Name: לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים Lymphoreticular (NALT) בתגובות עכבר לחיסונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: חקור את תפקידן של רקמות לימפואפיתליות קשורות לאף וללוע (NALT) בתגובות חיסון אצל עכברים באמצעות מודל ניתוחי ותרביות אקס ויוו. שיטה זו מאפשרת הערכת חסינות מקומית ומערכתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תמיכה סופק על ידי בקטון דיקינסון טכנולוגיות. הדעות המובאות הגשת זה הם אלה של הכותבים ואינם מתיימרים לשקף את המדיניות הרשמית של ממשלת ארה&quot;ב. המחקר נערך בהתאם לחוק לרווחת בעלי חיים וכן חוקים ותקנות פדרליים אחרים הקשורים בחיות וניסויים מעורבים בעלי חיים ועקרונות האמורים מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, המועצה הלאומית למחקר, 1996. המתקן שבו המחקר נערך באופן מלא הוא מוכר על ידי האגודה הערכת הסמכה של מעבדה בעלי חיים טיפול הבינלאומי.

<ol><li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li>
<li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li>
<li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li>
<li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li>
<li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALT+%28nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue%29+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li>
<li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue+%28NALT%29%3A+frequency+and+localization+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li>
<li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue%3A+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+na%C3%AFve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li>
<li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li>
<li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue%3A+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li>
<li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li>
<li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+lymphoid+tissue%2C+intranasal+immunization%2C+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li>
<li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+%28NALT%29+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+%28LT+alpha%29+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma%2C+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li>
<li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CXC+chemokine+ligand+13%2C+CC+chemokine+ligand+%28CCL%29+19%2C+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li>
<li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הצגנו שיטות קולקטיביות על פיתוח מודל החיה, קבלת דגימות ביולוגיות, מבחני לבחינת NALT הקשורים התגובה החיסונית 1-4. ישנם גורמים נוספים שיש להביא בחשבון בעת ​​ביצוע שיטות אלה. טכניקות סטנדרטיות סטריליים לניתוח ותרבות רקמה יש ללכת. שילוב של סוכנים אנטיבקטריאלי נגד פטריות שימוש במהלך הבידוד ותרבות, כמו גם שמירה על מכשירים מעוקרים, אזור העבודה, ואת חיך מחוטאות תפחית את הסיכון של זיהום. בדיקת הרוק, האף דומים דגימות הפרשת הריריות יש לבדוק על אפשרות של זיהום בדם, כמו נוגדנים בסרום נמצאים בדרך כלל בריכוזים גבוהים יותר. יתר על כן, ההפרשות הריריות צריך רק להיות מדולל במעט לניתוח כי ריכוזים נמוכים יותר של נוגדנים נמצאים דגימות אלה לעומת בסרום. עכברים יש לשמור על חם מיד לאחר הניתוח מראשלפרוק היפותרמיה הנגרמת הפוטנציאל הרדמה. עכברים מנוחה לסירוגין משני שלהם במהלך ההחלמה שלאחר הניתוח כדי למזער נשימה סדירה. ניתוח יעיל יותר עם שלושה אנשים עובדים יחד כדי להשלים את המשימות הבאות: 1 ביצוע הניתוח, 1 כדי לסייע מחזיק את הפה פתוח, ואחד לספק לאחר ניתוח טיפול כמו העכברים להתאושש מן ההרדמה. יש צורך להשתמש ב H &amp; E מכתים של חתכים הגולגולת בסוף כל ההליכים או מחקרים ניסויים כדי לוודא את הצלחת הניתוח על כל עכבר. ניתוח התוצאות האפשריות הן: אבלציה NALT מלא בין שתי המדינות, אבלציה שלם, או NALT ללא פגע. מאחר שלא כל הניתוחים תגרום לאובדן מוחלט של NALT, בעלי חיים עם NALT שיורית או תמים יכול לשמש הבקרה הפנימית. תוצאה נוספת היא כי הפוטנציאל החיך לא מצליח לרפא לחלוטין, משאיר פתח המחבר בין האף לבין הפה עששת. לא מושלםהריפוי של החיך תגרום משקל נמוך וכישלון לשגשג, אלה אנשים יש להסיר מחקרים. בחינת התגובות החיסון הראשון עם מודל העכבר ישמש להקמת תפקיד NALT בתוצאות המחקר המיועד (תגובת נוגדנים, הישרדות וכו &#39;). הסרה בניתוח של NALT מאפשר קביעת תרומות באף חסינות מקומית ומערכתית. הגישה הכירורגית המתוארת כאן היא השיטה הישירה ביותר להשגת במודל עכבר ללא NALT. בחר לדפוק הקצוב מודלים העכבר דווחו NALT חוסר, אבל החיות הללו הם גם חסר ציטוקינים או כמוקינים החיוניים להתפתחות רקמות הלימפה משניים אחרים, ועלול להכיל פגמים נוספים 12,13. יתר על כן, השיטות המתוארות כאן פותחו לבחינת היבטים שונים של התגובה החיסונית שמקורם בתוך מעברי האף. תוצאות הניסוי שלנו מבוססים על מחקרים באמצעות palat העליון כולוהדואר של העכבר על תרביות רקמה, אם כי יתכן כי ניתן יהיה להשתמש בחלקים. לבסוף, המודל NALT תרבותי שימושי לביצוע ניסויים לחלוטין בתרבות רקמות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> נירוסטה סכין כירורגית סטריליות, מס &#39;11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> ידית הסכין, מס &#39;3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48 גם צלחות תרבית תאים </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית, חום מומת </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> קונצרט כלשהו הסופי: 10% לפי נפח בתקשורת תרבות </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין סולפט </td><td> סיגמא </td><td> S9137 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין </td><td> סיגמא </td><td> P7794 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 100 UI / ml </td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10 מ&quot;ל </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Eppendorf צינורות Microcentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> נוטרה ג&#39;ל שרי מזון עכבר בטעמים רטוב </td><td> ביו מגישים </td><td> S4798 מגשים </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> טיפה אחת של השעיה מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​1.5 שבעל פה </td></tr><tr><td> קטמין </td><td> פייזר </td><td> 00856440301 </td><td> סופי משותףNC: 6.06 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> סופי קונצרט כלשהו: 0.061 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> לויד </td><td> 4811 </td><td> סופי קונצרט כלשהו: 0.667 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Puralube משחה וטרינר </td><td> Pharmaderm לבריאות בעלי חיים </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9% נתרן כלורי להזרקה USP </td><td> בקסטר </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> מצרב Thermal Unit </td><td> גייגר </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> עצה החלפת TCU, לופ פיין סטרייט </td><td> גייגר </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> כירורגי מספריים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% ניטרלי שנאגרו פורמלין </td><td> סיגמא </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פורמית </td><td> דיג </td><td> A119P-4 </td><td> מערבבים 426 מ&quot;ל חומצה פורמית למים מהברז 1047 מ&quot;ל, ואז מוסיפים 45 מ&quot;ל Rexyn 101 (ג) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (ג) </td><td> דיג </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> רקמת-Tek VIP E150/E300 </td><td> סאקורה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> רוטרי Microtome </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> מאיר חברה Hematoxylin </td><td> סיגמא </td><td> MHS16-500ml </td><td></td></tr><tr><td> גיל מס &#39;1 Hematoxylin </td><td> סיגמא </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> סיגמא </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer מפריד סרום </td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td></td><td></td><td> 100 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 140 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז קוקטייל, EDTA ללא </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים lymphoreticular (nalt) בתגובות עכבר לחיסונים

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

את האף והלוע הקשורים רקמות lymphoreticular (NALT) נמצאו אצל בני אדם, מכרסמים, ויונקים אחרים, לתרום חסינות הסינוסים באף 1-3. NALT שני מקבילים פעמון מבנים הממוקמים את מעברי האף מעל החיך הקשה, והם נחשבים בדרך כלל להיות מרכיבים משניים של מערכת הרירית הקשורים הלימפה 4-6. ממוקם בתוך NALT הם תאים נפרדים של לימפוציטים מסוג B ו-T-וביניהם אנטיגן הצגת תאים דנדריטים 4,7,8. תאים אלו מוקפים בשכבת תאים אפיתל intercalated עם M-התאים אשר אחראים אחזור אנטיגן מן המשטחים הריריים של מעברי האוויר 9,10. לימפוציטים נאיביים במחזור דרך NALT עומדים להגיב על המפגשים הראשונים עם גורמי מחלה בדרכי הנשימה 7. בעוד NALT נעלמים אצל בני אדם עד גיל שנתיים, טבעת ומובנית דומה של Waldeyer הלימפה לאיברים להמשיך להתמיד הroughout חיים 6. בניגוד לבני אדם, עכברים לשמור NALT לאורך כל החיים, ובכך לספק מודל חיה נוח לחקר המערכת החיסונית שמקורם בתוך הסינוסים האף 11. תרבויות של תא יחיד המתלים של NALT לא מעשית בשל תשואות נמוכות של תאים mononuclear. עם זאת, ביולוגיה NALT ניתן לבדוק על ידי culturing vivo לשעבר של איבר שלם, בשיטה זו יש יתרון נוסף של שמירה על הרקמה הטבעית. עבור במחקרים vivo, מודלים בנוקאאוט הצגת פגמים גנטיים מוגבל NALT לא זמין כרגע בשל הבנה לקויה של מסלול ההתפתחות. לדוגמה, בעוד lymphotoxin למוצרי אלפא עכברים בנוקאאוט התנוון NALT, תיקונים של Peyer, בלוטות לימפה הפריפריה, דנדריטים ותאי זקיקי הלימפה ורקמות אחרות שינו גם אלה מניפולציות גנטיות בעכברים 12,13. כחלופה עכברים בנוקאאוט גנים, עמ &#39;אבלציה כירורגיתermanently מבטלת NALT מן המעבר באף מבלי לפגוע ברקמות אחרות. מודל העכבר וכתוצאה מכך נעשה שימוש כדי ליצור קשרים בין התגובות NALT ו החיסונית לחיסונים 1,3. אוסף סדרתי של נסיוב, רוק, שטיפות האף הפרשות הנרתיק הכרחי להקמת בסיס של תגובות מארחים את החיסון, תוך כדי התגובה החיסונית שמקורם ישירות NALT שניתן לאשר על ידי תרביות רקמה. ההליכים הבאים מתארים את הניתוחים, תרבות רקמות ואיסוף המדגם יש לבחון מקומיים מערכתית התגובה החיסונית לחיסון הלחות (IN) אפי.

שיטות לבחון את תרומתם של האף והלוע הקשורים רקמות lymphoreticular (NALT) על המערכת החיסונית האף מערכתית של עכברים לחיסונים אפי מתוארים. אנחנו מדגימים ניתוח לבסס מודל NALT תלוי העכבר<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; תרבויות NALT חילוץ.

לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים Lymphoreticular (NALT) בתגובות עכבר לחיסונים

הרקמות הלימפורטיקולריות הקשורות לנזון-לוע (NALT), הנמצאות בבני אדם, במכרסמים וביונקים אחרים, תורמות לחסינות בסינוסים של האף1-3. ...

מטרת הליך זה היא לבחון את התרומה של ה-nalt, רקמות לימפטיות-רטיקולריות הקשורות לנאזופרינקס, לתגובות חיסוניות נזאליות וסיסטמיות של עכברים לחיסונים שניתנו באופן תוך-נזאלי. דבר זה מבוצע באמצעות בחינת תרביות ex vivo של nalt שלם, ובמסגרת מודל עכברים, ה-nalt השלם מופק ועובר שטיפות רצופות וניקוי. לאחר מכן התרביות מגדלות ונלקחות דגימות במרווחי זמן קבועים.דגימות אלו עוברות סרכוז, מאוחסנות ונבדקות מאוחר יותר כדי לאתר עדויות לתגובה חיסונית. הסרה כירורגית של Nat ממעברי האף של העכבר מבוצעת בזהירות כדי לא לפגוע ברקמות הסובבות. לאחר שהעכברים שעברו את ההליך הכירורגי הוכפחו לניסוי, מוערכת הצלחת הניתוח באמצעות היסטולוגיה.בסופו של דבר, התוצאות משמשות להערכת תגובות חיסוניות הומורליות מקומיות וסיסטמיות לחיסון תוך-אפי. למרות שנתיב הפיתוח של ה-null תואר לפחות באופן חלקי, מודלי עכברים עבור סיפור ה-nulls המבוססים על שבירת גן בודד (single gene knockouts) אינם זמינים כעת. כחלופה לשבירת גן בודד, כריתה כירורגית הסירה לחלוטין את ה-null ממעברי האף מבלי להשפיע על אף אחד מהרקמות.מודל עכבר זה שימש לתיאור הקשר בין ה-alt לבין חיסונים או אנטיגנים, ובין חסינות מקומית למערכתית. למרות ששיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי בסיס התגובות של המארח לחיסונים אינטראנזאליים בעכברים, היא יכולה להיות מיושמת גם למחקר של אדג'ובנטים או מוצרים פרמצבטיים אחרים העשויים להשפיע על החסינות האפית. ויזואליזציה של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים הכירורגיים נפוצים אך קשים, כיוון שאתם עובדים באזור קטן עם ראות מוגבלת וחלון זמן קצר להשלמת הפרוצדורה כדי לשמור על בריאות בעלי החיים.לפני איסוף ה-alt fill, מלא את כל הבארים של פלטת תרבית בעלת 48 בארים ב-250 µL של מצע חמים; בצע את הפעולה בדומה עבור עמודה אחת של פלטת 48 בארים שנייה. שמור על שתי הפלטות חמות עד למועד השימוש. בצע הריגה לעכבר בהתאם להנחיות ה-iacuc המאושרות, באמצעות חומרי הרדמה להזרקה ולא להשאה, במרחב עבודה אספטי. כדי לאסוף את ה-nalt, הסר תחילה את לסתו התחתונה של העכבר.בשלב הבא, נקה את אזור החך העליון בעזרת מגבוני אלכוהול ויוד תוך שימוש בלהב כירורגי מספר 11. גזור והוצא בזהירות את החך העליון תוך מעקב אחר קו המתאר הפנימי של שיני החותת ושיני הטוחנה של העכבר. קלף בעדינות את החך באמצעות פינצטה.יש להקפיד לא לקרוע את הפלט. אספו כל פלט לבאר בעמודה הראשונה של פלטת 48 הבארים הממולאת במצע. שטפו את הפלטים על ידי העברתם one by one דרך כל באר בשורה.הקשה בעדינות על המשטח בין השטיפות. לאחר שמונה שטיפות, העבירו את המשטחים לבאר מלאה במצע בלוח השני. דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C. למשך תקופת המחקר, אספו מדי 24 שעות דגימה של 100 µL מצע מכל תרבית.החליפו את המצע ב-100 µL של מצע תרבית טרי ומחומם לפני החזרת הפיתח למדגרה. סובבו במ centriugue את דגימות מצע התרבית כדי לשקעל את השאריות. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות חדשות ואחסנו אותן בטמפרטורה של -20 °C עד שניתן יהיה לבדוק את כל הדגימות באמצעות ELISA.עבור IgG, IgM ו-IgA ספציפיים לאנטיגן, או ציטוקינים מופרשים, שלושה ימים לפני הניתוח, האכילו עכברים בני שבע עד תשע שבועות במזון רטוב בעל מרקם ג'ל כדי להרגיל אותם לתחליף המזון והמים שניתן לאחר הניתוח, לפני ההרדמה. לעכבר בן שבע עד תשע שבועות ניתן תרופה לשיכוך כאבים לחלל הפה. הרדימו את העכברים בהתאם להנחיות המאושרות של ה-IUC.יש למרוח משחת para lube veto על העיניים פעם נוספת. אין להשתמש בחומרי הרדמה בשאיפה כאשר החיה כבר אינה מגיבה לצביטה של בהו, הניהו 1 mL של תמיסת סלין תת-עורית בין השכמות באמצעות מחט בכי মাপ 22 עד 28. פעולה זו מונעת התייבשות פוטנציאלית של העכבר לאחר הניתוח; באותו אופן, הניהו 0.1 mL של ream תת-עורית בין השכמות.פעולה זו מקדמת נשימה תקינה במהלך ואחרי הניתוח. הנח את העכבר במנח גב (supine) עם תמיכה תרמית. שמור על התמיכה התרמית לאורך כל הניתוח.פתחו בעדינות את הפה באמצעות שתי לולאות נפרדות של חוט תפירה כירורגי סביב השיניים החותכות העליונות והתחתונות כדי לחשוף את החיך העליון. השתמשו בלהב כירורגי מספר 11 כדי לבצע חתך באורך של כ-3 מילימטרים לאורך קו האמצע של החיך העליון באזור ה-K.Next, הכניסו מיקרו-קורט (micro curette) ברוחב 0.5 מילימטר וגרדו בעדינות תחת שני קצוות החתך כדי להפר את ה-knut. בעזרת לולאה דקה וישרה ביחידה תרמית, צרבו את החתך כדי לעצור את הדימום לאחר הצריבה.אפשרו לעכבר להתאושש על התמיכה התרמית עד שיהיה בהכרה מלאה. במהלך שלושת הימים הבאים, מזריקו לעכבר מיליליטר אחד של תמיסת מלח (saline) כדי למנוע התייבשות.כדי להעריך את מצב ההידרציה, בצעו בדיקת skin tent כדי לבדוק tga של העור. בצעו זאת עד שלוש פעמים ביום במידת הצורך. באופן דומה, העניקו תרופה לשיכוך כאבים דרך הפה פעם אחת ביום.יש לספק מזון רטוב למשך שלושה ימים לפחות לפני כל הליך ניסויי. יש להשגיח על העכברים למשך שמונה עד 10 ימים על ידי מעקב אחר העלייה במשקלם. התאוששות לקויה של המשקל מעידה בדרך כלל על ריפוי חלקי של החיך, ויש להוציא עכברים אלו ממחקרי המשך.יש לוודא את הצלחת הניתוח באמצעות היסטולוגיה. לאחר סיום הניסויים, יש להדריכה את העכבר כפי שתואר קודם לכן ולהשלים את התהליך באמצעות פריקה של חוליות הצוואר. כעת, יש להסיר את הלסת התחתונה משאר הגולגולת על ידי גזירה של תהליכי המטבע (condylar processes) באמצעות מספריים.בצעו זאת בשני הצדדים. החל מעורף הצוואר, הסירו את העור והפרווה מהגולגולת על ידי קילוף וחיתוך איטיים לכיוון הצד הוונטרלי של הקרניום. הסירו בזהירות את העור מסביב לאזור האף.לאחר מכן, גזרו את העור מקצה החוטם והסירו אותו לחלוטין. כעת נתקו את הגולגולת מהחוליות באמצעות המספריים. הכניסו את המספריים אל ה-foramen magnum של הגולגולת וגזרו עד למחצית קו האמצע של הגולגולת.פעולה זו מאפשרת חדירה של הפורמין לרקמות הרכות במהלך הקיבוע. קבעו את הגולגולת בפורמלין 10% בבופר ניטרלי למשך 24 שעות. למחרת, בטמפרטורת החדר, בצעו דקלציפיקציה לדגימה על ידי הנחתה בקסטרה, עטיפת הקסטרה בגזה והנחתה בבקבוק המכיל תערובת של חומצההפורמית.דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לאחר 12 שעות. נקו את הדגימה ושטפו אותה תחת מי ברז למשך 20 דקות. באמצעות להב תער, גזרו את הדגימה עד למחיצה (septum) והעבירו את מחלולי העין. לאחסון לטווח קצר, ניתן לשמור את הדגימה ואת הקסטה ב-10%NBF.בעת ההטמעה, ודאו שקצה ה-ssam מוטמע כלפי מטה אל תוך הפרפין וקצה הקסטה ממוקם בחלקו העליון של קצה מחסום העין. לאחר מכן, המשיכו למלא את החלק העליון של הקסטה בפרפין והמתינו לקירור לפני הנחתה על המיקרוטום. כאשר הדבר מוכן, בצעו בדיקה היסטולוגית סטנדרטית.הכינו חתכים רוחביים בעובי של five micron של הגפה והפעילו צביעת h ו-d. אישור של השמדת העצב באמצעות בדיקה היסטולוגית הוא חיוני לצורך פרשנות התוצאות ויש לבצעו לאחר השלמה מוצלחת של כל ניסוי. היעדרם של תאי mononuclear בצביריות בצד של ה-alt מהווה אינדיקציה להשמדה מוצלחת.חתך רוחבי בצביעת h and e של אזור הסינוסים הנחירים המקיפים את ה-knt נראה בדרך כלל כצבירי תאים בעלי גרעין העטופים בשכבת תאי אפיתל קילומטרית. לאחר הניתוח, צריכה להיות הפרעה ניכרת לחך העליון וכן לשלמות ה-nat. לאחר ההחלמה מהניתוח, החתך צריך להיות סגור וחלל האף נקי מ-nat. לעכברים מוחדר חיסון STX המנוסח עם אדג'ובנט המפעיל את toll-like receptor four.בקרי המסלול קיבלו תמיסת מלח בלבד או חיסון ללא אדג'ובנט בתרבית. תאי NALT שהתגלו בקבוצות הניסוי הפרשו אימונוגלובולינים ספציפיים לאנטיגן אל תוך המצע, אשר נמדדו באמצעות Eliza. השוואה בין שתי דרכי מתן של החיסון הראתה כי כמויות הגדולות ביותר של IgA שוחררו על ידי NALT שהתקבל מעכברים שחוסנו באופן תוך-אפי (intranasally) באמצעות חיסון סאב-יחידה.בשילוב עם דגימות ביולוגיות נלוות שהושגו מעכברי ביקורת או עכברים חסרי MALT, ניתן להשתמש בעכברים לאפיון התגובה החיסונית in vivo לאנטיגנים נזאליים. להשוואה עם תוצאות תרביות הרקמה, התגובות של IGA ו-IgG לחיסון תוך-נזאלי פחתו באופן משמעותי ללא רמות MALT תפקודיות; רמות של IGA ספציפי לאנטיגן היו בדרך כלל גבוהות יותר מ-IgG בהפרשות ריריות של עכברים מחוסנים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים את איסוף הצבירים והתרבית בתוך כ-30 דקות עבור צביר אחד, כולל נקודת זמן אחת של איסוף לאחר 24 שעות.בביצוע נכון, עובד מיומן יכול לאסוף ולתרבות מספר נאטים (nats) ביום אחד. הגרידה מתחת לחך חייבת להיות מספיקה כדי להסיר את הנאט. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד במהירות כדי למנוע איבוד דם.פעולה זו תאפשר ויזואליזציה ברורה של החתך ותשמור על בריאות בעלי החיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי הדרך לבחון את תרומת ה-MALT של העכבר לתגובות חיסוניות מקומיות ומערכתיות לאחר חיסון תוך-אפי (internasal).

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים...

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

הדבקה אינטראנזאלית בנגיף ההרפס של העכבר בעכברים להערכת תגובות חיסוניות של המארח

חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן לשפר מאוד וניתן להפחית מינוני חיסון.

Intralymphatic חיסוני וחיסון בעכברים

אנו מתארים הדמיה של בעלי חיים שלמים וטכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה לניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון עם ננו-חלקיקים במודל חיסון עכברי.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

אנו מפרטים כאן את המתודולוגיה שננקטה כדי להשוות את יעילות ההגנה והתגובה החיסונית של הריאות הנגרמת על ידי חיסון תוך-אף ותת עורי עם BCG במודל עכבר. התוצאות שלנו מראות את היתרונות של חיסון ריאתי ומצביעות על תפקיד לתגובה בתיווך IL17 בהגנה הנגרמת על ידי חיסון.

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג'וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טיפולית.

מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s), המעורבים בדלקת מסוג 2, משתתפים בעיקר בתגובה לזיהום הלמינת'ס, מחלות אלרגיות, הומאוסטזיס מטבולי ותיקון רקמות. במחקר זה מודגם הליך לבידוד ILC2s מרירית האף וזיהוי הביטוי של CD226.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה למניעת זיהום דם בנוזל שטיפת האף של העכברים (NLF). מכיוון ששיטה זו מבטיחה איסוף NLF ללא זיהום דם, היא מאפשרת זיהוי מדויק יותר של רכיבים אימונולוגיים ופתוגנים נשימתיים שונים.

איסוף נוזלי שטיפת אף של עכברים ללא זיהום דם

חקור את תפקידן של רקמות לימפואפיתליות קשורות לאף וללוע (NALT) בתגובות חיסון אצל עכברים באמצעות מודל ניתוחי ותרביות אקס ויוו. שיטה זו מאפשרת הערכת חסינות מקומית ומערכתית.

לבחון את תפקידה של רקמות האף והלוע הקשורים Lymphoreticular (NALT) בתגובות עכבר לחיסונים

גלה סרטונים נוספים