שימוש ברקמות תתבטלנה, קפואות ללמוד הפצת mucin טבעית

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשמר את ההתפלגות הטבעית של הגליקוזילציה בתוך רירית מופרשת בדגימות רקמה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הטמעה של הרקמות בתווך OCT (Optimal Cutting Temperature) כדי למזער את עיבוד הרקמה, ולאחר מכן כדי לאפשר זיהוי של מבני גליקן, מוצין ורירית. החתכים מדוגרים עם לקטינים, נוגדנים וצבעים היסטוכימיים.

ניתן לבחון באופן מעמיק יותר את קישור הלקטין באמצעות עיכוב תחרותי או פירוק אנזימטי של אפיתופים של גליקן כדי לאשר את ספציפיות קישור הלקטין. בסופו של דבר, ניתן להשוות את השימור של ריר ודגימות רקמה קפואות לשימור של ריר בדגימות טמיעות פאראפין באמצעות אנליזה כימית מיסטית. היתרונות המרכזיים של שימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טמיעת רקמה בפאראפין וקיבוע בתמיסת קרנאל, הם ששיטה זו אינה דורשת שימוש במקבעים מיוחדים ומאפשרת ניצול של רקמות קפואות שעשויות להיות קיימות כבר במעבדה.

ראשית, אפשרו לרקמה שהקפאה במהירות להגיע לטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס על ידי הנחתה בתא של קריו-מיקרוטום. בינתיים, הכינו אמבט הקפאה על ידי הוספת מתיל בוטאן לשוקית קלקר רדודה ולאחר מכן הוספת קרח יבש לשוקית. לאחר מכן, הוסיפו כמות מספיקה של OCT כדי לכסות את תחתיתו של תבנית הקפאה נתיקה, והניחו את הרקמה בתבנית.

וודאו שהרקמה נחה בתחתית התבנית בכיוון הרצוי. כסו את הרקמה בעוד OCT ולאחר מכן הניחו את התבנית באמבט ההקפאה. תרכובת ה-OCT תהפוך ללבנה ככל שהרקמה קופאת. לאחר ההקפאה, קלפו את התבנית מבלוק הרקמה הקפוא והניחו את הבלוק בשקית הקפאה מסומנת.

יש לאחסן את הבלוקים הקפואים בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש לפני חיתוך הרקמה. מקמו את הבלוקים הקפואים הרלוונטיים בתא המיקרוטום של הקריוסטט למשך כ-30 דקות כדי לאפשר להם להגיע לטמפרטורה של 20°C-. כאשר הבלוקים מגיעים לטמפרטורה המתאימה, חתכו נתח בעובי של 3 עד 5 µm ולאחר מכן הניחו על גבי הנתח תגית זכוכית טעונה חיובית.

הרקמה תיצמד לזכוכית לאחר ייבוש של הרקמות באוויר למשך 30 עד 60 דקות. קבעו את השקופיות בפורמלין buffered בריכוז 10% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS באמצעות 10 טבילות מהירות ב-250 milliliters של בופר. כדי לצבוע את הרקמות ב-aum. Blue, שטפו תחילה את השקופיות במים ולאחר מכן הדגרו אותן בחומצה אצטית בריכוז 3% למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, דגרו את הרקמות עם תמיסת AUM blue. לאחר 30 דקות, שטפו את השקופיות במי ברז זורמים במשך 10 דקות ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים (DI water). צבעו את הגרעינים בצביעה משלימה באמצעות nuclear fast red למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים במים מזוקקים (DI water). כעת בצעו דהידרציה והבהרה של השקופיות על ידי דגירה למשך דקה אחת ב-95% ethanol, ולאחריה שלושה החלפות מהירות ב-100% ethanol, ולאחר מכן שלוש החלפות ב-citrus resolve למשך שתי דקות כל אחת.

לבסוף, הצמידו זכוכית כיסוי למשטח הזכוכית באמצעות מדיום קיבוע כגון cyto seal 60 לצורך צביעת רקמות בשיטת periodic acid shift. ראשית, שטפו את משטחי הזכוכית במים ולאחר מכן דגרו אותם עם 1% periodic acid שהוכן טרי למשך חמש דקות. כעת, שטפו את משטחי הזכוכית שלוש פעמים במים מזוקקים (di water).

טבול את השקופיות פעם אחת במים מזוקקים (Milli Q) ולאחר מכן צבע את הרקמות באמצעות ש reagent שיוף (shiff reagent). לאחר 15 דקות, שטוף את השקופיות תחת מי ברז זורמים למשך 10 דקות נוספות ואז טבול אותן פעם אחת במים מזוקקים (DI water). בצע צביעה נגדית של הגרעינים באמצעות sgio metin למשך 30 שניות, ולאחר מכן שטוף את השקופיות שלוש פעמים במים מזוקקים (DI water).

לבסוף, דגרו את השקופיות למשך 30 שניות. שטפו שלוש פעמים נוספות במים מזוקקים (DI water) באמצעות תמיסת ה-bluing של Scot's tap water, ולאחר מכן בצעו דהידרציה לרקמות כפי שהודגם קודם לכן עבור צביעת calcium blue. הצמידו כיסוי זכוכית לשקופיות לצורך גילוי פלואורסצנטי של אפיטופים של גליקנים באמצעות לקטינים.

ראשית, חסמו את הזריחה באמצעות BSA ב-PBS למשך 10 עד 30 דקות. לאחר מכן, חסמו את הביוטין האנדוגני על ידי דגירה של הזריחה למשך 15 דקות עם avadon, ולאחר מכן שטיפה עם PBS, ודגירה נוספת של 15 דקות עם 0.01% biotin לאחר שטיפה נוספת עם PBS. הניחו את הזריחה בתוך קופסת צביעה, מרחו שכבה של תערובת לקטינים רצויים שהוכנה טרם השימוש על כל חיתוך רקמה, ולאחר מכן כסו בעדינות את תערובת הלקטינים ב-parfum.

כעת הדגירו את השקופית בחושך למשך שעה אחת. הסירו בעדינות את הפארפום ושטפו את השקופית שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, גרעו על השקופית strep avid ב-conjugated SCI five והדגירו אותה שוב בחושך למשך 30 דקות, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן צבעו את הגרעינים בצביעה נגדית עם dappy.

לבסוף, סגרו את הזריקה עם כיסוי זכוכית באמצעות מדיום מימי, כגון vector mount, עבור בקרת אנזים sase. התחילו בהוספת מים לתחתית של קופסת טיפים ריקה כדי ליצור תא לחות. הניחו את זריקות ביקורת השלילה כשהצד הפונה למעלה על המגש העליון של קופסת הטיפים.

הניחו 150 עד 200 microliters של תמיסת US על חיתוכי הרקמה, ולאחר מכן כסו כל זריקה בכיסוי זכוכית, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. סגרו את מכסה הקופסה והדגירו את הקופסה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים וחצי. שטפו את הזריקות שלוש פעמים ב-PBS בטמפרטורת החדר כדי להסיר חומצות סיליק חופשיות.

לאחר מכן, דגרו את השקופיות עם SNA למשך שעה בטמפרטורת החדר לצורך עיכוב תחרותי. העבירו מנה של 200 µL מתערובת הלקטינים לשני מבחנות einor. לאחר מכן, הוסיפו 200 mM של המעכב Jacqueline inhibitor Meli bios לאחת המבחנות, והוסיפו את המעכב SWGA inhibitor chitin hydrolysate בדילול של 1:10 למבחנה השנייה.

לאחר מכן דגרו את השקופיות עם התערובות המכילות את המעכב למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בדוגמת הרקמה באיור ראשון זה, חתכים של דגימות מעי גס של עכבר או תרנגולת, שהוקפאו ב-OCT או נטמנו בפראפין, נצבעו ב-periodic acid shiff בוורוד או ב-calcium blue בכחול. השוואה בין דגימות רקמה שנטמנו בפראפין לרקמות קפואות שנטמנו במדיית קריו-פרוטקטור OCT חשפה הבדלים בולטים בשימור ובאיכות הצביעה של גליקופרוטאיני מוצין ברקמות הקפואות.

בנוסף למוצין בתאי הגביע, רירית מופרשת הייתה גלויה גם היא, כפי שמוצג על ידי החצים ברקמות הטבולות בפרפין. צביעת הרירית הייתה מוגבלת לתאי הגביע. בדמות זו ניתן להבחין באובדן משמעותי של מוצין ושל רקמות שהובאו להדגרה ב-citrus resolve.

חתכים סדרתיים של דגימות קפואות של מעי אילאום של תרנגולת קובעו בפורמלין מתוחב 10% ונשמרו במצב הידרטי, הותשתו באתנול באמצעות דגירה רצופה באתנול בריכוזים של 70%, 90% ו-100% למשך 20 דקות כל אחת, או הותשתו באתנול ולאחר מכן עברו הבהרה באמצעות citrus all למשך שעה אחת. התשתו באתנול בלבד והתשתו באתנול בתוספת הבהרה ב-citrus all שיפרו את מורפולוגיית הרקמה. התשתו נוספת באתנול בלבד לא השפיעה באופן משמעותי על הצביעה בכחול.

בניגוד לכך, דגימה של הדרים לאחר אינקובציה הפחיתה והגבילה את הצביעה הכחולה לתאי הגביע בתבנית שהייתה דומה לזו שנצפתה ברקמות הטבולות בפראפין שראינו בדמות הקודמת. התיבות מציינות את האזורים בעלי ההגדלה הגבוהה יותר בחתכי רקמה הצבועים בכחול allium. בסדרת התמונות הבאה, מוצגים דגימות של איליאום (מעי אבטן) של תרנגולת שהוקפאו ב-OCT או טובלו בפראפין, ולאחר מכן סומנו באמצעות Jacqueline בכחול, SWG בירוק ו-SNA באדום ברקמות קפואות.

קישור של Jacqueline לגליקנים של olink חשף מבנים שנראו כנוזלים מתאי גובלט אל תוך הלומן, כפי שסומן בחצים בחתך רקמה שהוקפא ב-OCT. לעומת זאת, קישור של Jacqueline לרקמות שטומנו בפרפין היה מוגבל לתאי גובלט ולגבול המברשת של הסימנים (villi brush border) כפי שסומן בחצים אלו. צביעת SWGA של beta one four GL מראה קולוקליזציה חלקית עם הקישור של לקטין Jacqueline הן ברקמות קפואות והן ברקמות שטומנו בפרפין, כפי שסומן בחצים.

בניגוד לכך, לקטין SNA באדום ומסומן בראשי החיצים נקשר באופן תוך-תאי לחומצות סיאליות מקושרות ב-alpha two six ואינו מצטבר יחד עם Jacqueline, המופיע בכחול ומסומן בחצים המקווקוים בדמות זו. אפיתופים של חומצה סיאלית הוסרו מדגימות של מעי אילאום של תרנגולת על ידי עיכול של חיתוך הרקמה באמצעות US או הושארו ללא פירוק באמצעות דגירה ובופר סודיום אצטט, כפי שניתן לראות כאן. הטיפול ב-US ביטל את הצביעה עם SNA ביוטינילי, הנצפית ברקמה שלא טופלה, ובכך אישר את סגוליות הקישור של SNA לחומצות סיאליות.

ניתן לאשר את הסגוליות של הלקטין גם על ידי הוספת מעכב תחרותי, כגון mely bios עבור צביעת Jacqueline או הידרוליזאט של כיטין עבור צביעת SWGA. דגימות של מעי דק (ileum) של תרנגולת הובאו שוב להדגרה עם תערובת של Jacqueline ו-SWGA. הפעם הדבר נעשה גם בנוכחות מעכבי לקטין ספציפיים, mely bios או הידרוליזאט של כיטין. צביעת Jacqueline נעתקה על ידי mely bios, אך לא על ידי הידרוליזאט של כיטין. לעומת זאת, צביעת SWGA נעתקה על ידי הידרוליזאט של כיטין, אך לא על ידי mely bios.

סדרה סופית זו של תמונות מדגימה כי דגימות רקמה שהוקפאו במהירות, אשר משיגות באופן שגרתי במרפאות ובמעבדות מחקר, ניתן להטמיען במלואן ב-OCT ולהשתמש בהן להליכת גליקנים על מוצין, גליקופרוטאינים, גליקוליפידים וגליקנים. ביופסיות אלו של סרטן המעי הגס, מרקמות של קרצינומה וילוזית וקרצינומה רירית, הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי, הוטמעו ב-OCT ונצבעו בהצלחה עבור האפיטופים השונים של מוצין וגליקן שצוינו. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה של אופן הטמעת רקמות ב-OCT וכיצד לנתח גליקוזילציה של ריר ורקמה באמצעות שיטות אימונוכימיות.