הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד מושבות של תאי גזע אנושיים בצורה מהירה ויעילה. דבר זה מושג על ידי תרבית של תאים עובריים אנושיים על שכבה צפופה של פיברובלסטים עובריים של עכבר. עם הזמן, התרחבותה של אוכלוסיית תאי הגזע מגדילה את מספר תאי הגזע האנושיים, אך מאפשרת להם גם ליצור מושבות דמויות איים בתוך השכבה.

בשלב הבא, שכבת ה-meth מוסרת באמצעות שאיבה, כך שנותרות מאחוריה המושבות הבודדות של תאי גזע עובריים אנושיים. תוצאות של צביעה אימונוהיסטוכימית לסממני תאי גזע מראות כי זוהי שיטת בידוד יעילה לסילוק תאי מאכילה (feeders) ולשמירה על שלמות המושבות. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה בעת ביצוע תרביות שיתופיות (co culturing) של תאים במעבדה שלנו, כאשר רציתי להציל את תרביות תאי הגזע ממערכות תרבית עם צפיפות יתר (over confluent).

לפיכך, הבעיה שרוב האנשים יחוו בעבודה עם מערכת זו היא חוסר בניסיון בתרביות של תאי גזע אנושיים. מצאנו שטכניקה זו שימושית במיוחד כאשר עלינו לבודד מספרים גדולים של תאי גזע עובריים אנושיים לצורך ניסויים, בהשוואה לשיטות אחרים כגון מיון או בחירה ידנית של מושבות תאי גזע. שיטה זו מהירה ויעילה יותר לבידוד מושבות מתרביות בצפיפות גבוהה.

יש לטפל בתאי פיברובלסטים עובריים של עכבר ב-mitomycin C או להקרינם לפני התרבית המשותפת עם תאי גזע עובריים כדי למנוע מהם לעבור חלוקה. שעתיים לפני זריעת ה-MEFs, יש לצפות כל צלחת תרבית של 60 מילימטר שעברה טיפול בפלזמה בשני מיליליטר של 0.05% Gelatin. יש להפשיר מבחנה של MEFs מטופלים, לסבב בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 1,500 RPM ולזרוע תרבית של כ-20,000 תאים לסנטימטר רבוע על הצלחת המצופה בג'לטין. יש להדגיר את התרבית למשך לילה להצמדת התאים. ניתן להתחיל תרביות חדשות מתאים קריו-משומרים או על ידי מעבר של התרביות הנוכחיות לצלחות מצופות ב-MEF. כאשר מתחילים עם צלחת המכילה מושבות גדולות של תאי גזע עובריים אנושיים, יש לשטוף פעם אחת בשלושה מיליליטר של phosphate buffered saline מחומם.

הוסיפו 3 mL של תמיסת collagenase four בריכוז 1 mg/mL, והדגירו למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C. התאים לא יהפכו לנפרדים או יתגבשו לכדורים כפי שקורה בשימוש ב-trypsin. בעזרת קצה של טיפ פפיטה של 5 mL, צרו תבנית של רשת על המושבות ושברו אותן לצבירי תאים קטנים.

כעת, כאשר קצה טיפ הפפיטה מוחזק בזווית ניצבת לפיתח התרבית, גרדו את תחתית פיתח התרבית כדי לשחרר את כל התאים מהמשטח. העבירו את התאים למבחנת פאלקון לצורך איסוף; צנטריפוגו ב-1000 RPM למשך חמש דקות ושאבו את המדיום. לאחר מכן, שאבו את המדיום מהפיברובלסטים עובריים של עכבר שנזרעו ביום הקודם.

לאחר מכן, זרע את תאי הגזע העובריים האנושיים ביחס של אחת לשלוש מהצלחת המקורית והזן אותם ב-3 mL של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים. תאי ה-HECS האנושיים גודלים בצפיפות גבוהה למשך 10 עד 14 ימים. הנח את קצה הפפיטה השואבת בקצה הצלחת והשתמש ביניקה כדי להרים בעדינות את קצה שכבת ה-meth.

הסיר את המצע מהצלחת. אפשר לקצה הטיפ לתפוס את שכבת התאים ולאחר מכן העבר את הטיפ באיטיות בתנועת קשת מעל הצלחת. אם השכבה סותמת את הפיפטה באופן משמעותי, הסר את השכבה מהתרבית.

הקישו על החלק העליון של צלחת התרבית בעזרת שואב (aspirator) כדי להשלים את פירוק התאים, והסירו את התאים באמצעות שאיבה מלאה. החליפו מיד את מצע תרבית תאי הגזע העובריים האנושיים והחזירו את התרבית לדגרה לתרביות תאים לאחר הזריעה על צלחות התרבית. מערכת תרבית-משותפת (co-culture) זו מביאה ליצירת מושבות של תאי גזע עובריים אנושיים בצפיפות גבוהה, המוקפות בפיברובלסטים עובריים של עכבר.

טכניקת השאיבה מסירה את ה-MES ומפיקה מושבות קטנות ולא מופרעות של תאי גזע עובריים אנושיים. כאשר כמות מזערית של mes מקיפה את המושבה השלמה, מושבות תאי הגזע העובריים מסוגלות לעבור התרחבות משמעותית למושבות גדולות מאוד. לדוגמה, מושבה זו של תאי גזע עובריים אנושיים, המוצגת מיד לאחר דלדול ה-meth, התרחבה למושבה גדולה מאוד בזיהוי אימונופלואורסצנטי של מושבות עד 10 ימים לאחר ה-meth.

דילול מראה כי המושבות שומרות על ביטוי של סמני פלוריפוטנטיות ואינן מראות התמיינות לעבר גורל מזודרמי. תמונות אור אלו מציגות את המורפולוגיה של מושבות שנצבעו בשיטת אימונו-פלואורסצנציה בהגדלות שונות. DAPI צובע את גרעיני התאים.

באופן חשוב, תאי הגזע העובריים האנושיים מביעים את סממני תאי הגזע האנושיים SSEA-4, TRA-1-60 ו-TRA-1-81. שימו לב כי התמונות מציגות מושבה בעלת גבולות חלקים טיפוסיים. הם אינם מביעים FLK-1, סמן מוקדם של התמיינות למזודרמה, ואינם מכילים פיברובלסטים, כפי שניתן לראות מהיעדרו של צביעת DDR2.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד מושבות של תאי גזע אנושיים באמצעות טכניקות תרבית למניפולציה של סביבות טבעיות. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע זאת תוך שניות. כמו כן, זכרו לא להניח לתרביות להתייבש בעת הסרת המצע ושכבות הלכלוך.