Name: שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למד שיטת לכידת חלבונים בנוזל באמצעות חרוזים מגנטיים מצופי קובלט לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. השיטה מספקת תוצאות כמותיות אמינות לחלבונים רגישים להמרת קונפורמציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לצוות המחלקה לביוטכנולוגיה התרופות לביולוגיה מולקולרית ובמיוחד מוניק דה Pelsmacker להכנת וירוס מסומן רדיואקטיבית. אנו מודים אלן Merckx ו Hadewych Halewyck על דבריו המעניינים שלהם ודיונים וכדי חריט דה Bleeser על עזרתו במעבדה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק של OZR מהאוניברסיטה Vrije בריסל (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (G.0168.10N) ואת ארגון הבריאות העולמי (ה-TSA 200410791). ליזה Schotte הוא עמית predoctoral של Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (FWO).

העיקרון (A) סקירה של השיטה (ב &#39;) מתוארים באיור 1. 1. הכנת מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקידת / Wash חיץ ידי המסת סודיום פוספט dihydrogen (50 מ&quot;מ), סודיום כלוריד (300 מ&quot;מ) במים ולהתאים את ה-pH ל 8.0. בנוסף להוסיף Tween 20 (0.01% (מ &#39;/ V) הריכוז הסופי), מתיונין (2% (m / v) ריכוז סופי) ו אלבומין (0.1% (ז / נ) הריכוז הסופי) ולהתאים את עוצמת הקול הנדרשת. </li></ol> 2. הכנת החרוזים מגנטיים הכינו את החרוזים מגנטי על פי להוראות במדריך. בקצרה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים מגנטי באמצעות מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה, עבור מדגם זה, 10 μl של חרוזים מגנטיים resuspended (40 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים מגנטי באמצעות מגנט, עד supernatant ברור (+ / - 30 שניות) ולהסיר supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אתחרוזים מגנטיים פעמיים: resuspend את החרוזים ב μl 150 של המאגר המאוחד / Wash. להעביר את החרוזים מגנטי לצד אחד של הצינור באמצעות מגנט עד supernatant ברור ובזהירות להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 40 μl של המאגר המאוחד / Wash, עבור מדגם זה, כדי resuspend את החרוזים (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li></ol> 3. זיקה Assay לכידת הערה: כדי למדוד את הקרינה (הקוסמית) הרקע (0% רדיואקטיביות), אין וירוסים radiolabeled נוסף מדגם שליטה 1. במקום זאת, נפח אותו איגוד / Wash חיץ נוסף. הערה: רדיואקטיביות 100% מוגדר על ידי 2 השליטה מדגם שבו כל הרכיבים פרט נוסף Nanobody. במקום זאת, נפח אותו איגוד / Wash חיץ נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא 2000 עותקים לדקה של 35 שכותרתו S (β-קרינה) poliovirus סבין זן מסוג 1, 9, מדולל המאגר המאוחד / רחצה μl 80 לתוך צלחת 96-גם microtiter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 &amp; MU, L של דילול Nanobody על וולס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 10 שניות באמצעות שאכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר דגימות כדי לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של ההשעיה חרוזים שטף מגנטי דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, תחת ברציפות רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את חרוזים supernatant באמצעות מגנט ולהעביר supernatant פינה לתוך הצינור. </li></ol> 4. מדידה של רדיואקטיביות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 50 μl של supernatant משלב 3.6 לתוך הבקבוק לספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של נוזל נצנץ ומערבבים. מדוד את הרדיואקטיביות ב counter-β נצנץ. </li></ol> 5. מיחזור החרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים מגנטיים המשמשים בתוך צינור ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 2 דקות או עד supernatant ברור מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 6 מ&quot;ל 0.5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה כדי multiplדואר צינורות דגירה באמבטיה קולי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מגנטים לאסוף את החרוזים מגנטיים ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 2% SDS-פתרון צינור כל resuspend באמצעות מערבולת. מרתיחים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים ולהסיר supernatant. Resuspend החרוזים של 1 מ&quot;ל 0.2 M EDTA (pH = 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות באמבטיה קולי במשך 5 דקות ושוב, להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מים בצינור כל resuspend את החרוזים. לאסוף את החרוזים ולהסיר supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים בכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 1 מ&quot;ל 10 הפתרון CoCl 2 מ&quot;מ. לשים על שייקר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות מגנט לאסוף את החרוזים ואת resuspend מ&quot;ל 1 מתוך המאגר המאוחד / Wash. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים באמצעות 1 מ&quot;ל של 20% (V / V) אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים בכמות המקורית של 20% (V / V) ethanol להשיג חרוזים שהתחדשו בריכוז של 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> 6. הפרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימת בקרה 1, בו לא וירוס radiolabeled נוסף, ישמש לתיקון רדיואקטיביות רקע כדי לקבוע את ערך רדיואקטיביות 0%. דגימת בקרה 2, אשר אינו מכיל Nanobody והיכן ולכן כל וירוס radiolabeled נשאר supernatant, מוגדר כערך רדיואקטיביות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור הרדיואקטיביות ב supernatant (=%) הוא מדד של כמות המשקעים הכוללת (= 100 -%) של הנגיף radiolabeled ידי Nanobody. </li></ol> 7. נציג תוצאות התוצאות מייצגות עבור assay זה לכידת זיקה מוצגים איורים 2, 3 ו -4. באיור 2, הזיקה של PVSS38C, ספציפית עבור Nanobody poliovirus, יוצג. הזיקה של PVSS38C נבדק במשך שלושה אנטיגנים שונים של poliovאירוס הארגמן: אנטיגן Native-(N-אנטיגן), אנטיגן מחוממת-(H-antigen) ו יחידות משנה 14S. N-האנטיגן הוא וירוס ללא פגע, כי הוא מדבק. כאשר הנגיף מחומם (20 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) או מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), קונפורמציה השינויים קפסיד, וכתוצאה מכך אובדן (חלקי) של RNA נגיפיים חלבון capsid VP4, וריק capsids נוצרים אשר נקראים כך H-אנטיגנים. יחידות משנה 14S הם ביניים הרכבה. אנטיגנים אלה מוכרים על ידי קבוצות שונות של נוגדנים לאחר חיסון 10 ובעלי אפיטופים שונים ולכן ואתרי אנטיגני. באיור אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nanobody. ניתן לראות כי בשנת supernatant הרדיואקטיביות של דגימות המכילות יחידות משנה 14S radiolabeled יורדת עם ריכוזים עולים של PVSS38C Nanobody. זה יכול להיות מתורגם כ גידול בסך של poliovirus 14S קון יחידות משנהnected כדי PVSS38C Nanobody ובעקיפין על חרוזים מגנטיים. Titer לכידת (= ריכוז Nanobody צורך ללכוד 50% של הנגיף radiolabeled) ניתן לחשב באופן גרפי כפי 0.099 ננומטר. אין זיקה של PVSS38C עבור אנטיגני-N ו-H-אנטיגני צורה של poliovirus הוא ציין. מנתונים אלה הוא מפורש כי PVSS38C מקיימת יחסי גומלין עם epitope כי קיים אך ורק על למקטע 14S ולא על שתי צורות אחרות של אנטיגני poliovirus. על מנת להוכיח כי אובדן הרדיואקטיביות supernatant רק בשל זיקה מסוימת של Nanobody כלפי אנטיגנים שלו, אותו assay בוצע Nb1, Nanobody שנוצר נגד הרגולטור תעתיק lrpB של sulfataricus Sulfolobus וידוע אין אינטראקציה עם כל אנטיגן poliovirus. התוצאה של assay זה מוצגת באיור 3. כל וירוס radiolabeled נשאר את supernatants מראה כי אין תגובתיות שלNb1 נגד שלוש צורות אנטיגני של poliovirus. שחזור של התוצאות נבדק על ידי חזרה על הניסוי עבור סכום כולל של פי שמונה על 1 Nanobody נתון (כלומר, PVSP29F) בשעה בימים שונים ועל ידי אנשים שונים. התוצאות מוצגות באיור 4. הערך הממוצע של רדיואקטיביות אחוז supernatant חושב על ריכוז כל Nanobody והיא מיוצגת התכתבות עם סטיית התקן שלה. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה כללית של עקרון (א &#39;) והשיטה (ב) assay. א &#39;שלו מתויג Nanobodies ספציפית לזהות אנטיגן poliovirus מסוימת יוכלו לתקשר עם קובלט מצופים חרוזים מגנטיים יהיה להאיץ את הנגיף שכותרתו רדיואקטיבית. Nanobodies ב &#39;שלו מתוייגים נוספים poliovirus מסומן רדיואקטיבית ו מודגרות. קובלט מצופים חרוזים מגנטיים הםנוסף והפרדה המגנטי של אנטיגן / מאוגד מאוגד מתבצע. הרדיואקטיביות של supernatant נמדד כמות האנטיגן בשבי ניתן לגזור. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> איור 2. זיקה חרוזים מגנטי לכידתו של אנטיגנים שונים poliovirus ידי Nanobody PVSS38C. אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של PVSS38C. עבור 14S יחסים ריכוז התגובה ניתן למצוא, מראה את האינטראקציה של PVSS38C עם epitope כיום באופן בלעדי על 14S. ללא אינטראקציה משמעותית עם N-ולא H-אנטיגן ניתן להבחין, אם כי זניח שאינו ספציפי לכידת בריכוזים גבוהים מאוד, הוא הבחין. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> איור 3. זיקה חרוזים מגנטי לכידתו של אנטיגנים שונים poliovirus ידי Nanobody Nb1 </stronז&gt;. אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nb1. Nb1 ידוע אין אינטראקציה עם האנטיגן-poliovirus או-למקטע. מאז 100% של קרינה רדיואקטיבית נמצא supernatant, הווירוס לא היה כבול לא במיוחד כדי Nb1. אובדן רדיואקטיביות באיור 2 ולכן רק בשל זיקה מסוימת של Nanobody כלפי אנטיגנים שלה. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> באיור 4. שחזור של assay. הערך הממוצע של רדיואקטיביות אחוז supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nanobody. הניסוי חזר על עצמו שמונה פעמים בימים שונים ועל ידי אנשים שונים. סטיית התקן מיוצג קווים אנכיים.

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

בפרוטוקול, רדיואקטיביות של אנטיגן אינטראקציה עם Nanobody מוגדר כאובדן של וירוס radiolabeled מ supernatant. לכן כמות רדיואקטיביות זירז (= 100 -%) (חייב את החרוזים מגנטיים) ניתן להעריך בצורה עקיפה על ידי רדיואקטיביות ב supernatant (=%). מצד שני, אפשר גם למדוד את הרדיואקטיביות של חלק כרוך זירז של האנטיגן באופן ישיר על ידי משחררי את immunocomplexes מן חרוזים מגנטיים עם 500 מ&quot;מ imidazole. זה הודגם בעבר 11 כי יש התאמה מושלמת בין הסכום הכולל של רדיואקטיביות, וסכום של קרינ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads תג שלו בידוד הנפתח</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; חרוזים מגנטיים</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; &quot;HiSafe&quot; Optiphase 2</td&gt;<td&gt; פרקין אלמר</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; נוזל נצנץ</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

שלב נוזלי זיקה לכידת assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-nanobody

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. ובלבד חלבון אחד יכול להיות מתויג חלבון אחר הנקרא, שיטה זו יכולה להיות מיושמת לחקירת אינטראקציות בין חלבונים. היא מבוססת מצד אחד על ההכרה של חלבון מסומן על ידי קובלט חרוזים מגנטיים מצופה ומצד שני על יחסי הגומלין בין חלבון מתויג חלבון מסוים 2, כי הוא מסומן. ראשית, חלבונים שכותרתו מתויג מעורבבים ו מודגרות בטמפרטורת החדר. חרוזים המגנטי, המזהים את תג מתווספות ואת חלק כפות של חלבון הנקרא מופרד חלק מאוגד באמצעות מגנטים. כמות של חלבון הנקרא, כי הוא נתפס ניתן לקבוע באופן עקיף על ידי מדידת אותות של חלבון הנקרא נשאר חלק לא מאוגד. בשלב תיאר נוזל assay זיקה מאוד שימושי כאשר חלבונים המרה קונפורמציה רגישים בתחתעאייד. פיתוח ויישום של assay באה לידי ביטוי לאינטראקציה בין poliovirus ו poliovirus הכרה Nanobodies 1. מאחר שנגיף הפוליו רגיש המרה קונפורמציה 2 כאשר מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), שימוש ELISA מוגבלת ומערכת שלב נוזלי מבוסס לפיכך יש להעדיף. דוגמה של מערכת השלב נוזלי מבוסס בדרך כלל משתמשים בו polioresearch 3,4 הוא חלבון מיקרו-immunoprecipitation הבדיקה 5. אף על פי בדיקה זו הוכיחה את ישימותה, זה דורש FC-מבנה, אשר נעדרת את Nanobodies 6,7. עם זאת, הזדמנות נוספת, מעניינת ויציבה האלה יחיד תחום נוגדנים 8 יכול להיות מהונדסים בקלות עם תגים שונים. בשימוש נרחב (שלו) 6 תג מראה זיקה יונים דו ערכי, כגון ניקל או קובלט, אשר יכול על לתורם להיות מצופה בקלות על חרוזים מגנטיים. לפיכך, אנו פיתחו את זה כמותית פשוטהלכידת assay זיקה על בסיס קובלט חרוזים מצופים מגנטיים. Poliovirus סומן עם S 35 כדי לאפשר אינטראקציה עם Nanobodies באין מפריע ולעשות גילוי כמותי ריאלי. השיטה קלה לביצוע, ניתן להקים עם עלות נמוכה, אשר נתמך גם על ידי האפשרות של התחדשות ביעילות את החרוזים מגנטיים.

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

במאמר זה מוצגת בדיקת לכידה זיקתית פשוטה וכמותית בפאזה נוזלית. בתנאי שניתן לתייג חלבון אחד וחלבון אחר...

פרוטוקול זה משתמש באינטראקציה בין poliovirus לבין nano bodies המזהים Poliovirus כדי להדגים בדיקת לכידה בזיקה פשוטה בשלב נוזלי (liquid phase affinity capture assay) כמותית. באופן עיקרי, נעשה שימוש בחרוזים מגנטיים מצופים בקובלט כדי להשקיע חלבונים מתויגים, כמו גם חלבונים בעלי סימון רדיואקטיבי המקיימים אינטראקציה איתם. ראשית, ערבב את החלבונים המסומנים והמתויגים והדגר בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו חרוזי מגנט הזיהוי של התג, והפרידו את הפראקציה הקשורה של החלבון המסומן מהפראקציה שאינה קשורה באמצעות מגנטים. לאחר מכן, מדדו את האות של החלבון המסומן שנמצא בפראקציה שאינה קשורה וקבעו את כמות החלבון המסומן שנמצאה בה. תוצאות מבדיקת זיקה זו בשלב הנוזלי (liquid phase affinity assay) שימושיות ביותר כאשר נבדקים חלבונים הרגישים לשינוי קונפורמציונלי.בדיקת לכידה זיקית (affinity capture) בשלב נוזלי זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציה בין נאנו-נוגדנים (nanobodies) המזהים את נגיף הפוליו לבין אנטיגנים שונים של נגיף הפוליו. ניתן להחיל שיטה זו גם על אינטראקציות חלבון-חלבון אחרות, בתנאי שניתן לסמן חלבון אחד ולזהות את השני. פיתחנו את השיטה הזו כאשר היינו מעוניינים לחקור את האינטראקציה בין נאנו-נוגדנים המזהים את נגיף הפוליו לבין אנטיגנים שונים של נגיף הפוליו.מאחר שנגף הפוליו רגיש לשינויים קונפורמציונליים כאשר הוא נקשר למשטח מוצק, השימוש ב-e LSA מוגבל. לכן, יש להעדיף מערכת המבוססת על פאזה נוזלית. דוגמה למערכת כזו המבוססת על פאזה נוזלית ונפוצה במחקר של נגף הפוליו היא המיקרו-פרוטאין.בדיקת שיקיפה חיסונית (immunoprecipitation). אף על פי שבדיקה זו הוכיחה את ישימותה, היא דורשת את המבנה הגבישי של נוגדן קונבנציונלי, שאינו קיים בננו-גופים (nanobodies). ננו-גופים אלו, שהם נוגדנים בעלי דומיין יחיד מעניינים ויציבים מאוד, ניתנים להנדסה בקלות עם טקסטים שונים.הוא נמצא בשימוש נרחב. ה-stack מראה זיקה ליוןים דו-ערכיים, כגון ניקל וקובלט, אשר בתורם ניתן לצפות בהם בקלות על חרוזי מגנט. לפיכך, פיתחנו בדיקת לכידה זיקה כמותית פשוטה המבוססת על חרוזי מגנט מצופים בקובלט.ערבבו את מלאי החרו지를 המגנטיים באמצעות וורטקס והעבירו 10 µL עבור כל דגימה לתוך מבחנה. השקיעו את החרוזים באמצעות מגנט. הסירו את supernatant השקוף כדי לשטוף את החרוזים. הוסיפו 150 µL של binding buffer.אספו את החרוזיים באמצעות מגנט והסירו את העל-נוזל לאחר שטיפה שנייה. השביו את החרוזיים ב-40 µL של תמיסת קישור (binding buffer) עבור כל דגימה ובקררה. עבור הרקע בדגימה אחת, הכינו באר ללא נגיף מסומן רדיואקטיבית, אך עם נפח שווה של תמיסת קישור עבור הבקרה.דגמו שתיים של 100% פעילות רדיואקטיבית. הוסיפו את כל הרכיבים לבאר, אך החליפו את הנוגדן הננו-גופי (nano body) בתמיסת קישור (binding buffer). כעת הוסיפו לכל הדגימות 2000 ספירות לדקה (counts per minute) של פוליווירוס גזע 7 סוג 1 המסומן ב-S 35, בנפח כולל של 80 µL של תמיסת קישור.קבלו את הביקורת. דגימה אחת. הוסיפו 10 µL מדילול של ה-nano body לכל דגימה.ערבבו היטב במשך 10 שניות על שייקר והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של תרחיף חרוזי המגנט השטופים והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת ניעור רציף, השקיעו את החרוזים באמצעות מגנט והעבירו את הנוזל העליון (supernatant) הצלול למבחנה למדידת הרדיואקטיביות של כל דגימה, העבירו 50 µL מהנוזל העליון לבקיר ספירה. הוסיפו 3 mL של תערובת נוזל סינקיליציה ומדדו במכשיר הסינקיליציה.בצעו שטיפה של החרוזיים המגנטיים המשומשים בתוך מבחנה באמצעות מים, וסובבו בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך שתי דקות. השליכו את העליון ותלו את החרוזיים מחדש ב-6 mL של sodium hydroxide בריכוז 0.5 M. לאחר מכן, חלקו את התרחופה למספר מבחנות והדגירו אותן באמבט אולטרסוני למשך חמש דקות.לאחר שקיעת החרוזיים באמצעות מגנט והסרת הנוזל העליון, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת 2% SDS לכל מבחנה, ולאחר מכן ערבבו באמצעות וורטקס וניעור במשך חמש דקות. כעת, אספו את החרוזיים. הוסיפו מיליליטר אחד של 0.2 molar EDTA ב-pH 7 לכל מבחנה, והדגירו את המבחנות באמבט אולטרסוני במשך חמש דקות.לאחר מכן אספו את החרוזיים, שטפו את החרוזיים עם 1 ml של מים שלוש פעמים, ולאחר מכן עם 1 ml של תמיסת cobalt chloride בריכוז 10 mM. הניחו את המבחנות על שייקר למשך 10 דקות. המשיכו לאסוף את החרוזיים באמצעות מגנט והשביו אותם לתמיסה (resuspend) ב-1 ml של binding buffer.שטפו פעמיים ב-1 mL של 20% Ethanol ובסוף השביו את החרוזים לנפחם המקורי של 20% ethanol כדי לקבל חרוזים מחודשים בריכוז של 40 mg/mL. תקנו את רעש הרקע הרדיואקטיבי על ידי הגדרת ביקורות: דגימת ביקורת אחת כערך של 0% רדיואקטיביות ודגימת ביקורת שנייה כערך של 100% רדיואקטיביות.כעת, עבור כל דגימה, חשבו את אחוז הרדיואקטיביות בסבננט (supernatant) כמדד להשקעה הכללית של הווירוס המסומן רדיואקטיבית על ידי הננו-בדי (nanobody). ניסוי זה מעריך את זיקת ה-PVSS 38 C ונוגדן ספציפי לפוליווירוס תוך שימוש בשלושה אנטיגנים שונים של פוליווירוס: אנטיגן טבעי, אנטיגן מחומם ותתי-יחידות 14 s. באופן מעניין, הרדיואקטיביות בסבננט של הדגימות המכילות תתי-יחידות 14 s המסומנות רדיואקטיבית פוחתת עם עליית הריכוזים של הננו-בדי PVSS 38 C. דבר זה מעיד על עלייה בכמות תתי-היחידות 14 s של הפוליווירוס המחוברות לננו-בדי PVSS 38 C, ובאופן עקיף, לחרו지를 המגנטיים.מכיוון שלא נצפתה זיקה של pvs S 38 C לצורה האנטיגנית N ולצורה האנטיגנית H של פוליווירוס, נראה כי הננו-בודי (nano body) ספציפי לתת-היחידה 14 s של הפוליווירוס. הזיקה של הננו-בודי לאנטיגנים שלו, כפי שנמדדה בשיטה זו, היא ספציפית בדומה לננו-בודי שאינו קשור. NB one אינו מראה תגובתיות נגד שלוש הצורות האנטיגניות של הפוליווירוס.מערכת זו מניבה הדירות גבוהה, כפי שמוצג בעקומת תגובה למינון זו שהופקה על ידי חוקרים שונים בימים שונים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע בדיקת לכידה באמצעות זיקה במופע נוזלי אמינה זו בתוך שעתיים, כולל מיחזור החרוזיקים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן השימוש בבדיקת לכידה בזיקה במופע נוזלי המבוססת על חרוזיקים מגנטיים בעת חקר האינטראקציה בין חלבונים שונים, במיוחד כאשר לא ניתן להשתמש במערכות המבוססות על מופע מוצק.

a-liquid-phase-affinity-capture-assay-using-magnetic-beads-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף...

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש"פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת משקעים חיסוניים, הנקראת בדיקת לכידת VLP, כדי לבודד חלקיקים דמויי וירוסים המציגים אנטיגן, או VLPs, מדגימה. האנטיגן נקשר עם נוגדנים ספציפיים הקשורים לחרוזים מגנטיים, ויוצר קומפלקס נוגדנים אנטיגן משותק המופרד מאוחר יותר ומאוחסן לניתוח נוסף.

בדיקת לכידת החלקיקים דמויי הנגיף: שיטה לבידוד VLPs המציגים אנטיגן מדגימה באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים מנטרלים

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

כאן, אנו מתארים בדיקה חיסונית פלואורסצנטית מרובת מרבבים שפותחה לאחרונה המשתמשת במערכת ציטומטרית זרימה דו-מדווחת כדי לזהות בו זמנית שני אפיטופים ייחודיים של חלבון ספייק על חלקיקים נגיפיים שלמים של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) שנלכדו על ידי מיקרוספרות מגנטיות מצומדות אנזים 2-2 הממירות אנגיוטנסין.

יצירת פרופיל של אפיטופים של חלבון פני השטח על חלקיקים נגיפיים על ידי אסטרטגיית Multiplex Dual-Reporter

למד שיטת לכידת חלבונים בנוזל באמצעות חרוזים מגנטיים מצופי קובלט לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. השיטה מספקת תוצאות כמותיות אמינות לחלבונים רגישים להמרת קונפורמציה.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

גלה סרטונים נוספים