 22 המאווררת ב-100 מיליגרם לליטר ב-1 עד 2 מיליליטר לדקה על ידי הנחת קצה פיפטה בפיו.

לאחר מכן, ייצבו את הדג בעזרת מוטות קבועים ושעווה משני צידי הגוף. עקוב אחר מצבו הבריאותי של הדג על ידי בדיקת זרימת הדם הרציפה בכלי העין וצבע גוף תקין. לאחר מכן סובב את הפלטפורמה לאורך הציר האנכי.

כוונו קצה אחד של המשטח כך שצד אחד של המשטח הגבי של ראש הדג ייחשף מעל המים בעוד ששאר גוף הדג יישאר שקוע. יש להניח חתיכה קטנה של מגבון Kim על כל חלק שאינו שקוע בעור כדי למנוע התייבשות. בהליך זה, יש למרוח 0.4% לידוקאין על פני השטח החשוף של הראש באמצעות Q-tip.

לאחר מכן השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך חתיכה מלבנית של רקמת עור בגודל של כשלושה מילימטרים על חמישה מילימטרים עבור דג בגודל 6.2 סנטימטרים. הקצה הצדדי של המלבן צריך להתיישר עם מרכז העין. הקצה הקדמי של המלבן צריך להיות רק אחורי לעין, והקצה המדיאלי של המלבן צריך להיות רק לרוחב לקו האמצע.

לאחר מכן, הסר את המלבן בעזרת זוג מלקחיים. חותכים 2.5 מילימטר רבוע נוסף מלבי קדמי כדי לחשוף את הגולגולת. נקה לחלוטין את פני השטח החשופים של הגולגולת על ידי גירוד כל הרקמה העודפת באמצעות להב האזמל.

ואז יבש לחלוטין את המשטח עם מגבון קים ואוויר מאולץ. לאחר מכן, הדביקו עמוד מתכת לאזור הגולגולת החשוף המדיאלי הקדמי בעזרת דבק סופר. המתן עד שהדבק יבש לחלוטין.

השתמש במקדחה דנטלית עם קצה קרביד כדורי בקוטר 0.5 מילימטר כדי לצייר מלבן של כשני מילימטרים על ארבעה מילימטרים על הגולגולת עבור דג בגודל 6.2 סנטימטר. לאחר מכן, חותכים את היקף המלבן בעזרת האזמל והמלקחיים. ואז מקלפים את הגולגולת.

כדי לחשוף את המוח, חתכו גם את הדורה מאטר הפיגמנטי וגם את ה-pia mater השקוף בעזרת מספריים קפיציים או מחט. לאחר מכן הסר את החלקים החתוכים בעזרת זוג מלקחיים כדי לחשוף את הגרעין הצדדי הנוסף הקדמי ואת הגרעין הצדדי האחורי. כעת מקם מניפולטור עם מחט מצופה D שהוכנה קודם לכן מעל אזור המטרה המכיל את האקסונים המעניינים.

הגרעין החיצוני הצדדי האחורי במקרה שלנו מכניס במהירות את המחט כ-25 מיקרומטר לרקמה. לאחר שהצבע התפזר במשך 15 עד 30 שניות, משוך את המחט. חזור על הפעולה עם מחטים טריות נוספות לפי הצורך.

הנח כל אחד מהם במיקום אחר כך שהצבע יתפזר בכל אזור היעד. לאחר מכן שטפו את עודפי הצבע מהחלל עם תמיסת הצלצול של היקמן והמתינו לפחות שעתיים לספיגת הצבע והובלתו. כדי לדמיין את האקסונים המעניינים, מקם את תא ההקלטה עם הדג מתחת למטרה של מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי בשלב קבוע זקוף.

העבר את תמיסת הנשימה למי מיכל טריים ושמור על אותו קצב זרימה. לאחר מכן הנח קצה אחד של חוט ההארקה בחלל המוח החשוף וחבר את הקצה השני לקרקע של שלב ראש ההקלטה. לאחר מכן, הניחו זוג אלקטרודות הקלטה ליד בסיס הזנב.

לאחר מכן חבר את האלקטרודות למגבר דיפרנציאלי ולמכשיר הקלטה. על מנת לנטר את פקודת פריקת האיברים החשמליים או EODC, הכינו סקיצה מוקטנת של אזור המוח הנצפה בהגדלה נמוכה, כולל כלי דם עיקריים כציוני דרך לזיהוי המיקום המדויק של האקסונים המסומנים כדי לאשר תחילה את מיקום D, הצג את כל הרקמה עם תאורת שדה בהיר להתמצאות.

לאחר מכן צפה בו עם תאורת פלורסנט. הגרעין החיצוני הצדדי האחורי אמור להראות תיוג מפוזר. לאחר מכן, בהגדלה גבוהה, אתר את הגרעין הצדדי הקדמי עם הכלים כציוני דרך.

האירו אותו באור פלואורסצנטי תוך חיפוש אחר אקסון מסומן ליד פני השטח, באמצעות קוטר חיצוני של מילימטר אחד בקוטר פנימי של 0.58 מילימטר. זכוכית נימית בו סיליקט עם נימה. משוך אלקטרודת הקלטה עם שוק צר באורך חמישה מילימטר וקוטר קצה של כ-1 עד 2.4 מיקרומטר.

מלאו את האלקטרודה בתמיסת צלצול היקמן מסוננת. התנגדות הקצה הסופית צריכה להיות בטווח של 16 עד 155 מגה אוהם. הנח את האלקטרודה במחזיק אלקטרודה עם יציאת לחץ.

חבר אותו לראש הבמה המותקן על מניפולטור. לאחר מכן חבר את ראש הבמה למגבר. התקן רכישה אנלוגי לדיגיטלי שאינו מוצג מחבר את המגבר למחשב.

לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי של 30 מיליבר על קו האלקטרודה. קדם את האלקטרודה לאט לכיוון האקסון מפני השטח של הרקמה. מכיוון שהאלקטרודה קרובה לאקסון, הלחץ החיובי אמור לגרום לתנועה קלה אך מורגשת של האקסון בזמן שהאלקטרודה נמצאת ליד האקסון.

הקלט את הפעילות במהלך הצגת גירויי הבדיקה. למרות שחפץ חשמלי מאשר רישום וגירוי נאותים, לא אמורים להיות פוטנציאל פעולה. שחרר את הלחץ החוצה באלקטרודה וחזור על הגירוי וההקלטה.

לאחר מכן הפעל יניקה קלה הגורמת לאקסון לנוע לתוך האלקטרודה. חזור על הגירוי וההקלטה שוב. עכשיו אתם אמורים לראות כמה פוטנציאלי פעולה בתגובה לגירויים.

ברגע שפוטנציאל הפעולה נראה, סגור את קו הלחץ. לאחר השלמת כל ההקלטות הרצויות, החזר את מי המיכל לתמיסת הנשימה עם MS 2 22 במאה מיליגרם לליטר כדי להבטיח שהדג מורדם לחלוטין. אין לזהות EODC לפחות 10 דקות לפני המתת חסד של הדג.

להלן חמישה עקבות לדוגמה המראים את פוטנציאל הפעולה המעורר על ידי גירוי דופק רוחבי רוחבי חיובי של 0.1 מילי-שנייה של 0.1 מילי-שנייה לסנטימטר, והנה תרשים רסטר המציג את זמני הספייק במהלך 20 חזרות של חלון הקלטה של 75 אלפיות השנייה עבור אותה יחידה מגורה בזמנים אפס עם גירויים של שישה מילי-וולט לסנטימטר. טווח משכי הזמן מופיע מימין. מוצגת כאן עקומת כוונון משך הגירוי המכמתת את התגובות כעליות לכל חזרה על גירוי.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את הניתוח והזרקת הצבע המוצגים בטכניקה זו תוך שעה אחת אם הוא מבוצע כראוי, וניתן להתחיל הקלטות שעתיים עד שלוש לאחר הזרקת הצבע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב בקפידה אחר בריאות חיית הניסוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית שני פוטונים על מנת להקליט מתאי עצב במבני מוח עמוקים עוד יותר.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתייג ולתעד תגובות של יחידה אחת מאוכלוסייה מזוהה של נוירונים.