לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

מטרת הניסוי הבא היא לזהות את הדינמיקה התאית המרחבית והזמנית המעורבת באנגיוגנזה (Angiogenesis), המוגדרת כצמיחה של כלי דם חדשים מכלי דם קיימים. באמצעות מודל פשוט וניתן לשחזור, עוררים תחילה אנגיוגנזה על ידי חשיפה קצרה של המזנטרה (Mesentery) בחולדה, ואספים רקמות מזנטריות בנקודות זמן שונות לאחר הגירוי. לאחר מכן, מבצעים סימון אימונולוגי (Immunolabeling) של חיתוכי הרקמה.

לדוגמה, ניתן להשתמש בסמן לתאי אנדותל כדי להמחיש את כל מערכת כלי הדם העוברת עיצוב מחדש בתוך רקמה, וליצור ויזואליזציה דו-ממדית חיונית של רשתות מיקרו-וסקולריות גדלות. מודל זה הוא אטרקטיבי מכיוון שהוא מייצר עלייה דרמטית במספר מדדי אנגיוגנזה לאורך פרק זמן קצר יחסית במבט כולל. הדמיה של רשתות ברמת התא הבודד והצלבה של מדדים אלו עם סימון רב-תאי הוכחו כשימושיים ביותר בזיהוי פנוטיפים תאיים חדשים המערבים ניצות של נימי דם.

שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לדינמיקה התאית המעורבת בצמיחת רשתות מיקרו-וסקולריות. אלו כוללות את המועד והמיקום שבהם תאים ספציפיים נוכחים במהלך תהליך הניצניר של הנימים. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם פשטותה, הדרישה להתערבות כירורגית מינימלית והשגת תגובה אנגיוגנית חזקה בפרק זמן קצר יחסית.

בנוסף, השיטה מנצלת את המזנטרום של העכבר (rap mesentery), שהוא רקמה המאפשרת תצפית על רשת שלמה עד לרמה של תא בודד. מניסיוננו, קל מאוד ללמוד את הפרוצדורה, ולכן היא ניתנת לשחזור מחוקר אחד למשנהו בעקביות, תוך הדגמת ההליך. היום, פיטר סטאפלר (Peter Stapler), סטודנט לתואר שני במעבדה שלנו, יכין את הניתוח כפי שפורט בטקסט הנלווה.

לאחר גילוח אזור הבטן של החולדה, מקמו את החולדה המורדמת על גבה על משטח חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף. נקו את אזור הבטן באמצעות ניגובים לסירוגין של GREs סטריליים הספוגים ב-70% Isopropyl alcohol וביוד. בערך אינץ' אחד מתחת לעצם הסטרנום (sternum), בצעו חתך אורכי קטן לאורך העור ולאחר מכן לאורך ה-linea alba. הניחו את הסביב המוכנה מראש מעל אזור הבטן כך שהפתח יתיישר עם החתך. הפעילו לחץ עדין מסביב לחתך כדי לחשוף את המעי הדק. בעזרת מקלוני צמר, משכו בעדינות חלק מהמעי הדק והניחו את המזנטרה (mesentery) על הבמה הפלסטית המכילה סליין סטרילי, ואתרו את האיליאום (ileum).

זהו שש עד שמונה חלונות מסנתרים (mesenteric windows) מכושרים, שהם הקרומים השקופים והדקים הנמצאים בין זוגות העורקים והוורידים המזינים את המעי הדק. רשום את שעת ההתחלה של החוץ (exterior) והפעל טיימר ל-20 דקות. סמן את שני החלונות המסנתרים הממוקמים במרכז באמצעות תפר סטרילי במידה 7-0 באזור השומן הסמוך למעי.

מלאו את התמיסת המלח בצלחת הפטרי באופן לסירוגין באמצעות מזרק סטרילי של 5 mL כדי להבטיח שהרקמה תישאר טבולה ולחה. לאחר פרק הזמן שבו הרקמה הייתה מחוץ לגוף, החזירו את הקירין (mesentery) לחלל הבטן. סגרו את שרירי הבטן באמצעות תפר מונופילמנט במידה 5-0 בתבנית תפרים נפרדים.

לאחר מכן, סגרו את העור באמצעות תפר מונופילמנט 4-0 בתבנית מקוטעת, נגבו את אזור התפר בניגובים לסירוגין באמצעות גזה סטרילית ספוגה ב-70% isopropyl alcohol וביוד למריחה, מרחו ג'ל סיכוך בשתי עיני החולדה והחזירו אותה לכלוב לצורך התאוששות. ביום הנבחר, לאחר הגירוי, הרדימו והמתתם את החולדה בהתאם להנחיות המוסדיות. לאחר מכן, פתחו שוב את חלל הבטן וכסו את אזור הבטן ביריעת ניילון נצמד. כעת, משכו בעדינות החוצה את המעי הדק ואתרו את שני החלונות המסומנים באמצעות פינצטה ומספרי מיקרו.

גזרו את כל חלונות הקרום העוטף את המעי (mesenteric windows) שהוצאו החוצה, כולל שוליים של רקמת שומן. השתדלו להימנע מחיתוך של זוגות עורקים וורידים בתוך שולי השומן של החלונות כדי למזער את הסיכון למילוי החלונות בדם. כמו כן, מזערו חיתוכים של המעי שעלולים להוביל לדליפת תוכן מעי.

מיד לאחר המגע עם החלונות, טבול כל חלון ב-PBS. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי לפרוס את הרקמות על גבי זכוכיות מיקרוסקופ בעלות מטען חיובי. הצמד שתי רקמות לכל זכוכית. לאחר שהרקמות התייבשו חלקית, הסר את השומן העודף באמצעות להב סקאלפל.

קבע את הדגימות במתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס על ידי הנחתן במקפיא. ייבש את השקופיות בוואקום כדי להסיר תמיסת בופר עודפת. כמו כן, סמן את גבולות הרקמות בעט שעווה כדי למנוע זרימה בלתי נשלטת של תמיסות הנוגדנים הרחק מהרקמה.

כעת טפטפו כ-200 µL של תמיסת נוגדן ראשוני מדולל כך שתכסה את כל הרקמה. הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, שטפו את הרקמות עם PBS בתוספת 0.1% saponin באמצעות שלושה סבבי החלפת בופר. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת הנוגדן המשני strep adin peroxidase והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; לאחר שלושה שטיפות, הדגירו את הדגימות ב-vector nova red למשך 15 דקות.

שטפו במים לצורך הרכבת הפלש resettים. טבלו ב-95% ethanol‏ 10 פעמים, ולאחר מכן בצעו שלבי התייבשות רצופים. הניחו לפלש resettים להתייבש, כסו את הרקמות בשכבה דקה של חומר כיסוי, והניחו זכוכית כיסוי לאחר ייבוש בוואקום וסימון.

השקופיות. כסו את דגימות הרקמה בתמיסת נוגדן ראשוני מדוללת. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שטפו שלוש פעמים עם PBS בתוספת 0.1% saponin למשך 10 דקות בכל שטיפה. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן המשני והדגיתו למשך שעה אחת. בצעו שטיפות ב-PBS בתוספת 0.1% Saponin, העבירו את השקופיות ל-PBS עם גליצרין ואטמו בעזרת לק.

כאן אנו מפרטים את התאמתה של צלחת פטרי נפוצה לשימוש כבמה ניתוחית. חימר מידול צהוב שימש ליצירת משטח חלק המאפשר את משיכת המזנטרון (קרום המעי) דרך החור שנקדח מראש. שוב, חלונות המזנטרון המוצגים כאן על הבמה במהלך תקופת החשיפה החיצונית מוגדרים כקרומים הדקים ושקופים הנמצאים בין זוגות העורקים והוורידים המזינים את המעי כאן.

סימון PCAM מזהה את כל סוגי כלי הדם לאורך ההיררכיה של רשתות מיקרו-וסקולריות העוברות רמיodeling בנקודות זמן ספציפיות לאחר החצנה (externalization). ניתן להשתמש בתמונות אלו כדי לכמת מדדים אנגיוגניים בנקודות זמן ספציפיות לאחר הגירוי.

סימון PCAM מאפשר להבחין בין עורקים לוורידים. שימו לב כי עורקים מזינים מציגים בדרך כלל קטרים קטנים יותר ומורפולוגיה מוארכת של תאי אנדותל בהשוואה לוורידים תואמים. מאפיינים טיפוסיים של רשתות שעברו רמודלינג כוללים שטח מvסקולריזציה, ניבוב קפילרי וצפיפות כלי דם.

כימות של מדדי אנגיוגנזה מגוונים אלה מאפיין את מהלך הזמן של צמיחת הרשת. הניבט של נימיים מכלי דם קיימים מגיע לשיאו בין היום השלישי ליום החמישי וחוזר לרמה שאינה מעוררת עד היום ה-10. במעבדה שלנו, עלייה זמנית זו בניבט מלווה בעליות בשטח המכולוך בכלי דם ובצפיפות כלי הדם.

מערכת מודל זו שימשה לזיהוי שינויים פנוטיפיים תאיים חדשים בנקודות זמן ספציפיות במהלך תהליך רמיodeling זה. סימון PCA אימונופלואורסצנטי צובע תאים אנדותליאליים באדום, בעוד שסימון beta tubulin class three צובע עצבים וטפילים לאורך כלי דם אנגיוגניים בירוק. באופן מעניין, ברקמות שאינן מעוררות, ביטוי של beta tubulin class three הוא ספציפי לעצבים.

בניגוד לכך, במהלך שיאו של הניבוב הנימי (capillary sprouting), בטא-טובולין מסוג 3 (class three beta tubulin) מבוטא על ידי תאים פרי-וסקולריים. תוצאה מסוג זה מדגישה את השימוש במודל אנגיוגני פשוט וחסון זה כדי לזהות סוגי תאים חדשים המעורבים בתהליך האנגיוגנזה. עד היום ה-10, דפוס הביטוי של בטא-טובולין מסוג 3 מתחיל לחזור למצב שבו לא ניתן גירוי.

ייתכן שניתן יהיה להשתמש במודל זה גם למחקרי שושלות תאים. היתכנות השילוב של תאים ברקי קירין (מסנטרים) העוברים remodeling נתמכת על ידי מחקרים ראשוניים אלו, שבהם תאים ממחית העצם או תאי גזע מזנכימליים שסומנו מראש הוזרקו על חלונות קירין במהלך תקופת החשיפה החיצונית שנמשכה 20 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן השימוש במודל ה-interiorization של קירין בעכברים לצורך חקירת הדינמיקה התאית המעורבת בצמיחת רשתות מיקרו-וסקולריות.

ניתן לבצע טכניקה פשוטה זו תוך כ-45 דקות עד שעה. זכרו, קריטי לטפל בקירין (mesentery) בעדינות ולהימנע מניקור של כלי דם לאחר הליך כירורגי. ניתן לבצע סימון אימונולוגי כדי לזהות סוגי תאים מרובים לאורך כלי דם.

ניתן לבצע גם סימון של כלי לימפה ועצבים. הדבר מאפשר לנו לבחון לא רק את השינויים הפנוטיפיים התאיים המעורבים באנגיוגנזה, אלא גם את התיאום בין אנגיוגנזה, נוירוגנזה ואנגיוגנזה לימפתית.