שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

פרוטוקול זה משתמש באינטראקציה בין נגיף הפוליו לנגיף הפוליו, ומזהה גופי ננו כדי להדגים בדיקה פשוטה של לכידת זיקה לשלב נוזלי. בעיקר חרוזים מגנטיים מצופים קובלט משמשים למשיכת חלבונים מתויגים כמו גם כל חלבונים המסומנים ברדיו הפועלים באינטראקציה. ראשית, מערבבים את החלבונים המסומנים והמתויגים ודוגרים בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הוסף חרוזים מגנטיים המזהים את התג, הפרד את החלק הקשור של החלבון המסומן מהחלק הלא קשור באמצעות מגנטים. לאחר מכן מדוד את האות של החלבון המסומן שנמצא בשבר הלא קשור וקבע את כמות החלבון המסומן שנמצא בשבר הלא קשור. תוצאות מבדיקת זיקה זו של פאזה נוזלית שימושיות ביותר כאשר נבדקים חלבונים רגישים להמרה אישורית.

בדיקת לכידת זיקה לשלב נוזלי זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציה בין נגיף הפוליו, זיהוי ננו בואים ואנטיגנים שונים של נגיף הפוליו. ניתן ליישם את השיטה גם על אינטראקציות חלבון אחרות בתנאי שניתן לסמן חלבון אחד ולזהות את השני. היה לנו לראשונה את המזהה לשיטות אלה כאשר התענייננו בחקירת האינטראקציה בין נגיף הפוליו, זיהוי גופי ננו ואנטיגנים שונים של נגיף הפוליו.

מכיוון שנגיף הפוליו רגיש להמרה אישורית, כאשר הוא מחובר למשטח מוצק, השימוש ב-e LSA מוגבל. לכן יש להעדיף מערכת מבוססת פאזה נוזלית. דוגמה למערכת מבוססת פאזה נוזלית כזו המשמשת לעתים קרובות במחקר נגיף הפוליו היא המיקרו חלבון.

בדיקת משקעים חיסוניים. למרות שבדיקה זו הוכיחה את ישימותה, היא דורשת מבנה מגובש של נוגדן קונבנציונלי, שאינו קיים בגופי ננו. גופי ננו אלה, שהם נוגדנים מעניינים ויציבים מאוד בתחום יחיד, ניתנים להנדסה בקלות עם טקסט שונה.

בשימוש נרחב. הערימה שלו מראה זיקה ליונים דו-ערכיים, כמו ניקל וקובלט, שבתורם ניתן לצפות בקלות על חרוזים מגנטיים. לכן פיתחנו את מבחן לכידת הזיקה הכמותית הפשוט המבוסס על חרוזים מגנטיים מצופים קובלט.

ריס הוא מלאי החרוזים המגנטיים על ידי מערבולת ומעביר 10 מיקרוליטר לכל דגימה לגלולת צינור את החרוזים באמצעות מגנט. הסר את הספינט השקוף כדי לשטוף את החרוזים. הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר כריכה.

קצרו את החרוזים בעזרת מגנט והסירו את הספינאט לאחר שטיפה שנייה. השעו מחדש את החרוזים ב-40 מיקרוליטר של מאגר קשירה עבור כל דגימה לשליטה. לרקע בדוגמה הראשונה, הכינו באר ללא וירוס עם תווית רדיו, אך נפח שווה של מאגר מחייב לשליטה.

מדגם שני של 100% פעילות רדיו. הוסף את כל הרכיבים לבאר למעט החלפת גוף הננו במאגר קשירה. כעת הוסף 2000 ספירות לדקה של S 35 המסומן בנגיף פוליו שבעה זן סוג אחד בנפח כולל של 80 מיקרוליטר של מאגר קשירה לכל הדגימות.

קבל שליטה. דוגמה אחת. הוסף 10 מיקרוליטר של דילול גוף ננו לכל דגימה.

יש לערבב היטב במשך 10 שניות על שייקר ולדגור למשך שעה אחת של טמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיקרוליטר מתרחיף החרוז המגנטי השטוף ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת ניעור מתמשך, גלולו את החרוזים במגנט והעבירו את ה-SUP natant הנקי לתוך צינור כדי למדוד רדיואקטיביות של כל דגימה, העבירו 50 מיקרוליטר של הסופינט לבקבוק ספירה. הוסף שלושה מיליליטר של תערובת נוזל נצנוץ וקרא על בידוד זה.

משוך נגדית את החרוזים המגנטיים המשומשים בצינור באמצעות מים וצנטריפוגה 500 פעמים G למשך שתי דקות. השליכו את הסופינט והשעו מחדש את החרוזים בשישה מיליליטר של 0.5 נתרן הידרוקסיד מולרי. לאחר מכן יש להכניס את התרחיף למספר צינורות ולדגור באמבט אולטראסוני למשך חמש דקות.

לאחר כדור החרוזים עם מגנט והסרת הספינאט, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת SDS 2% לכל צינור, ואז ערבב על ידי מערבולת ונייר כסף למשך חמש דקות. עכשיו, קצרו את החרוזים. הוסף מיליליטר אחד של 0.2 pH EDTA מולרי שבע לכל צינור, ודגר את הצינורות באמבט אולטראסוני למשך חמש דקות.

לאחר מכן אוספים את החרוזים, שוטפים חרוזים עם מיליליטר מים שלוש פעמים ואחריהם מיליליטר אחד של תמיסת קובלט כלוריד 10 מילי-מולרי. יש להניח את השפופרות על שייקר למשך 10 דקות. המשך לקצור חרוזים על מגנט והשהה במיליליטר אחד של מאגר קשירה.

שטפו פעמיים במיליליטר אחד של 20% אתנול סוף סוף השעו את החרוזים בנפח המקורי שלהם של 20% אתנול כדי לקבל חרוזים מחודשים בריכוז של 40 מיליגרם למיליליטר. תיקון לרדיואקטיביות ברקע על ידי הגדרת שליטה. דגימה אחת כערך 0% רדיואקטיביות ודגימת בקרה שתיים כערך 100% רדיואקטיביות.

כעת עבור כל דגימה, חשב את אחוז הרדיואקטיביות במדינה כמדד למשקעים הכוללים של הנגיף המסומן ברדיו על ידי גוף הננו. ניסוי זה מעריך את הזיקה של PVSS 38 C ונוגדנים ספציפיים לנגיף הפוליו באמצעות שלושה אנטיגנים שונים של נגיף הפוליו, אנטיגן מקומי, אנטיגן מחומם ותת-יחידות של 14 שניות. מעניין שהרדיואקטיביות במדינה של הדגימות המכילות תת-יחידות רדיו המסומנות 14 s פוחתת עם עלייה בריכוזי גוף הננו PVSS 38 C.זה מצביע על עלייה בכמות תת-היחידות של נגיף הפוליו 14 s המחוברות לגוף הננו P pvs, S 38 C, ובעקיפין לחרוזים המגנטיים.

מכיוון שלא נצפתה זיקה של pvs S 38 C לצורה האנטיגנית N ו-H אנטיגנית של נגיף הפוליו, גוף הננו נראה ספציפי לתת-היחידה 14 S של נגיף הפוליו. הזיקה של גוף הננו לאנטיגנים שלו כפי שנמדד בשיטה זו היא ספציפית כגוף הננו הלא קשור. הערה 1 לא מראה תגובתיות נגד שלוש הצורות האנטיגניות של נגיף הפוליו.

מערכת זו מייצרת יכולת שחזור גבוהה כפי שמצוין בעקומת תגובת מינון זו שנוצרה על ידי חוקרים שונים בימים שונים. לאחר שליטה בשלב הנוזלי האמין הזה, ניתן לבצע כראוי בדיקת לכידת זיקה תוך שעתיים מיחזור של הפעימות הכלולות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במבחן לכידת זיקה לפאזה נוזלית זה המבוסס על פעימות מגנטיות בעת לימוד האינטראקציה בין חלבונים שונים, במיוחד כאשר לא ניתן להשתמש במערכות מבוססות פאזה מוצקה.