תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו בvivo

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקליט תגובות של יחידה בודדת in vivo מאוכלוסיית נוירונים מזוהה במערכת מודל שאינה גנטית. הדבר מושג תחילה על ידי ביצוע קרניוטומיה כדי לחשוף את אזור המוח הרלוונטי. השלב השני הוא שימוש בחוטי טונגסטן להחדרת צבע פלואורסצנטי לאזור אליו מקרינים הנוירונים המהווים את היעד.

לאחר מכן, הצבע מועבר בתובעת רטרוגרדית, דבר המוביל לסימון סלקטיבי של נוירוני ההקרנה. השלב הסופי הוא הקלטה מהאקסון המסומן של נוירון הקרנה בודד. בסופו של דבר, הקלטות חוץ-תאיות של יחידה בודדת משמשות כדי להראות כיצד נוירונים תחושתיים מרכזיים במעגל שלם מגיבים לגירוי התחושתי ב-evo.

שיטה זו יכולה לסייע במענה לשאלות מפתח בנוגע לאופן שבו מעגלים עצביים מזהים הבדלים של פחות ממילישנייה בתזמון של קלטים סינפטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא היכולת להתמקד בנורונים בודדים, או אפילו באקסונים ובמערכות שאינן נגישות גנטית. דגים חשמליים שבועיים משתמשים באותות חשמליים לתקשורת ולניווט.

הם מבחינים בין אותות מדגים שונים באמצעות הבדלים של פחות ממילישנייה בעיתוי של קלטים סינפטיים. שאלנו כיצד נוירוני משווה-הזמן המשוערים במעגל החושי החשמלי שלהם מסוגלים לזהות הבדלי תזמון קטנים שכאלה. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות, כגון מסלולים חושיים חזותיים ושמיעתיים.

קושי מיוחד קיים בניתוח נוזלים מתאים מתאים לתאים אלו בשל גודלם הקטן, השזירה הצפופה ברקמה הסובבת והטרמינלים הפרה-סינפטיים המכסים את רוב גוף התא. הזרקת צבע תוך-תאי במהלך הקלטה של תא שלם (whole cell recording) במערכת in vitro מסמנת תא בודד כדי להנחות הקלטות ממוקדות מאותו אקסון. באופן דומה, תובלה רטרוגרדית בעקבות הזרקת צבע חוץ-תאית מספקת אמצעי לסימון סלקטיבי של נוירוני השלחה באזורי מוח שטחיים.

ניתן להשתמש בכך כדי לספק הנחיה חזותית עבור הקלטות של יחידה בודדת (single unit recordings) in vivo. להכנת המחט המקודדת ב-D, ראשית בצעו השחזה אלקטרוליטית של תיל טנגסטן בקוטר 160 מיקרומטר עד לקוטר קצה מחט סופי של 5 עד 50 מיקרומטר. לאחר מכן, בלילה שלפני הניסוי, קודדו את קצה המחט באמצעות תמיסה 2 מילימולרית של Alexa floor dye המצומד לדקסטראן בעלות משקל מולקולרי של 10,000 כדי להשרות הרדמה כללית.

הניחו את הדג במי מיכל עם תמיסת MS 2 22 בריכוז של 300 milligrams per liter, והשקיעו את הדג במצב של חוסר תנועה ושתיקה חשמלית על ידי הזרקת 100 microliters של flail בריכוז של 3 milligrams per milliliter לשרירי הגוף הגביים. לאחר מכן, מלאו את תא ההקלטה במי מיכל והניחו את הדג כאשר צדו הבטני פונה כלפי מטה על הפלטפורמה במרכז התא. לאחר מכן, הגישו את תמיסת MS 2 22 המאווררת בריכוז של 100 milligrams per liter בקצב של 1 to 2 milliliters per minute באמצעות הנחת קצה פפית בפי הדג.

לאחר מכן, ייסבו את הדג באמצעות מוטות קיבוע ושמע על שני צידי הגוף. עקבו אחר מצבו הבריאותי של הדג על ידי בדיקת זרימת דם רציפה בכלי הדם העיניים וצבע גוף תקין. לאחר מכן, סובבו את הפלטפורמה סביב הציר האנכי.

כווננו קצה אחד של הפלטפורמה כך שצד אחד של השטח הגבי של ראש הדג יהיה חשוף מעל פני המים, בעוד ששאר גוף הדג יישאר טבול. הניחו פיסה קטנה של Kim wipe על כל חלק מהעור שאינו טבול כדי למנוע התייבשות. בהליך זה, מרחו 0.4% lidocaine על השטח החשוף של הראש באמצעות מקלון צמר גפן (Q-tip).

לאחר מכן, השתמשו בלהב סקלפל כדי לחתוך פיסת רקמת עור מלבנית בגודל של כ-3 מילימטרים על 5 מילימטרים עבור דג באורך 6.2 סנטימטרים. הקצה הלטרלי של המלבן צריך להיות מיושר למרכז העין. הקצה האנטריורי של המלבן צריך להיות מיד posterior לעין, והקצה המדיאלי של המלבן צריך להיות מיד לטרלית לקו האמצע.

לאחר מכן, הסר את המלבן באמצעות פינצטה. גזור ריבוע נוסף של 2.5 מילימטר קדמה כדי לחשוף את הגולגולת. נקה לחלוטין את פני השטח החשופים של הגולגולת על ידי גירוד כל רקמה עודפת באמצעות להב הסקאלפל.

לאחר מכן, ייבשו לחלוטין את הפני השטח באמצעות מגבון Kim ואוויר דחוס. בשלב הבא, הדביקו מוט מתכת לאזור הגולגולת החשוף הקדמי-מדיאלי באמצעות דבק מהיר. המתינו עד שהדבק יתייבש לחלוטין.

השתמש במקדח דנטלי עם ראש קרבאי כדורי בעקביות של 0.5 מילימטר כדי לשרטט מלבן של כשני מילימטרים על ארבעה מילימטרים על הגולגולת של דג באורך 6.2 סנטימטר. לאחר מכן, גזור את היקף המלבן בעזרת סקלפל ופינצטה. לאחר מכן, קלף את הגולגולת.

כדי לחשוף את המוח, גזרו הן את הקרומים העמיקים (dura mater) הפיגמנטריים והן את הקרומים הרכים (pia mater) השקופים באמצעות מספרי קפיץ או מחט. לאחר מכן, הסירו את החלקים הגזורים בעזרת פינצטה כדי לחשוף את הגרעין החוץ-צדי (extra lateral nucleus) הקדמי ואת הגרעין החוץ-צדי האחורי. כעת, מקמו זרוע מניפולטור עם מחט מצופה D שהוכנה מראש מעל אזור המטרה המכיל את האקסונים הרלוונטיים.

במקרה שלנו, יש להחדיר במהירות את המחט אל הגרעין הצדי החיצוני האחורי (posterior extra lateral nucleus) לעומק של כ-25 micrometers אל תוך הרקמה. לאחר שהצבע דיף במשך 15 עד 30 שניות, יש להסיג את המחט. חזור על הפעולה עם מחטים נקיות נוספות לפי הצורך.

מקמו כל אחד מהם במיקום שונה כך שהצבע יתפזר בכל רחבי אזור המטרה. לאחר מכן, שטפו את עודפי הצבע מהחלל באמצעות תמיסת היקמן רינגר (hickman's ringer solution) והמתינו לפחות שעתיים לספיגה והובלה של הצבע. כדי לדמיין את האקסונים הרלוונטיים, מקמו את תא ההקלטה עם הדג מתחת לעדשה של מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence microscope) בעל שולחן קיבוע אנכי.

החליפו את תמיסת הנשימה למי מכל טריים ושמרו על אותו קצב זרימה. לאחר מכן, הניחו קצה אחד של חוט ההארקה בחלל המוח החשוף וחברו את הקצה השני להארקה של ראש ההקלטה. לאחר מכן, הניחו זוג אלקטרודות הקלטה לצד בסיס הזנב.

לאחר מכן, חברו את האלקטרודות למגבר דיפרנציאלי ולמכשיר הקלטה. כדי לנטר את פקודת הפריקה של האיבר החשמלי (EODC), הכינו שרטוט בקנה מידה של אזור המוח כפי שנראה בהגדלה נמוכה, כולל כלי דם עיקריים שישמשו כנקודות ייחוס לזיהוי המיקום המדויק של אקסונים מסומנים. כדי לאשר תחילה את מיקום ה-D, התבוננו בכל הרקמה תחת תאורת שדה בהיר (brightfield) לצורך הת方向.

לאחר מכן, התבוננו בדגימה תחת תאורה פלואורסצנטית. הגרעין הלטראלי החיצוני האחורי (posterior extra lateral nucleus) אמור להראות סימון דיפוזי. לאחר מכן, תחת הגדלה גבוהה, אתרו את הגרעין הלטראלי החיצוני הקדמי (anterior extra lateral nucleus) באמצעות כלי הדם כנקודות ציון.

האירו אותו באור פלואורסצנטי תוך כדי חיפוש אחר אקסון מסומן סמוך לפני השטח, תוך שימוש בניתב זכוכית בורוסיליקט עם פילמנט, בעל קוטר חיצוני של 1 mm וקוטר פנימי של 0.58 mm. משוך אלקטרודת הקלטה בעלת גבעול צר באורך של 5 mm וקוטר קצה של כ-1 עד 2.4 µm.

מלאו את האלקטרודה בתמיסת היקמן רינגר (hickman's ringer) מסוננת. התנגדות הקצה הסופית צריכה להיות בטווח של 16 עד 155 mega ohms. מקמו את האלקטרודה במחזיק אלקטרודות עם פתח ללחץ.

חברו אותו למבנה הראש (head stage) המותקן על מניפולטור. לאחר מכן, חברו את מבנה הראש למגבר. התקן רכישת נתונים אנלוגי-לדיגיטלי, שאינו מוצג, מחבר את המגבר למחשב.

לאחר מכן, החל לחץ חיובי של 30 millibar בקו האלקטרודה. התקדם באיטיות עם האלקטרודה מפני השטח של הרקמה לעבר האקסון. כאשר האלקטרודה קרובה לאקסון, הלחץ החיובי אמור לגרום לתנועה קלה אך ניכרת של האקסון בזמן שהאלקטרודה נמצאת לצדו.

הקליטו את הפעילות במהלך הצגת גירויי הבדיקה. למרות שארטיפקט חשמלי מאשר הקלטה וגירוי תקינים, לא אמורים להופיע פוטנציאלי פעולה. שחררו את הלחץ החיצוני באלקטרודה וחזרו על הגירוי וההקלטה.

לאחר מכן, הפעילו שאיבה קלה שתגרום לאקסון להיכנס אל תוך האלקטרודה. חזרו על הגירוי וההקלטה פעם נוספת. כעת אתם אמורים לראות פוטנציאלי פעולה כתגובה לגירויים.

ברגע שפוטנציאלי פעולה נראים, סגרו את קו הלחץ. כאשר כל ההקלטות הרצויות הושלמו, העבירו את מי המכל בחזרה לתמיסת הנשימה עם MS 222 בריכוז של hundred milligrams per liter כדי להבטיח שהדג מורדם לחלוטין. לא אמור להיות זיהוי של EODC במשך 10 דקות לפחות לפני ביצוע ההמתה של הדג.

להלן חמישה דגימות של רישומים המראים את פוטנציאלי הפעולה שעוררו גירוי של פולס מרובע רוחבי חיובי קונטרלטרלי, חד-פאזי, בעוצמה של 6 millivolts per centimeter ובמשך 0.1 millisecond, וכאן מוצג תרשים רסטר המראה את זמני הפריקה (spikes) במהלך 20 חזרות של חלון הקלטה בן 75 millisecond עבור אותה יחידה שגורתה בזמן אפס בגירויים של 6 millivolts per centimeter. טווח המשכים מפורט מימין. כאן מוצגת עקומת כיוונון של משך הגירוי, המכמתה את התגובות כמספר פריקות לכל חזרה של הגירוי.

ברגע שהטכניקה נשלטת, הניתוח והזרקת הצבע המוצגים בשיטה זו יכולים להסתיים בתוך שעה אחת אם הם מבוצעים כהלכה, וניתן להתחיל בהקלטות שעתיים עד שלוש שעות לאחר הזרקת הצבע. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנטר בקפיאות את מצבו הבריאותי של בעל החיים הניסיוני בעקבות הפרוצדורה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון דימיון דו-פוטוני (two photon imaging), על מנת להקליט מנוירונים במבני מוח עמוקים עוד יותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מסמנים ומתעדים תגובות של יחידות בודדות (single unit responses) מאוכלוסייה מזוהה של נוירונים.