זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות גנים בתוך אוכלוסיית פרטים המגלה שכיחות גבוהה של וריאציות פונקציונליות נדירות. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף מאגרי דגימות DNA מאוכלוסייה (pooling). השלב השני הוא יצירה וריצוף של ספריית ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing library).

לאחר מכן מתבצע יישור של הקריאות (reads) לרצף הייחוס ויצירת מודל שגיאות. השלב הסופי הוא ניתוח חישובי באמצעות אלגוריתם splinter. בסופו של דבר, ניתוח splinter של רצף דור הבא (Next generation sequencing) מpooled משמש להצגת גנים באוכלוסיות הנושאים שפע של שונות פונקציונלית נדירה, תוך הדגמת הפרוצדורה.

היום נלווה על ידי פרנצ'סקו וילניה (Francesco Vilania), סטודנט לתואר מתקדם במעבדה של המנטור שלי ושל השותף שלנו למחקר, רוב מיטרה (Rob Mitra), ויצטרף אליו אנריקה רמוס (Enrique Ramos), סטודנט לתואר מתקדם במעבדה שלי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על שיטות קיימות, כגון גנוטיפיקציה של פרטים בודדים, הוא שהיא מאפשרת לזהות בדיוק רב וריאנטים נדירים של רצפים באוכלוסייה מעורבת של מולקולות DNA מבלי לדרוש מידע מוקדם כלשהו. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי הגנטיקה והגנומיקה, כגון כיצד לקבוע את השכיחות של וריאנטים נדירים חדשים הגורמים למחלות במחקרי עוקבה של קבוצות גדולות.

כל ניסוי splinter דורש נוכחות של ביקורת שלילית וחיובית כדי להשיג דיוק אופטימלי; הכין את תערובת ריאקציית ה-PCR באמצעות PFU ultra high fidelity DNA polymerase. הביקורת השלילית היא תוצר PCR מכל רצף DNA שידוע כנטול וריאציה גנטית, כגון שלד של וקטור משובט.

כאן, נעשה שימוש באמפליקון של 1,934 זוגות בסיסים מווקטור M 13 MP 18. הבקרה החיובית יכולה להיות כל קבוצה של וריאנטים של רצפים שתוקפו בעבר ונוכחים באוכלוסייה כולה. אם נתונים אלו אינם זמינים, מעבדה זו תכננה בקרת חיובית מלאכותית המורכבת מתוצר PCR של 331 זוגות בסיסים מתערובת של רצפים מהונדסים שהועתקו לווקטור PGMT easy, כפי שרשום בטבלה זו.

רצפים אלו שולבו כדי לדמות תדריות שונות של אלל מיעוט (minor allele frequencies) של וריאנטים אמיתיים בתוך מאגר המטופלים. לאחר הגברת דגימות באמצעות PCR כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב המלווה סרטון זה, נקו כל תוצר PCR מעודפי פריימרים באמצעות טיהור בעזרת kyogen kayak quick column, או פלטות סינון בעלות 96 בארות עם סבב ואקום (vacuum manifold) לניקוי בקנה מידה גדול. לאחר הטיהור, כממו את כל תוצר PCR באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

הכינו את כל תוצרי ה-PCR והביקורות לאיחוד במכלול (pool) המנורמל לפי מספר המולקולות. איחוד לפי ריכוז יוביל לייצוג יתר של אמפליקונים קטנים לעומת תוצרים גדולים יותר. במקום זאת, איחדו מספר מנורמל של מולקולות לכל אמפליקון.

בחרו מספרים שרירותיים שגדולים מספיק כדי לשמור על דיוק במהלך הפפיטה. הוציאו את תוצרי ה-PCR ואת הביקורות. ליגציה של תוצרי ה-PCR נחוצה מכיוון שפיסוע של תוצרי PCR קטנים עלול להוביל להטיה של הייצוג לכיוון הקצוות שלהם.

מסיבה זו, אנו מבצעים ליגציה של תוצרי ה-PCR לתוך וקטור גדול לפני הפירמנטציה שלהם. הכינו תערובת לליגציה של קצוות קהים באמצעות T four Ligase, T four PNK ו-PEG כפי שמופיע בפרוטוקול. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 22 °C למשך 17 שעות.

המשיכו לדגירה בטמפרטורה של 65 °C למשך 20 דקות ולאחר מכן שמרו בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, בדקו את הליגציה על ידי טעינה של 50 ng מהדגימה לתוך ג'ל agarose. ליגציה מוצלחת תביא להופעת פס בעל משקל מולקולרי גבוה בנתיב.

הכינו את ה-DNA למסירת פרגמנטציה באמצעות אסטרטגיית סוניקציה אקראית על ידי דילול הדגימה ביחס של 10 ל-1 ב-Qiagen PB Buffer כדי להפחית את הצמיגות. לאחר מכן, פרגמנטו את הריכוז הגבוה של תוצרי ה-PCR באמצעות מכשיר Diagen Node BioRupture ל-24 דגימות; בצעו סוניקציה בעוצמה גבוהה במשך 25 דקות, עם מחזור של 40 שניות פעילות ו-20 שניות השהיה בכל דקה. בדקו את תוצאות הפרגמנטציה של ה-DNA על ג'ל אגרוז והמשיכו לרצף Illumina כפי שמתואר בטקסט.

כדי להתחיל את יישור הקריאות (read alignment) של הריצוף, המיר את קובצי ריצוף הקריאות הגולמיים לפורמט scarf, או דחס אותם. הדחיסה היא רשות.

פעולה זו חוסכת זמן ומקום עבור שלבי הניתוח הבאים מבלי לאבד מידע רלוונטי. באמצעות כלי היישור המצורף, יישרו את הקריאות הגולמיות (raw reads) לרצף הייחוס המבannotated המהיר יותר. עבור האזורים המטרתיים הספציפיים, כללו את תגובות ה-PCR וכן את הביקורות החיוביות והשליליות.

פורמט הקלט חייב להיות בפורמט scarf או דחוס. לאחר מכן, בצע תיוג קבצים כפי שמתואר בטקסט. כל ריצה מייצרת פרופיל ייחודי של שגיאות ריצוף שיש לאפיין לצורך זיהוי מדויק של וריאנטים (variant calling), כדי למדל את השגיאות עבור כל ריצה.

בכל ספריית דגימות מאגר נכללת בקרת פנימית הידועה כבעלת שונות רצפית, מתוך הקובץ המסומן (tagged file) שעבר יישור (alignment). צור קובץ מודל שגיאות באמצעות הכלי המצורף עם רצף הייחוס של הבקרה השלילית; ניתן להשתמש בכל רצף הבקרה השלילית, או לחלופין רק בתת-קבוצה המוגדרת על ידי הקצוות שלה ב-5' וב-3'. יש להחיל תמיד קריאות ייחודיות (unique reads) וספירות דמה (pseudo counts).

הכלי יפיק שלושה קבצים ששמם ייגזר מפרמטר שם קובץ הפלט, כאשר הם יסתיימו בספרות אפס, אחת או שתיים. קבצים אלו תואמים למודל שגיאה מסדר אפס, ראשון ושני, בהתאמה, עבור variant calling באמצעות splinter. יש להשתמש תמיד במודל השגיאה מסדר שני לצורך ויזואליזציה של פרופיל שיעור השגיאות של ההרצה.

ניתן להשתמש בסקריפט ה-Pearl המשמש לשרטוט גרף מודל השגיאה כדי להפיק גרף שגיאות בפורמט PDF על קובץ מודל השגיאה מסדר אפס. קובץ הגרף יחשוף מגמות שגיאה ספציפיות לריצה וניתן להשתמש בו כדי להסיק את המספר המקסימלי של בסיסי קריאה עבור הניתוח. הסעיף הבא ידגים כיצד להריץ את splinter על הקובץ המיושר באמצעות מודל השגיאה כדי לזהות וריאנטים נדירים של רצפים.

השלב הראשון בניתוח הוא הרצת splinter על הקובץ המיושר באמצעות רצף הייחוס ומודל השגיאות. ניתן להוציא בסיסי קריאה בודדים מהניתוח אם נמצאו פגומים. סף ערך ה-P-value קובע עד כמה מחמירה תהיה בדיקת זיהוי הווריאנטים.

סף מינימלי של 1.301- הוא נקודת התחלה טובה. אפשרות גודל המאגר (pool size) מייעלת את הבחנה של האלגוריתם בין אות לרעש על ידי ביטול שונות פוטנציאלית עם תדרי אלל מינוריים הנמוכים מאלו של אלל בודד במאגר בפועל. יש להגדיר את אפשרות גודל המאגר לערך הקרוב ביותר שגדול ממספר האללים בפועל שנותחו בניסוי.

שונות שנמצאה בתדרים נמוכים יותר תיחשב כרעש ותוזנח. לאחר הזנת כל הפרמטרים ושמות הקבצים, הפעל את splinter. קובץ זה מחזיר את כל הפגיעות (hits) בעלות מובהקות סטטיסטית לאורך הדגימה, יחד עם תיאור של מיקום הווריאנט וסוג הווריאנט.

ערך ה-P (P-value) לפי תדירות גדיל של גדיל ה-DNA של הווריאנט והכיסוי הכולל לכל גדיל DNA. קובץ הרשימה משמש את splinter לנרמול הכיסוי לאורך הדגימה. השדה הראשון מציין את האמפליקון הרלוונטי, בעוד שהשדה השני מציין את המיקום שבו נמצאה המוטציה.

N מציינת ששאר הרצף אינו מכיל מוטציה כלשהי. כחלק מהנורמליזציה, ניתוח הבקרת החיובית הוא קריטי למקסום הרגישות והסגוליות עבור ריצה מסוימת. דבר זה חשוב כיוון שסביר להניח שערך הסף הראשוני של 1.301- לא יספיק כדי לסנן את כל התוצאות החיוביות השגויות.

כל ניתוח של רסיס (splinter analysis) יציג את ערך ה-P הממשי עבור כל וריאנט שזוהה, אשר לא ניתן היה לחזות מראש כסבירות גבוהה. עם זאת, ניתן לחזור על הניתוח כולו תוך שימוש בערך ה-P הפחות מחמיר המוצג בפלט הראשוני עבור מיקומי הבסיס החיוביים האמיתיים הידועים. פעולה זו תשמש לשימור כל החיוביים האמיתיים תוך הדרתו של רוב החיוביים השקריים, אם לא כולם, אשר בדרך כלל בעלי ערכי P פחות מובהקים בהשוואה לחיוביים אמיתיים.

על מנת להפוך תהליך זה לאוטומטי, ניתן להשתמש בסקריפט ה-cutoff tester. סקריפט ה-cutoff tester דורש קובץ פלט של splinter ורשימה של פגיעות בקרה חיוביות (positive control hits) בפורמט של קובץ המופרד בטאבים, בדומה לקובץ המשמש לנורמליזציה. הפלט שיתקבל יהיה רשימה של ערכי סף (cutoffs) המגיעים באופן הדרגתי לערך האופטימלי.

השורה האחרונה מייצגת את נקודת החיתוך (cutoff) האופטימלית ביותר עבור ההרצה, ולכן ניתן להשתמש בה לניתוח הנתונים. התוצאה האופטימלית היא השגת רגישות וסגוליות של אחת. עם זאת, אם לא הושגו ערכים אלו, ניתן לבצע אופטימיזציה לניתוח ה-splinter על ידי שינוי מספר בסיסי הקריאה (read bases) המגולמים.

ניתן להחיל את נקודת החיתוך הסופית על הנתונים באמצעות סקריפט cutoff cut, שיסנן מקובץ הפלט של splinter פגיעות (hits) הנמצאות מתחת לנקודת החיתוך האופטימלית. שלב זה יפיק את קובץ הפלט הסופי של splinter, שיכיל snips ו-indels הנמצאים בדגימה. שימו לב כי הפלט עבור insertions שונה מעט מהפלט עבור substitutions או deletions.

דיוק כפונקציה של כיסוי עבור אלל בודד במדגם מאוחד מוצג בסוג זה של גרף. הדיוק מוערך כשטח מתחת לעקומה, המקוצר כ-AUC, של עקומת מאפיין תפעול של מקלט (receiver operator curve), ונע בין דיוק אקראי של 0.5 לדיוק מושלם של 1.0. בדוגמה זו, AUC מוצג כפונקציה של כיסוי לאלל עבור זיהוי אללים מוטנטיים בודדים במאגרים של 200, 500, 1,000 אללים.

כאן מוצג UC כפונקציה של הסך הכל עבור insertions, deletions ו-substitutions. גרף שגיאות זה מציג את ההסתברות לשילוב של בסיס שגוי במיקום נתון. פרופיל השגיאות מראה שיעורי שגיאה נמוכים עם מגמה עולה לעבר קצה ה-3' של קריאת הריצוף.

נוקלאוטידי ייחוס שונים באופן בולט מציגים הסתברויות שגיאה שונות. תרשים זה חושף את הדיוק של splinter בהערכת תדירות אללים עבור מיקומים שבהם היה כיסוי הגבוה מ-25 fold לאלל. השוואה בין תדירויות אללים של DNA מאוחד (pooled DNA) כפי שהוערכו על ידי splinter, לבין ספירות אללים שנמדדו על ידי מחקרי אסוציאציה גנומיים או תוצאות GWAS.

במתאם גבוה מאוד, נדגמה אוכלוסייה של 974 אנשים וסומן יעד של מעל 20 kilobases לריצוף. נעשה שימוש ב-Splinter לזיהוי וריאנטים נדירים. בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי, לכל פרט בוצע בעבר טיפוס גנטי (genotyping) על ידי בדיקת התאמה (concordance) של gwas בין טיפוס גנטי של וריאנטים מסומנים (tagged) לבין וריאנטים חדשים.

הזיהוי במדגם המאוחד היה מצוין. שלוש וריאנטים, שניים מהם נדירים באוכלוסייה, זוהו כ-denovo מתוצאות הריצוף ואומתו באמצעות pyro sequencing אינדיבידואלי; התאימות המתמטית בין ה-pyro sequencing לריצוף המאוחד, וכן תדרי האלל המינוריים, הייתה מצוינת. לאחר שסיימתם למצוא את הווריאנט הנדיר במדגם המאוחד שלכם, רבים מעוניינים לדעת מהן ההשלכות התפקודיות של הווריאנט שזוהה.

על כן, שלב התהליך הבא לאחר הפיתוח הוא ביצוע אנוטציה לווריאנט שלך. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום ריצוף ה-DNA ללמוד על וריאנטים נדירים באופן מהיר וכלכלי, במטרה לאפיין וריאנטים נדירים במחקרי אוכלוסייה רחבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות וריאנטים נדירים של רצפים בדגימת DNA מאוכלוסייה (pool) באמצעות splinter.