Name: תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: למד סינתזה אוטומטית של אוליגוסכרידים ופונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פוליאנהידריד. שיטה זו מאפשרת מיקוד לקולטנים על תאי מציגי אנטיגן במחקרי נוירומדעים ותרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות צבא ארה&quot;ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (גרנט # W81XWH-10-1-0806) ואת מכון הבריאות הלאומי (מענק # U19 AI091031-01 וגרנט # 1R01GM090280) עבור תמיכה כספית. BN מודה Professorship Balloun ב כימיים והנדסה ביולוגית ו NLBP מודה Professorship וילקינסון להנדסה הבינתחומי. אנו מודים ג&#39;וליה ולה על עזרתה בביצוע ניסויים functionalization nanoparticle.

1. תפוקה גבוהה פחמימות סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סינתזה אוטומטית של dimannoside, התורם סוכר מוגן כראוי, בדרך כלל trichloroacetimidate, ו acceptor, בעיקר אלכוהול fluorous alkenyl, מסונתזים על העליונה הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנית כתוב לסינתזה אוטומטי של dimannoside. ייצוג סכמטי של הליך אוטומטי בסיסי מוצג באיור 2. בתוכנית, הוא הבטיח כי לפני תוספת של האמרגן, תערובת של התורם acceptor הוא עורר דקות לפחות 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות של acceptor סינטטי התורם, והוא trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate מתקבלות dichloromethane. טולואן dichloromethane משמשים לרוב לתגובות glycosylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, להכין פתרונות של חומרים כימיים עבור deprotection של קבוצות הגנה זמניים מתנול 80% ו 100% מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התוכנית, להבטיח כי relatלחות ive בחדר היא 30% או נמוך בתא אוטומציה. לחות גבוהה מזיקה לתגובות glycosylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תוכנית כלשהי, תוכנית זרוע רובוטית מעבירה את הפתרונות של התורם acceptor לתוך בקבוקון התגובה ברצף. לאחר מכן התערובת הוא עורר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא את הזרוע הרובוטית מעביר 0.2 עד 0.3 ושווי של trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate לתוך התערובת, בדרך כלל בטמפרטורת החדר אך בטמפרטורות נמוכות יותר כמו -20 מעלות צלזיוס ניתן להשיג. תערובת התגובה היא עוררה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות, התגובה היא עצרה aliquot קטן הסיר כדי לפקח על ההתקדמות התגובה. אם לא מלאה, התגובה יכולה להמשיך, ובסופו של דבר את הזמן הנדרש יכול להיות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובה הושלמה, התגובה התערובת מועברת על fluorous מוצקים מיצוי שלב (FSPE) מחסניות המכילות C 8 F-17 שונה סיליקה ג&#39;ל לטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העגלהרכסים נשטפים 1 בתערובת מתנול, מים 80% (8 מ&quot;ל) להיפטר חלק בלתי fluorous. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז המחסניות נשטפים עם מתנול 100% כדי להשיג את המוצר fluorous-מתויג הרצוי. אם טיהור נוסף הוא הרצוי, המכונה ניתן פסק המוצר התגובה (ים) להסיר לטיהור באמצעים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מחזור טיהור, זרוע רובוטית מחלק methoxide נתרן לתוך בקבוקון התגובה. התגובה היא עוררה עבור שעות 2. אם לא מלאה, התגובה יכולה להיות שוב נמשך תקופה ארוכה יותר, ובסופו של דבר הזמן מתוכנת הנדרש יכול להיות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת התגובה, המוצר מטוהרים על ידי FSPE וכפופים ואחר כך פירוק של טולואן נטול מים ואחריו אידוי מים כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן במחזור (מ שלב 6 עד 13) חוזר על עצמו עד אורך השרשרת הרצוי מתקבל עבור המולקולה היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוצר מוגן להשיג אוטומציה היא הen מטוהרים נוסף מאופיין במלואו על ידי טכניקות כגון תהודה מגנטית גרעינית וספקטרוסקופיה (NMR). Deprotection מלאה (הסרה של כל קבוצות הגנה הנותרים) של מולקולת המטרה הסופית הושלמה אז מחוץ פלטפורמת אוטומציה ככלל כי זה בדרך כלל גז מימן פלדיום נפץ. צעד deprotection הסופי בוצע על העליונה הספסל מחוץ פלטפורמת אוטומציה. הצעד הראשון היה ozonolysis של הקשר הכפול תג fluorous ואחריו חמצון אלדהיד המיוצר לחומצה carboxylic. המוצר היה מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה בעמודה. השלב האחרון היה deprotection של קבוצות האתר בנזיל ידי הידרוגנציה פלדיום catalyzed. המוצר עבר דרך celite משטח להיפטר פלדיום לקבל את המוצר הסופי טהור. </li></ol> 2. תפוקה גבוהה משטח Nanoparticle functionalization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוקה גבוהה סינתזה פולימר ייצור nanoparticle מתבצעת בעקבות יחסי ציבור באותוotocol ו רובוטית להגדיר שתואר על ידי פטרסון ואח&#39; 19. מערכות קופולימר המשמשים ייצור החלקיקים מבוססים על חומצה sebacic (SA) ו - 1,6-bis (para-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), ו 1,8-bis ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) ו CPH. ייצוג סכמטי של המנגנון בתצהיר רובוטית מנוצל מוצג באיור 1 ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ייצור nanoparticle, בעל המכיל צינורות עם הספרייה nanoparticle הוא לחבר מחדש לשלב מפעיל ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הקשר של פחמימות לפני השטח של חלקיקי polyanhydride, אמין, carboxylic צימוד חומצה תגובה 20 המורכב משתי תגובות רצופות מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על התגובה הראשונה, את המזרק משאבת מזרק 1 לתכנות מלא (10 ושווי eq.) (שווי של ריכוז חומצת טוחנת הממוצע carboxylic על פני החלקיקים) של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-CArbodiimide hydrochloride (EDC) ו 10 EQ. של ethylenediamine בתמיסה מימית, בעוד את המזרק משאבת מזרק 2 לתכנות טעון עם EQ 12. של N-hydroxysuccinimide (NHS) בתמיסה מימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת LabVIEW, המתלים מגיב אף הם לזכות * הספרייה nanoparticle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, כל דגימה היא sonicated (30 של הרץ 40) ובעל צינורית מנותקת פלטפורמה רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים nanoparticle מודגרת במשך 9 ** H עם סיבוב קבוע על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי זמן תגובה הושלמה, צינורות centrifuged (12,000 XG דקות 5) וחזרה לתחנת רובוטית לבצע שני צעדים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכביסה, מזרק נשאר ריק טעון משאבת מזרק 1 לתכנות תוך המזרק משאבת מזרק 2 מלא מים קרים. Supernatant בצינור כל אחד מכונס בתוך מזרק ריק הפקדונות משאבת השנייה במים קרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenization של ננוההשעיה החלקיקים מתבצע כמתואר על צעד 2.6. צינורות centrifuged מכן (12,000 XG דקות 5), צעד לשטוף 2 מבוצעת כמתואר על צעד 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה 2, שני צעדים בתצהיר משמשים. בשלב בתצהיר הראשון, 12 EQ. EDC של נטענים עם משאבה אחת 12 EQ. שירותי הבריאות של נטענים עם המשאבה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד בתצהיר 2 כולל 10 EQ. של saccharide ספציפי על המשאבות הראשון והשני (כלומר, גלקטוז, לקטוז או di-מנוז) *** ואת משאבת 3 עם EQ 10. של חומצה גליקולית (משמש השליטה ****). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים nanoparticle הוא נאחד את כמתואר על הצעד 2.6 ו מודגרות עבור H 9 עם סיבוב קבוע על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן התגובה הושלמה, צעד לשטוף מבוצעת כמתואר 2.8 צעדים, 2.9 ו 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספרייה nanoparticle פונקציונליות ממוקם מכן בתא ואקום להתייבש במשך שעה לפחות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקים פונקציונליות הם אז האופיציון תקן של ספקטרוסקופיה רנטגן Photoelectron ו assay גבוהה התפוקה פנול, חומצה גופרתית כדי לקבוע את הרכב פני השטח וריכוז saccharide בהתאמה. מיקרוסקופיית אלקטרונים פיזור אור דינאמי מנוצלים כדי לקבוע גודל החלקיקים, התפלגות גודל, ולחייב פני השטח. </li></ol> הערות: * כרכים הפקדת להשתנות עם המסה של חלקיקים המצויים צינור אחד. ראה הערה זמני התגובה עבור תגובות הראשון והשני ניתן לשנות כדי להתאים את ריכוז saccharide הסופי. *** כל saccharide מופקד לתוך מבחנות, תלוי הקבוצה הרצויה. **** לתגובה ספציפית מועסקים במחקר זה על החיבור של פחמימות, חומצה גליקולית משמש פקד מקשר מאז saccharides deprotected כבר יש את המולקולה קשורה קוולנטית, המאפשרת התקשרות נוספת אל פני השטח nanoparticle. 3. נציג תוצאות פולdimannoside LY מוגן שמוצג באיור 2 היה מסונתז באמצעות פלטפורמת אוטומציה. מתחם מסונתז התאפיין 1 H NMR ב ספקטרומטר 400 MHz VXR באמצעות CDCl 3 ממס. ספקטרום NMR מוצגת באיור 3. ניצול ייצור תפוקה גבוהה nanoparticle ו functionalization של polyanhydride חלקיקים המתואר כאן, מצורף של dimannose, לקטוז וגלקטוז בוצע בהצלחה 10, 11. באמצעות הגדרת, התנאים התגובה אופטימליים (כלומר, טמפרטורת התגובה וזמן) זוהו להשיג functionalization nanoparticle הרצוי ומורפולוגיה. כאשר התגובה בוצעה על 4 מעלות צלזיוס במקום בטמפרטורת החדר, הפחתת הצטברות nanoparticle נצפתה על ידי SEM (מידע לא מוצג). טבלה 1 מציגה תוצאות נציג של אפיון של CPTEG 50:50 פונקציונליות: חלקיקים CPH גם עם DI-מנוז אולקטוז, מסונתז על 4 ° C. הנתונים מצביעים על עלייה קטנה בקוטר nanoparticle הממוצע בשל functionalization. בעוד הלא פונקציונליות חלקיקים היה פוטנציאל שלילי של כ zeta. -20 MV, חלקיקים פונקציונליות הראה ערך חיובי זיטה פוטנציאל, הוכחת functionalization מוצלח של nanoparticle פני השטח. לקטוז DI-מנוז הן סוכרים נייטרליות, אולם קבוצות האמין חינם של אתילן diamine מקשר מנוצל כדי לצרף את saccharides עשוי להיות אחראי פוטנציאל זטה חיובית. זמן התגובה הוא משתנה נוסף שיכול להשפיע הן על מורפולוגיה הסופי של חלקיקים ואת מידת הקשר סוכר מושגת. על ידי התאמת זמן תגובה, ריכוז הסוכר הסופי מחובר אל פני השטח חלקיקים יכול להיות נשלט, כפי שמוצג באיור 4 א. כצפוי, ריכוז dimannose על פני השטח של 50:50 CPTEG: CPH חלקיקים מוגברת עםהזמן הכולל של התגובה והגיע לכל היותר אחרי שעה 18. חלקיקים פונקציונליות עם הזמן 24 שעות התגובה הכולל שימשו להעריך את יכולתם למקד CLRs על העכבר מח עצם תאים דנדריטים הנגזרים (DCS). Cytometry זרימת שימש כדי להעריך את הביטוי של שני קולטנים Cl (כלומר, CIRE (CD209, DC-סימן) ו הקולטן מנוז (CD206)) לאחר גירוי עם הלא פונקציונליות, ו לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליות (איור 4B). ביטוי גבוה יותר של קולטנים הצדדים, אשר מעידים על מיקוד יעיל, הושג כאשר תאים היו מגורה עם שני לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליות. עם זאת, די, מנוז, פונקציונליות חלקיקים הראו רמה גבוהה יותר של ביטוי המציין הספציפיות של ליגנד זה הקולטנים שהיו הנלמדים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Nanoparticle סוג </td><td> חלקיקים בקוטר ממוצע (ננומטר) </td><td> שד &#39;זעם החלקיקים ζ-פוטנציאל (mV) </td></tr><tr><td> ללא פונקציונליות </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0.6 </td></tr><tr><td> לקטוז </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2.4 </td></tr><tr><td> Di-מנוז </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4.2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. אפיון Nanoparticle. ללא פונקציונליות לבין פונקציונליות התאפיינו פיזור אור אלסטי מעין ומדידות זטא פוטנציאליים. גודל החלקיקים הנתונים מייצגים את הערך הממוצע ± סטיית תקן (SD) של נתונים דינמיים פיזור האור שנאספו שלושה ניסויים בלתי תלויים. נתונים זטא פוטנציאליים מייצגים ערך ממוצע ± סטיית תקן של שלוש קריאות עצמאיים. שינוי סימן של פוטנציאל זטה מוכיח כי הסוכר היה מצומדות ביעילות CPTEG 50:50: משטח nanoparticle CPH. <img alt="איור 1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1 (א) ייצוג גרפי של גישה רדף עם functionalization פחמימות של חלקיקים polyanhydride ודוגמה של ספריות nanoparticle פונקציונליות שיכול להיות מתוכנן עם גישה תפוקה גבוהה תיאר. (ב) ייצוג סכמטי של המנגנון האוטומטי בתצהיר ישמש functionalization החלקיקים, אשר מורכב (אני) שלושה NE 1000 משאבות, (ב) שלב רובוטית משולב על ידי שני מפעילים (Zaber): אחד עבור תנועה בכיוון x והשני תנועה בכיוון y: (ג) שלב 2 רובוטית עם שני מדפים סמוכים (מתאים צינורות cuvettes) בהרכב של שלושה מפעילים, אחד לכל כיוון (X, Y ו-Z). המשאבות, בסך הכל חמישה מפעילים מחוברים בסדרה. מפעילים משאבות מופעלות על ידי מחשב באמצעות תוכנת LabVIEW. בתרשים זה לא קנה מידה.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג גרפי של אוטומטי חוזר ונשנה סינתזה של פחמימות באמצעות מנוז כדוגמה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> איור 3. 1 H NMR של dimannoside מוגן. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> איור 4. () השפעת זמן התגובה על ריכוז nanoparticle פני השטח של saccharide. את הנתונים המוצגים, 50:50 CPTEG: חלקיקים CPH היו פונקציונליות עם dimannose לפעמים תגובה אחרת והתגובה בוצע ב 4 ° C. השגיאה הממוצע ורמת בשני ניסויים בלתי תלויים functionalization מוצג. (ב) לקטוז DI-מנוז חלקיקים פונקציונליותלמעשה היעד הקולטן DC-סימן (CIRE, CD209) ו מנוז (CD206) על מח עצם שמקורם תאים דנדריטים כפי שתואר על ידי ביטוי מוגבר של שני סמנים לאחר גירוי עם CPTEG 50:50 פונקציונליות: חלקיקים CPH בהשוואה הביטוי המתקבל עם הלא פונקציונליות חלקיקים.

<ol><li>Zepp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+vacine+design-lessons+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Principles of vacine design-lessons from nature.</a> Vaccine. 28, C14-C24 (2010).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+Consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+immune+response+of+alveolar+macrophages+by+targeting+different+C-type+lectin+receptors+using+%22pathogen-like%22+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles.</a> Biomaterials. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Song, E. -H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose-functionalized+%22pathogen-like%22+polyanhydride+nanoparticles+target+C-type+lectin+receptors+on+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells.</a> Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipilic+polyanhydrides+for+stabilization+of+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens.</a> Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
<li>Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dendritic+cells+with+biomaterials%3A+developing+the+next+generation+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines.</a> Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).</li>
<li>Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+C-type+lectin+specific+for+galactose%2FN-acetylgalactosamine+is+an+endocytic+receptor+expressed+on+monocyte-derived+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 20686(2002).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+through+C-type+lectin+receptors%3A+shaping+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+oligosaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated oligosaccharide synthesis.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Carbohydrate+Synthesis+as+Platform+to+Address+Fundamental+Aspects+of+Glycobiology-Current+Status+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Carb.+Res%22%5BJournal%5D)">Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges.</a> Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).</li>
<li>Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+solution-phase+automated+iterative+synthesis%3A+fluorous-tag+assisted+solution-phase+synthesis+of+linear+and+branched+mannose+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+and+high-throughput+protein+release+from+polymer+film+and+nanoparticle+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Song, E. -H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multivalent+tuberculosis+and+Leishmania-associated+capping+carbohydrates+reveals+structure-dependent+responses+allowing+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).</li>
<li>Hakamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+in+tumor+and+tumor+associated+carbohydrate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens.</a> Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).</li>
<li>Atherton, T., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+T+%22Solid-phase+peptide+synthesis%3A+a+practical+approach%22">Solid-phase peptide synthesis: a practical approach</a>. , Oxford Univ Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+chemistry+and+the+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses.</a> Science. 230, 281-285 (1985).</li>
<li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li>
<li>Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li>
<li>Pohl, N. L. Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPohl%2C+NL+%22Chemical+Glycobiology%22">Chemical Glycobiology</a>. Chen, X. H. R., Wang, G. P. , American Chemical Society. Washington, DC. 272-287 (2008).</li>
</ol>

NLBP הוא המייסד ובעל מניות בחברה פחמימות LuCella Biosciences, Inc

היעילות של פחמימות כמו מיקוד סוכנים אינטראקציות nanoparticle ישירות לתאי מערכת החיסון הוכח בעבר 10, 11. מחקר קודם במעבדות שלנו הראו כי סוכרים ספציפיים המחוברים חלקיקים polyanhydride מסוגלים למקד CLRs שונים על תאים מציגי אנטיגן (נגמ&quot;שים), ובכך משפרים את ההפעלה של תאים חיסוניים אשר עשוי להיות חשוב עבור הפעלה נוספת תא T 10, 11. עם זאת, על מנת להשיג מיקוד אופטימלי פרמטרים כגון מספר כמו כימיה polyanhydride, גודל, סוג של סוכר סוכר או צפיפות המשטח צריך להיות מו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ממונע שלב XYZ: 3x T-LSM050A, 50 מ&quot;מ נסיעות לכל ציר </td><td> Zaber טכנולוגיות </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 משאבת מזרק יחיד </td><td> חדשות משאבה עידן מערכות </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> פיירקס * Quick Vista * לשימוש חוזר ללא מסגרת צינורות זכוכית תרבות </td><td> קורנינג </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed טכנולוגיות </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> לאומי מכשירים </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE גז מזרקים צמודים, Luer לוק </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> מיני צינור מסובבי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים polyanhydride

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

גישות Transdisciplinary מעורבים בתחומים כגון עיצוב החומר, ננוטכנולוגיה, כימיה, אימונולוגיה צריך להיות מנוצל באופן רציונלי לעצב יעילים ספקי חיסונים. Nanoparticle מבוססי פלטפורמות יכול להאריך את ההתמדה של אנטיגנים החיסון, אשר יכול לשפר את החיסון immunogenicity 1. פולימרים מתכלים מספר נחקרו כמו אספקת כלי רכב חיסון 1, בפרט, חלקיקים polyanhydride הוכיחו את היכולת לספק שחרור מתמשך של אנטיגנים חלבון יציב להפעיל תאים מציגי אנטיגן לווסת את המערכת החיסונית 2-12. עיצוב המולקולרי של חיסון אלו נושאות צריך לשלב את הבחירה הרציונלית של תכונות פולימרים, כמו גם שילוב של סוכני מיקוד המתאימים. ייצור תפוקה גבוהה של מיקוד אוטומטי ligands וחלקיקים פונקציונליות הוא כלי רב עוצמה שישפרו את היכולת ללמוד r רחבange נכסים ויוביל בעיצוב של מכשירים משלוח לשחזור החיסון. תוספת של מיקוד ligands מסוגל להיות מוכר על ידי קולטן ספציפי על תאים של מערכת החיסון הוכח לווסת ואת התגובה החיסונית חייט 10,11,13 C מסוג קולטנים lectin (CLRs) הם זיהוי תבניות קולטנים (PRRs) המזהים פחמימות קיים פני השטח של פתוגנים. גירוי של תאים חיסוניים באמצעות CLRs מאפשר הפנמה משופרת של אנטיגן והצגתו לאחר מכן על הפעלה נוספת תא T 14,15. לכן, מולקולות פחמימות תפקיד חשוב במחקר של התגובה החיסונית, אולם השימוש של ביומולקולות אלה לעיתים קרובות סובל מחוסר זמינות של מבנית מוגדרת היטב ופחמימות טהורות. פלטפורמת אוטומציה מבוסס על פתרון איטרטיבי, שלב התגובות יכול לאפשר סינתזה מהירה ומבוקרת של מולקולות אלה מאתגרים סינטטי שימוש ב נמוך משמעותיתuilding כמויות לחסום יותר מוצק שלב שיטות מסורתיות 16,17. במסמך זה אנו מדווחים פרוטוקול לסינתזה פתרון שלב אוטומטית של אוליגוסכרידים כמו מנוז מבוססי ligands מיקוד עם מיצוי מוצק בשלב fluorous לטיהור ביניים. לאחר פיתוח של שיטות אוטומטיות כדי להפוך את הסוכן פחמימות המבוססת על מיקוד, אנו מתארים את דרכי ההתקשרות שלהם על פני השטח של חלקיקים polyanhydride העסקת מערכת רובוטית אוטומטית את ומופעל על ידי LabVIEW כפי שתואר קודם לכן 10. Functionalization משטח עם פחמימות הראו יעילות מיקוד CLRs 10,11 והגדלת התפוקה של שיטת ייצור לחשוף את המורכבות הקשורות במערכת רב פרמטרית יהיה בעל ערך רב (איור 1 א).

במאמר זה, שיטת תפוקה גבוהה מוצג לסינתזה של אוליגוסכרידים ו חיבורן אל פני השטח של חלקיקים polyanhydride לשימוש נוסף מיקוד קולטנים ספציפיים על תאים מציגי אנטיגן.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

יש להשתמש בגישות רב-תחומיות המערבות תחומים כגון עיצוב חומרים, ננוטכנולוגיה, כימיה ואימונולוגיה כדי לתכנן באופן רציונלי...

במאמר וידאו זה, אנו מתארים פרוטוקול חדשני עבור סינתזה אוטומטית של אוליגוסכרידים בשלב התמיסה ופונקציונליזציה של ננו-חלקיקים פולי-אנהידרידים. באמצעות חומרי יעד מבוססי פחמימות אלו, ראשית מסנתזים מולקולות פחמימות באמצעות מערכת אוטומטית המשתמשת בסינתזה בשלב התמיסה במקום בסינתזים בשלב המוצק. לאחר מכן, תוצרי הביניים של האוליגוסכרידים מופקים באמצעות מיצוי בשלב המוצק מסוג florist, או FSPE.מולקולות הפחמימות שהופקו מאופיינות באמצעות NMR ולאחר מכן הן מחוברות לננו-חלקיקי הפולי-אנहाइडריד על ידי צימוד carbodiimide. לבסוף, ננו-חלקיקים פונקציונליים עם פחמימות מאופיינים באמצעות ספקטרוסקופיית פוטו-אלקטרונים בקרני X (x-ray photoelectron spectroscopy) ובדיקת hydro-phenyl sulfuric acid. בסופו של דבר, תוך שימוש במתודולוגיית ה-hydro-put המתוארת כאן, הושגו תנאי התגובה לאופטימיזציה של מורפולוגיית הננו-חלקיקים וצפיפות הפחמימות על פני השטח של החלקיק.היתרון המרכזי של שיטה זו על פני השיטות הקיימות, כגון סינתזת אוליגוסכריד על פני מוצקים, הוא שבשיטה זו אנו משתמשים בכמות נמוכה משמעותית של אבני בנייה. בשיטה זו, אנו משתמשים בדרך כלל בשני עד שלושה שווים במקום ב-10 עד 20 שווים. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר הדגמנו את היעילות של אפקטים של פני השטח, פונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פולי-הידרו, תוך שימוש בפחמימות כדי להתמקד ברצפטורים על תאי דנטה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שפיתוחן של פלטפורמות אוטומטיות עבור סינתזה בתושבה גבוהה של אוליגוסכרידים והצמדתם לחלקיקי פולימר הוא תחום מחקר חדש שאינו כולל תיעוד רב לפני הסינתזה האוטומטית של חומצה דיאנו. תורם סוכר מוגן באופן מתאים, בדרך כלל tri chloro acetamide, ומקבל בעיקר ב-Alcon, fluorous alcohol, מסנתזים על גבי שולחן המעבדה ומכינים ב-chloro methane. כמו כן, יש להכין trimethyl silo, tri fluoro methane sulfonate ב-chloro methane, 80% methanol ו-100% methanol. יש לוודא שהלחות היחסית בחדר היא 30% או פחות בתא האוטומציה.לחות גבוהה מזיקה לתגובות גליקוזילציה. השלבים הבאים מבוצעים באמצעות פלטפורמת אוטומציה. הגליקוזילציה הראשונה מבוצעת עם התורם והאלכוהול הפלוריסטי.עם סיום התהליך, מולקולת הסוכר עם תג ה-florist המתקבלת מטוהרת באמצעות FSPE. לאחר מכן, קבוצת ההגנה הזמנית מוסרת על ידי sodium methoxide ו-methanol, והמוצר מטוהר שוב באמצעות FSPE. לאחר מכן, סוכר תג ה-florist משמש כמקבל (acceptor) ומצומד לאותו תורם (donor) כדי להפיק את הדיסכריד; הדיסכריד מטוהר באמצעות FSPE לצורך התחלת העבודה.הנח את הרכיבים, כולל את המקדם של התורם והמקבל, מים עם 80% methanol, 100% methanol, ו-sodium meth oxide בפלטפורמה הרובוטית, והפעל את התוכנית. הזרוע הרובוטית תשאב את התורם ולאחר מכן את המקבל מהמבחנות ותעביר אותם למבחנת תגובה. לאחר מכן, תערובת התורם והמקבל תערבב למשך 30 דקות.לאחר שחלפו 30 דקות, הזרוע הרובוטית מעבירה trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate קטליטי לתוך התערובת. לאחר מכן, התמיסה נערבבת למשך 30 דקות נוספות. עם סיום הערבוב, התוכנית נעצרת.הסעירו אליקוט של 10 µL כדי לבדוק באמצעות כרומטוגרפיה על שכבה דקה (TLC) אם התגובה הושלמה. אם התגובה הושלמה, מולקולת המקבל לא תיראה. אם התגובה לא הושלמה, המקבל עדיין יהיה גלוי ב-TLC.במקרה זה, הפסיקו את התוכנית, אפסו את תזמון הגליקוזיליציה לסביבות 30 דקות, והוסיפו עודף של המקדם trimethyl silo, tri fluoro, methane sulfonate. כאשר התגובה הושלמה, המשיכו לשלב הבא. עם סיום התגובה, הרובוט מעביר את תערובת התגובה למחסניות FSPE המכילות סיליקה ג'ל משונה ב-C nine F 17 לצורך טהרה.בשלב הבא, שוטפים את המחסניות עם שמונה מיליליטרים של 80% methanol, ולאחר מכן עם שמונה מיליליטרים של 100% methanol. כדי לסלק את הפראקציית ה-non floris, אוספים את הנוזל העובר (flow through) למבחנה כדי לקבל את מוצר ה-florist tagged הרצוי. אם נדרש ניקוי נוסף, יש לעצור את הרובוט ולהוציא את תוצרי התגובה המתאימים.בהתאם למבנה, תורמים עשויים להיות חסרי תגובתיות באופן קיצוני, וחלק ממולקולת המקבל של הפרוריסט תישאר גם לאחר הוספת קידום מספיק. במקרה זה, FSPE לא תהיה יעילה מספיק לניקוי, וניתן לבצע ניקוי נוסף באמצעות כרומטוגרפיית עמודה של סיליקה ג'ל לאחר הניקוי; הזרוע הרובוטית מחלקת נתרבית מתוקסיד לתוך מבחנת התגובה. לאחר מכן, התגובה נערבבת למשך שעתיים בפלטפורמה הרובוטית; אם התגובה אינה שלמה כפי שנקבע באמצעות TLC, יש להאריך את תקופת הדגירה בכשעה.לאחר השלמת התגובה, מטהרים את התוצר באמצעות FSPE כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, מוציאים את תוצר התגובה מהרובוט ובסביבת שולחן העבודה מעבירים אותו להמסה בטולואן אנहाइडרמנית, ולאחר מכן למאיור כדי להסיר שאריות מים. ברגע שהדגימה יבשה, מחזירים אותה לרובוט למחזור זהה הכולל טיהור גליקוזילציה באמצעות FSPE.הגנה עמוקה של קבוצת ההגנה הזמנית, ולאחריה גליקוזילציה, חוזרת על עצמה עד להשגת אורך השראו desired עבור המולקולה המטרה; כדי להסיר את ההגנה מהמוצר המוגן שהתקבל מהאוטומציה, יש להוציא את המבחנה מהרובוט. השלבים הסופיים של הפרוצדורה משתמשים בגז מימן נפיץ ויש לבצעם מחוץ לפלטפורמת האוטומציה. על משטח העבודה, מתרחשת אוזוליזה של הקשר הכפול בתג ה-florist, ולאחריה חמצון של האלדהיד שנוצר לחומצה קרבוקסילית.טהרו את המוצר שהתקבל באמצעות כרומטוגרפיה על עמודת סיליקה ג'ל על גבי שולחן העבודה, תוך שימוש בתערובת של 30% methanol ב-di chloro methane. לבסוף, כדי להסיר את הגנת קבוצות ה-benzo ether באמצעות הידרוגנציה המזורזת בפלדיום, העבירו את המוצר דרך satellite pad כדי להסיר את הפלדיום ולקבל מוצר סופי טהור. אפתרו את המוצר באופן מלא באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית או NMR.סינתזה של פולימרים ויצירת ננו-חלקיקים בתפוקה גבוהה מבוצעות על פי הפרוטוקול שתואר על ידי Peterson et al. כפי שמצוין במסמך המצורף, מכשיר השקיעה האוטומטי המשמש לפונקציונליזציה של חלקיקים מורכב משלוש משאבות ne 1000, במה רובוטית המשלבת שני אקטואטורים, אחד לתנועה בציר X והשני לתנועה בציר Y, ובמה רובוטית שנייה עם שני מדפים סמוכים המורכבים משלושה אקטואטורים, אחד לכל כיוון. המשאבות וסך של חמישה אקטואטורים מחוברים בטור ומופעלים על ידי מחשב באמצעות תוכנת lab view.מערכות הפולימרים המשמשות לייצור החלקיקים מבוססות על חומצה SEBA או SA, ועל 1,6-bis(para-carboxy)cyclohexane (או CPH), ו-1,8-bis(para-carboxy)phenoxy-3,6-dioxanoctane (או CP Teeg). לאחר ייצור הננוחלקיקים, הניחו מעמד המכיל מבחנות צנטריפוגה בנפח 1.7 milliliter עם ספריית ננוחלקיקים על שלב המפעיל הליניארי לצורך חיבור פחמימות לפני השטח של חלקיקי הפוליאנהידריד, ובצעו תגובת צימוד של חומצה קרבוקסילית המורכבת משני תגובות רצופים. עבור התגובה הראשונה, מלאו מזרק במשאבת מזרקים תכנותית בתמיסה מימית של EDC ואתילן דיאמין בריכוזים של 2 mg/mg של ננוחלקיקים ו-0.6 mg/mg של ננוחלקיקים, בהתאמה.מלאו מזרק שני במשאבה תכניתית עם תמיסה מימית של 2.5 מיליגרם למיליגרם של חלקיקי NHSA, בסך הכל 12 שווהויות לדגימת ננו-חלקיק. לאחר מכן, באמצעות תוכנת ה-LabVIEW, הנחו את הרובוט להטיל את תרחיפי הרכיבים לתוך ספריית הננו-חלקיקים. מפעיל הרובוט יעביר את מחזיק המבחנות למיקום הנכון בפלטפורמה עבור חלוקת התמיסות, EDC ו-NHS.הפעילו את קבוצות חומצה הקרבוקסילית על פני השטח של ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד ואפשרו הצמדה ממוצעת. לאחר מכן, הכניסו את ראש הסוניקציה לתוך כל מבחנה ובצעו סוניקציה לכל דגימה למשך 30 שניות בתדר של 40 hertz. לפני המעבר לדגימה הבאה, נקו את הראש בעזרת אצטון.לאחר שכל הדגימות מוכנסות, מנתקים את מחזיק המבחנות מהפלטפורמה הרובוטית. מדגירים את תרחיפי הננו-חלקיקים למשך תשע שעות ברוטציה קבועה בטמפרטורה של 4 °C. ניתן לשנות את זמני התגובה עבור התגובה הראשונה והשנייה כדי להתאים את ריכוז הסכריד הסופי.עם השלמת התגובה, סבב את המבחנות בצנטריפוגה ב-12,000 ×g למשך חמש דקות. בסביבה קרה, חזור לתחנת הרובוטיקה. חבר מחדש את מחזיק המבחנות לזרוע הרובוטית, ומלא את המזרק השני בפלטפורמה הרובוטית.בשימוש במים קרים, המזרק הראשון צריך להישאר ריק. הפעילו את הרובוט. הנוזל העליון (supernatant) בכל מבחנה נשאב אל המזרק הריק, והמשאבה השנייה מזרימה מים קרים אל המבחנות.שלב זה מבוצע כדי להסיר ריאגנטים שאינם פעילים מת сусפנסיות הננו-חלקיקים. לאחר מכן, הומוגניז את סספנסיות הננו-חלקיקים באמצעות סוניקציה כפי שהודגם בעבר. לאחר מכן, סבב את המבחנות בצנטריפוגה ב-12,000 ×g למשך חמש דקות.בצעו שטיפה שנייה במים קרים באמצעות המכשור הרובוטי עבור העמסה השנייה של התגובה; העבירו למשאבה הראשונה 12 מקובילינטים של EDC לכל דגימת ננוחלקיק, ולמשאבה השנייה 12 מקובילינטים של NHS לכל דגימת ננוחלקיק. הפעילו את הפלטפורמה הרובוטית כדי לחלק נפחים מתאימים לתוך המבחנות המכילות את הננוחלקיקים. נוכחותם של EDC ו-NHS תאפשר יצירה של קשר אמייד בין קבוצות האמין של ה-ethylene dite שכבר קשור לפני השטח של הננוחלקיק לבין קבוצת חומצה קרבוקסילית של הסוכר המוגן עמוק.עם השלמת השקיעה, טענו 10 שווים של סכריד ספציפי. במקרה זה, נעשה שימוש בלקטוז ובבקרה של חומצה גליקולית בשתי המשאבות הזמינות. כל סכריד משוקע במבחנות מסויימות בהתאם לפונקציונליזציה הרצויה בכל מבחנה, אשר תוכנתה מראש בתוכנת lab view המשמשת להפעלת המפעילים ופונקציות המשאבה עבור התגובה הספציפית שנעשה בה שימוש. במחקר זה, להצמדת פחמימות, נעשה שימוש בחומצה גליקולית כבקרת מקשר (linker), מכיוון שלסכרידים מוגנים עמוק יש כבר מולקולה זו מקושרת קוולנטית, מה שמאפשר הצמדה נוספת לפני השטח של הננו-חלקיק.מתלים של ננו-חלקיקים עוברים הומוגניזציה באמצעות סוניקציה כפי שבוצע קודם לכן, ולאחר מכן מדגירים אותם למשך תשע שעות תחת סיבוב קבוע בטמפרטורה של 4 °C. לאחר ההדגרה, שוטפים את מתלי הננו-חלקיקים על ידי צנטריפוגציה והסרת הנוזל העליון, ולאחר מכן own-סוסיפנדינג של המשקע במים קרים וסוניקציה. מניחים את המבחנות, המכילות כעת את ספריית הננו-חלקיקים הפונקציונליים, בתא ואקום לייבוש למשך שעתיים לפחות. ננו-חלקיקים פונקציונליים מאופיינים באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) ושיטות נוספות להערכת הרכב הפני सतह, ריכוז, גודל החלקיקים, התפלגות הגודל ומטען השטח.הצד הדיאנו המוגן במלואו המוצג כאן סונתז באמצעות פלטפורמת האוטומציה. התרכובת שסונתזה אופיינה באמצעות NMR של פרוטונים בספקטרומטר VXR 400 megahertz. באמצעות שימוש ב-CDC 13 כממס, ניתן לאשר את היווצרות המוצר על סמך נוכחותם של מספר שיאים אופייניים.בדיאגרמת ה-proton NMR, ארבעת הפרוטונים בטווח שבין 1.79 ל-2.21 ושני פרוטונים ב-3.38 מקורם בתווית הפלוריסט (florist tag). שיאו של הסינגלט ב-2.16 תואם לשיא האצטט, והשיאים ב-4.94 ו-5.11 הם הפרוטונים האנומריים כדי להעריך את השפעת זמן התגובה על המורפולוגיה הסופית של הננו-חלקיקים ואת מידת היצמדות הסוכר שהושגה. הננו-חלקיקים עברו פונקציונליזציה עם זמני תגובה עולים כפי שמוצג כאן; ריכוז ה-diano על פני שטח של ננו-חלקיקי 50 50 CPT CPH עלה עם זמן התגובה הכולל והגיע למקסימום לאחר 18 שעות.ננו-חלקיקים שפונקציונלו עם זמן תגובה כולל של 24 שעות שימשו לאחר מכן להערכת יכולתם להתמקד ב-CLRs על תאי דנדריטיים המופקים ממחול השגרה של עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה, כפי שמוצג כאן. נצפתה ביטוי מוגבר של DC sign ושל קולטן mano עבור קולטני לקטין מסוג C לאחר גירוי עם ננו-חלקיקים שאינם פונקציונליים, וכן עם ננו-חלקיקים שפונקציונלו עם לקטוז ודאנו. דבר זה מעיד על התמקדמות יעילה.עם זאת, חלקיקים פונקציונליים מסוג Diano הראו רמה גבוהה יותר של ביטוי, המעידה על ספציפיות של ליגנד זה לרצפטורים שנבחנו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע הסינתזה האוטומטית של אוליגוסכרידים בספיקות גבוהה, כמו גם פונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פולימרים. תוך שימוש בפסידי פחמימות אלו כסוכני תיחום, לאחר שליטה בסינתזה של הסוכר המוגן (donor acceptor), ניתן לבצע את הרכבת המכשיר בתוך 24 עד 48 שעות.כמובן, משך הזמן תלוי בגודל הספריה וכן בזמן הפונקציונליזציה. בעת ביצוע שיטה זו, חשוב לזכור שניתן למטב את תנאי התגובה של הפונקציונליזציה של חלקיקי פולי-הידרו ביו-מתכלה בהתאם לכימיה של הננו-חלקיקים. על ידי ביצוע הליך זה, ניתן לסנתז מבנים שונים של פחמימות במטרה להכווין לקולטנים תאיים שונים כדי להשפיע על התוצאה האימונולוגית.

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה זו מתארת ​​את הסינתזה קומבינטורית של סרט polyanhydride מתכלה וספריות nanoparticle וזיהוי התפוקה גבוהה של שחרור חלבון מהספריות הללו.

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

גישה יעילה להכנת nanofibers מעוטר בקבוצות המסוגלים אינטראקציה ספציפית עם חלבונים תפקודיות מתוארת. הגישה דורשת 1 הכנת פולימרים פונקציונליים עם הקבוצה הפונקציונלית המתאימה. הפולימרים הפונקציונליים הם מפוברקים לnanofibers ידי electrospinning. היעילות של הכריכה של nanofibers עם חלבון ונלמדת על ידי מיקרוסקופיה confocal.

הליך לבודת Nanofibers Biofunctional

בסרטון זה ידגים שיטה מהירה, יעילה לmethacrylate פולי (אתילן גליקול), המאפשר polymerizations שרשרת וסינתזת הידרוג'ל. זה ידגים כיצד להציג את פונקציות methacrylamide דומות לפפטידים, שיטות אנליטיות נפוצות פרטים כדי להעריך את יעילות functionalization, לספק הצעות לפתרון בעיות ושינויים מתקדמים, ולהדגים טכניקות אפיון הידרוג'ל טיפוסיות.

Functionalization בסיוע מיקרוגל של פולי (אתילן גליקול) ופפטידים על השרף לשימוש בPolymerizations שרשרת וגיבוש Hydrogel

מודגמת סינתזה יעילה בת שלושה שלבים של גליקופולימרים פלואורסצנטיים מבוססי RAFT, המורכבת מהכנת גליקומונומר, קופולימריזציה ופוסט-שינוי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להכנת גליקופולימרים סטטיסטיים מבוססי RAFT עם מבנים רצויים.

הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

אנו מדווחים על פרוטוקולים ל"פילמור" סוגים שונים של ננו-חלקיקי מתכת עטופים בפולימר לשרשראות ארוכות של "הומו-" ו"קו-פולימרים".

באמצעות Polystyrene-<em&gt; בלוק</em&gt; -poly (חומצה אקרילית) -coated מתכת חלקיקים כמו מונומרים להומו- ושיתוף פילמור

אנו מציגים שיטה מודולרית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של אקסופוליסכרידים מיקרוביאליים בקנה מידה קטן. שיטה זו משלבת בחירה מוקדמת מהירה לניתוח הכמות הכוללת של פוליסכרידים המופרשים עם טביעת אצבע מפורטת של פחמימות כדי לאפשר סינון מהיר של זני חיידקים שבודדו לאחרונה או אוספי זנים שלמים.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

פורטו תוכניות סינתזה להכנת ננו-חלקיקים שעירים מבוססי סיבי עץ יציבים ביותר וביופולימרים פונקציונליים מבוססי תאית.

מאוד יציבים, חלקיקים שעירים פונקציונליים Biopolymers סיבי עץ: לקראת ננוטכנולוגיה קיימא

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של הידרוג'לים מתפקדים RGD כמכשירים להעברת תאים ותרופות. ההליך כולל תוספת ציקלו-אזיד אלקין-אזיד מזורזת נחושת (CuAAC) בין חומצה פוליאקרילית ששונה באלקין (PAA) ונגזרת RGD-אזיד. ההידרוג'לים נוצרים באמצעות עיבוי בסיוע מיקרוגל ונחקרים תכונותיהם הפיזיקוכימיות.

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בתוכנת Auto-CHO לסינתזה הירארכית וניתנת לתיכנות של oligosaccharides. כמו כן, הוא מתאר את הנוהל הכללי לניסויים בקביעת RRV וגליקוציה של סיר אחד של SSEA-4.

הירארכי וניתן לתיכנות Oligosaccharide סינתזה של סיר אחד

חלבונים וליגנדים המכילים אמין יכולים להיות מקושרים באופן קוולנטי לפוליסכרידים המופעלים על ידי ריאגנט ציאנילציה, 1-ציאנו-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט (CDAP), ליצירת הצמדת חלבון קוולנטי (ליגנד)-פוליסכריד. מאמר זה מתאר פרוטוקול משופר לביצוע הפעלת CDAP מבוקרת ב- 0 °C ו- pH משתנה וביצוע ההטיות הבאות של הפוליסכרידים הפעילים.

הפעלה והטיאה של פוליסכרידים מסיסים באמצעות 1-Cyano-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט (CDAP)

למד סינתזה אוטומטית של אוליגוסכרידים ופונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פוליאנהידריד. שיטה זו מאפשרת מיקוד לקולטנים על תאי מציגי אנטיגן במחקרי נוירומדעים ותרופות.

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

גלה סרטונים נוספים