המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח
6 במאי 2012
השיטה במהירות המארחות נדיפים מסך צמחים ידי מדידת התגובה של אלקטרו orangeworm הטבור מבוגר ( Amyelois transitella) אנטנות לרכיבים בודדים תערובות באמצעות ניתוח electroantennographic באה לידי ביטוי.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לסרוק במהירות מספר רב של חומרים נדיפים מצמחי מאכס כדי לבדוק פעילות ביולוגית פוטנציאלית. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף וניתוח של החומרים הנדיפים הרלוונטיים מצמחי המאכס באמצעות GCMS. לאחר מכן, הרכיבים הכימיים מזוהים ומאומתים.
השלב השלישי הוא סריקת הרכיבים הבודדים במספר חזרות מספיק לבדיקת פעילות ביולוגית באמצעות אנליזה אלקטרוגרפית. השלב הסופי הוא ניסוח והערכה של תערובות מרכיבים פעילים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לספק סדרה מקוצרת של רכיבים או תערובת רכיבים המוכנה להמשך חקירה במחקרים התנהגותיים עם החרק הרלוונטי.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מחקרים התנהגותיים הגוזלים זמן רב, הוא שסריקה מהירה באמצעות אנליזה אלקטרוגרפית מפחיתה משמעותית את מספר התרכובות שיהיה צורך לבחון במחקרים אחרים להדגמת פרוצדורה. האם MR Wage הוא טכנאי במעבדה שלי? ברגע שהחומרים הנדיפים הרלוונטיים זוהו באמצעות כרומטוגרפיית גז ומספקטרומטריית מסות, ניתן לבצע תחילה אנליזת אלקטרו-אייקונוגרפיה או EAG עבור כל חומר נדיף זמין.
עם זאת, יש להכין את החומרים הנדיפים הזמינים. הכין תמיסה של כל חומר נדיף ב-pentane בריכוז של 5 mg/mL במיכל שניתן לאטום היטב ולאחסן בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, הכן את פיפטות הגירוי.
סמנו 10 פיפטות פסטוריות עבור כל חומר נדיף ועטפו את הקצוות שלהן בחתיכה קטנה של Parafilm. 10 פיפטות מספיקות להעברת החומר הנדיף לכל מין בסינון מקדמי עם מספר חזרות נמוך. כעת, סדרו את שאר סט חמשת הפיפטות במעמד פיפטות והכניסו דיסקית לבדיקה ביולוגית לקצה הפתוח של כל פיפטה.
קפלו בעדינות דיסקית בעזרת פינצטה והניחו אותה באופן חלקי בקצה הרחב של הפ pipette כך ששני עד שלושה מילימטרים מהדיסקית יהיו חשופים. בעזרת pipetter או מזרק, טפטפו 10 µL של תמיסה נדיפה על כל דיסקית. חשוב ביותר לחשב, לנסח ולהכין את התמיסות בצורה מדויקת כדי להבטיח חזרות עקביות.
המתינו שתי דקות ולאחר מכן דחפו את הדיסקים באופן מלא אל תוך הפ pipette שלהם. לאחר הטעינה, אטמו מיד כל pipette באמצעות param. חזרו על הכנת ה-pipette עבור מספר החזרות הרצוי.
באמצעות אותו פרוטוקול, הכינו בקרת שלילית המכילה פנטנים בלבד ובקרות חיוביות, במקרה זה אצטופנון והורמון מיני. כעת המשיכו להכנת קרני התחושה של החרק.
בניסוי זה, קדם-מגבר מעביר את האות מאלקטרודת מזלג למכשיר רכישת ה-EAG. יש להגדיר את התוכנה המצורפת למכשיר ה-EAG באופן מתאים. הגדירו את ההגדרות על ידי קביעת קצב הדגימה ל-106.7 תחילה.
הגדירו את מתג ה-rectify למצב know והגדירו את המסנן לטווח של 0 עד 42 hertz תחת לשונית ה-filter. הגדירו את מסנן ה-EAG למצב on והגדירו את ה-low cutoff ל-0.1 hertz. לאחר מכן, שמרו את ההגדרות לקובץ קונפיגורציה לשימוש עתידי.
הפעלת התוכנה היא פשוטה כפתיחת קובץ פרויקט חדש, שמירתו תחת שם ספציפי והמשך להקלטה. סמל המשולש האדום מתחיל את תהליך ההקלטה ונשאר פעיל למשך זמן שנקבע מראש עבור כל נשיפה בודדת. כאשר כל הנשיפות לקרניות הושלמו, סמל ה-X השחור עוצר את ההקלטה כדי להקל על קריאה מדויקת של תגובות ה-EAG.
ניתן להדביק סרגל קטן על מסך המחשב בקו הבסיס של האות. התגובה נמדדת במילימטרים ולאחר מכן מומרת לאמפליטודה במיקרו-וולט. במידת הצורך, ניתן להשמיע או להריץ שוב את ההקלטות לצורך הערכה נוספת.
בדוגמה זו, נעשה שימוש בנמליות תפוזים (naval orange) זכרים ובנקבות שהזדווגו, בני שלושה עד ארבעה ימים. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה לחרקים אחרים. העבר כל חרק למכל פלסטיק קטן עם מכסה.
ביום הניתוח, רגע לפני הבדיקה הביולוגית, הכניסו את החרק אל הפתח הגדול של טיפ פפיטה, שפתחו הקטן מספיק רק כדי להכניס את ראשו. לאחר מכן, באמצעות טיפ פפיטה קטן יותר, דחפו בזהירות את החרק לכיוון הפתח הקטן עד שראשו יהיה חשוף תחת סטריאוסקופ. ודאו שהמחושים מקובעים בתוך צינור ההחזקה ושבסיס המחושים חשוף לצורך כריתה.
בשלב הבא, מקמו את מחזיק המזלג, שעליו שכבה דקה של ג'ל אלקטרודות, בסמיכות רבה לאנטנה. בעזרת מספרי מיקרו, הפרדו ולאחר מכן חתכו את שתי האנטנות, והפעילו טיימר כדי לתעד את הזמן שעבר בין אירוע זה לבין הגרייה הבאה. בעזרת כלי בעל קצה סיבי עם מעט ג'ל בקצהו, הרימו אנטנה אחת והניחו אותה על המזלג. ודאו שבסיס האנטנה מונח על אלקטרודת ההארקה הניטרלית (שאינה אדומה) של המזלג.
בצעו את הפעולה באופן דומה עבור האנטנה השנייה. הניחו את בסיס האנטנה באותו צד של המזלג, במרחק של שני עד שלושה מילימטרים מהאנטנה הממוקמת. קצצו את קצות האנטנה לפי הצורך.
מרחו ג'ל אלקטרודות על האלקטרודה בעזרת מברשת וודאו שבסיסן וקצותיהן טבולים בג'ל האלקטרודות, כך שלא יישארו בועות בתוך הג'ל. הימנעו מכיסוי החלק המרכזי של האנטנה בג'ל כדי למקסם את שטח הפנים של האנטנה החשוף לנפיחת החומרים הנדיפים. לאחר שההכנה קובעה כראוי בג'ל, חברו את המזלג למגבר המקדים של הפרובה.
כעת יש להזרים אוויר לח על גבי הדגימה כדי לשמור על חיוניותה של הכנה של מחוש. 10 דקות לאחר זמן הכריתה, יש להמשיך בהחלת הגירויים הראשונים. סדר הפעולות לגירוי דגימה מתחיל ומסתיים בביקורת חיובית, וביניהם גירוי ברצף אקראי של תרכובות ללא תרכובות זהות ברצף, ועם ביקורת שלילית אחת לפחות; מספר התרכובות המועברות למחוש משתנה בהתאם למין.
הכנה של עש תפוזים ימי (naval orange worm moth) יכולה להישאר פעילה במשך למעלה מ-30 דקות, מה שמאפשר ניתוח קל של עד 10 חומרים נדיפים במספר חזרות נמוך. אותו עיקרון של הובלת דגימות חל גם על סריקות עוקבות של תערובות תרכובות שנמצאו כמעוררות תגובות בסריקה הראשונית. יש להכין את פיפט הגירויים הראשונה 30 שניות לפני יישום נשיפת האוויר; יש להסיר את האטם של הפיפט ולמקם אותה במחזיק כך שזרימת האוויר תופנה למרחק של שני עד שלושה מילימטרים מהמחושים, 10 דקות לאחר חיתוך המחוש.
הנח את נפיחת הגירוי הראשונה במשך אחת עד שתיים שניות בקצב של 300 milliliters per minute. כעת, החלף במהירות את הפיפטה כך שהגירוי השני יונח דקה אחת לאחר הגירוי הראשון. שמירה על עקביות בין הדגימות תמזער את השונות בכמויות החומרים הנדיפים שננפחו בפועל.
לאחר מתן נפיחת בקרת החיובי האחרונה, הסר את האנטנה ונקה את המזלג. השתמש במטלית ספוגה באתנול והשאר אותה להתייבש לחלוטין לפני השימוש הבא. כדי להגדיל את תפוקת הבדיקות, על עוזר להכין את האנטנה הבאה עם מזלגים נקיים 10 דקות לפני סיום ההכנות הקודמות.
רצף הבדיקה: למתודה זו נדרש יותר מפיסוק אחד. לאחר כל ניסוי, יש להקרין את פרפרי המבחן בסביבת קרח יבש ולבצע נתיחה לפרפרים הנקבות כדי לבדוק את מצב ההזדווגות שלהם. יש להניח שהזכרים ששהו במקום עשויים היו להזדווג. הכנות לאנטנות של תולעת התפוז הניב (naval orange worm) עוררו באמצעות נשיפות של שני שניות, והקלטות של עשר שניות בוצעו בחלון של עשר שניות על סולם של 5 mV.
סטייה שלילית הייתה התגובה האופיינית. עם זאת, הערכים המוחלטים נרשמו. כל הדגימות מנקבי נקבות שהראו תגובה חלשה לבקרת החיובי נפסלו.
התגובה הממוצעת של שאר הדגימות הייתה 2,600 microvolts. באופן דומה, התגובה הממוצעת של הזכרים לבקרת ה-pH המינית הייתה בדרך כלל 3000 microvolts. לפיכך, דגימות עם תגובה נחותה מהסטנדרט נפסלו, ונתונים מאנטנות שהראו ירידה בתגובה במהלך הניסוי נפסלו אף הם.
פירוק התרחש אם תגובת ה-Anton לנשיפה של בקרת החיובי האחרונה הייתה נמוכה מ-75% מהנשיפה הראשונה של בקרת ה-pre-con, או נמוכה מהנשיפה השנייה של בקרת ה-pre-con עבור שאר ההרצות הניסוייות. ערכי התגובה נותחו על ידי לקיחת המדידות הגולמיות מכל הרצה והחסרת תגובת בקרת השלילה של אותה הרצה מכל ערך באותה הרצה. לאחר מכן, כל בקרות החיובי בכל הרצה חושבו כממוצע ותוקנו ל-1000 Microvolts, תוך רישום יחס התיקון ל-1000 microvolts עבור כל הרצה.
לאחר מכן, הערכים עבור התרכובות שנבחנו הוכפלו ביחס התיקון של הביקורת החיובית. לבסוף, התגובה המתוקנת הממוצעת של כל תרכובת שנבחנה על פני כל הרצות הניסוי הושוותה כדי להעריך את מידת התאמתה של כל תרכובת להמשך חקירה. זכרו כי עבודה עם כימיקלים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות מתאימים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לסריקה מהירה של חומרים נדיפים מצמחי מאכסן על ידי מדידת התגובות האלקטרופיזיולוגיות של מחושים של תולעת התפוזים הבוגרת (Amyelois transitella). הגישה משתמשת בניתוח אלקטרו-אנטנוגרפי להערכת רכיבים בודדים ותערובות של חומרים נדיפים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- אקולוגיה התנהגותית
- אקולוגיה כימית
רקע
- מרכיבים נדיפים מצמחי המאכס ממלאים תפקיד מכריע בהתנהגות חרקים.
- הבנת אינטראקציות אלו עשויה לסייע באסטרטגיות להדברת מזיקים.
- ניתוח אלקטרו-אנטנוגרפי מאפשר מדידה מדויקת של תגובות מחושי החרקים.
- שיטות סריקה מהירה יכולות להגביר את היעילות של מחקר ביולוגי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לסריקה של מספר רב של חומרים נדיפים מצמחי מאכס.
- זיהוי רכיבים כימיים שעשויים להשפיע על התנהגות חרקים.
- הערכת תערובות של רכיבים פעילים להמשך חקירה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף וניתוח של חומרים נדיפים מצמח המאכיל באמצעות GCMS.
- זיהוי ואימות של רכיבים כימיים.
- ניתוח אלקטרו-אנטנוגרפי להערכת הפעילות הביולוגית של רכיבים בודדים.
- ניסוח והערכה של תערובות של רכיבים פעילים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של רכיבים נדיפים מרכזיים.
- הדגמה של תגובות אלקטרופיזיולוגיות הן לרכיבים בודדים והן לתערובות.
- אספקת סדרה מקוצרה של רכיבים למחקרים התנהגותיים נוספים.
- התוצאות מצביעות על פוטנציאל לאסטרטגיות ממוקדות להדברת מזיקים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת סריקה יעילה של חומרים נדיפים.
- תגובות אלקטרופיזיולוגיות יכולות להנחות מחקרים עתידיים על התנהגות חרקים.
- נדרשת חקירה נוספת של הרכיבים שזוהו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר של חומרים רטריים נדיפים ופעילים ביולוגית מצמחים הוא קריטי להפחתת סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים של חומרי הדברה לחרקים ולאופטימיזציה של הקצאת משאבים בשרשראות הפיתוח של כימיקלים חקלאיים ואמצעי בקרה ביולוגית. בדיקה ביולוגית אלקטרו-אנטנוגרפית מאפשרת סריקה רחבה של חומרים נדיפים מועמדים, ובכך תומכת בוודאות ניבויית בבחירת תרכובות למחקרי התנהגות ויעילות המשכיים. גישה זו מייעלת את תהליך מיון הפורטפוליו על ידי התמקדות בחומרים נדיפים שהוכח כי הם מפעילים רצפטורים, ובכך מפחיתה מעקב מיותר אחר מועמדים שאינם פעילים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של מסלולי חישה כימית בין צמחים לחרקים לצורך תיקוף מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי זיהוי חומרים נדיפים המעוררים תגובות מדידות בממ常用的משי.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מועמדים למחקרי התנהגות ומחקרי שדה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מנקב את אספקת החומרים הנדיפים ואת מדידת התגובה כדי להבטיח תוצאות סריקה הניתנות לשחזור.
- מפחית את מספר התרכובות המועברות לבדיקות התנהגותיות עתירות עבודה.
- מספק נתונים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים להערכת מוכנות הבדיקה ותיעדוף תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את בחירת המועמדים עם נקודות קצה תרגומיות על ידי התמקדות בחומרים נדיפים עם הפעלה מאושרת של המחושים.
- תומכת ברצף מהסריקה in vitro עד לתיקוף התנהגותי in vivo במחקרים לניהול מזיקים.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים של חומרים נדיפים בעלי ראיות מכניסטיות לפעילות ביולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת סריקה אלקטרו-אנטנוגרפית זו מתאימה לממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך היא מגשרת בין ניתוח כימי לתיקוף התנהגותי ברצף המחקר והפיתוח של חומרי הדברה.
- ביולוגיה של הגילוי: מספקת פלטפורמה לבחינת היפותזות של אינטראקציות בין חומרים נדיפים של צמחים לחרקים ולהבהרה של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך מיון תרכובות ופיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות אלקטרופיזיולוגיות המאפשרות השוואה ישירה בין חומרים נדיפים מועמדים ותערובות שלהם.
- מחקר תרגומי: מסייעת בבחירת חומרים נדיפים למחקרי התנהגות ויעילות פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה סטנדרטי וניתן להרחבה, הניתן להתאמה למערכות מגוונות של חרקים וצמחים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבחירת חומרים נדיפים.
- ערך תפעולי: משפר את התפוקה, הסטנדרטיזציה והשחזוריות של סינון בשלב מוקדם.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מיקוד משאבים במועמדים מאושרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון וקידום של חומרים נדיפים עם פעילות ביולוגית מוכחת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, אנליזה כימית וטיפול בחרקים.
- דורש מכשור ייעודי להקלטת EAG ולהגשת חומרים נדיפים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת של בקרות, חזרות ונורמליזציה של נתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למערכות אחרות של חרק-צמח באמצעות שינויים בפרוטוקול, כפי שנתמך במקור.
- מוגבל להפעלת קולטנים; יש לאשש את הרלוונטיות ההתנהגותית בבדיקות המשך.
