תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

במאמר וידאו זה, אנו מתארים פרוטוקול הידרו פוט חדשני לסינתזה אוטומטית של שלב התמיסה של אוליגוסכרידים ופונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פולי אנהי. עם חומרי מיקוד מבוססי פחמימות אלה, מולקולות הפחמימות הראשונות מסונתזות באמצעות מערכת אוטומטית המשתמשת בסינתיסייזר שלב תמיסה במקום בסינתיסייזרים של פאזה מוצקה. לאחר מכן, חומרי הביניים של האוליגוסכריד מטוהרים על ידי חנות פרחים, מיצוי פאזה מוצקה או FSPE.

מולקולות הפחמימות המיוצרות מאופיינות בתמ"ג ואז הן מחוברות לננו-חלקיקי הפולי אנהידריד על ידי צימוד קרבו IDE. לבסוף, ננו-חלקיקים פונקציונליים של פחמימות מאופיינים בספקטרוסקופיה אלקטרונית של צילום רנטגן ובדיקת חומצה גופרתית פניל הידרו פוט. בסופו של דבר, תוך שימוש במתודולוגיית ההידרו פוט המתוארת כאן, הושגו תנאי התגובה לאופטימיזציה של מורפולוגיה של ננו-חלקיקים וצפיפות פחמימות על פני החלקיקים.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני הקיימות כמו סינתזת אוליגוסכריד פנים מוצקות, הוא שבשיטה זו אנו משתמשים בכמות נמוכה משמעותית של אבני בניין בשיטה זו, בדרך כלל אנו משתמשים בשניים עד שלושה שווי ערך במקום 10 עד 20 שווי ערך. הרעיון לשיטה זו עולה לראשונה כאשר אנו מדגימים את היעילות של השפעות פני השטח, פונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פולי הידרו, שימוש בפחמימות כדי למקד קולטני ceep על תאים נוגדי שיקע. לאחר מכן רצינו לתכנן מערכת תפוקה גבוהה שתאפשר לנו לסנן את הפרמטרים המרובים המעורבים בייצור וביישום של הספקים החדשים הללו.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שפיתוח פלטפורמות אוטומטיות לסינתזה בתפוקה גבוהה של אוליגוסכרידים והצמדתם לחלקיקי פולימר הוא תחום חקירה חדש ללא תיעוד רב זמין לפני הסינתזה האוטומטית של חומצת דיאנו. תורם סוכר מוגן כראוי, בדרך כלל טרי כלורו אצטמיד מקבל בעיקר באלקון, אלכוהול פלואורוס מסונתז על הספסל ומוכן בכלורו מתאן מכין גם טרימתיל סילו, טרי פלואורו מתאן סולפונאט בכלורו מתאן, 80% מתנול ו-100% מתנול. ודא שהלחות היחסית בחדר היא 30% ומטה בתא האוטומציה.

לחות גבוהה מזיקה לתגובות גליקוזילציה. השלבים הבאים נעשים באמצעות פלטפורמת אוטומציה. הגליקוזילציה הראשונה מתבצעת עם התורם ואלכוהול הפרחים.

לאחר שתסיים, מולקולת הסוכר של תג הפרחים המתקבלת מטוהרת על ידי FSPE. לאחר מכן מסירים את קבוצת ההגנה הזמנית על ידי נתרן, תחמוצת מת' ומתנול, ושוב, המוצר מטוהר על ידי FSPE. לאחר מכן, סוכר תג הפרחים משמש כמקבל ומחובר לאותו תורם כדי לקבל את הדו-סוכר, הדו-סוכר מטוהר על ידי FSPE כדי להתחיל.

הנח ריאגנטים, כולל מקדם מקבל התורם, 80% מי מתנול, 100% מתנול, תחמוצת נתרן מת' בפלטפורמה הרובוטית, והתחל את התוכנית. הזרוע הרובוטית תוציא את התורם ולאחר מכן את המקבל מהבקבוקונים ותעביר אותם לבקבוקון תגובה. לאחר מכן מערבבים את תערובת התורם והמקבל למשך 30 דקות.

לאחר שחלפו 30 דקות. הזרוע הרובוטית מעבירה לתערובת ממגורת טרימתיל קטליטית, טרי פלואורו, מתאן סולפונאט. לאחר מכן מערבבים את התמיסה למשך 30 דקות נוספות לאחר סיום הערבוב, התוכנית מושהית.

הסר כמות של 10 מיקרוליטר כדי לבדוק אם התגובה הושלמה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה. אם התגובה הושלמה, המולקולה המקבלת לא תיראה. אם התגובה לא הושלמה, המקבל ב-TLC עדיין גלוי.

אם זה המקרה, עצור את התוכנית, אפס את התזמון לגליקוזילציה בסביבות 30 דקות, והוסף עודף של המקדם טרימתיל סילו, טרי פלואורו, מתאן סולפונט. לאחר השלמת התגובה, המשך לשלב הבא. לאחר השלמת התגובה, הרובוט מעביר את תערובת התגובה למחסניות FSPE המכילות ג'ל סיליקה שונה C nine F 17 לטיהור.

לאחר מכן, המחסניות נשטפות בשמונה מיליליטר של 80% מתנול, ואחריהם שמונה מיליליטר של 100% מתנול. כדי לחסל את החלק שאינו פלוריס, הזרימה נאספת בבקבוקון כדי להשיג את המוצר הרצוי המתויג בחנות פרחים. אם נדרש טיהור נוסף, השהה את הרובוט והסר את תוצרי התגובה המתאימים.

בהתאם למבנה, התורמים יכולים להיות מאוד לא מגיבים וחלק מהמולקולה המקבלת של חנות הפרחים תישאר גם לאחר הוספת מקדם מספיק. אם זה המקרה, FSPE לא יהיה יעיל מספיק לטיהור וטיהור נוסף באמצעות כרומטוגרפיה של עמודת סיליקה ג'ל עשוי להתבצע לאחר הטיהור הזרוע הרובוטית מפזרת תחמוצת נתרן מת' לתוך בקבוקון התגובה. לאחר מכן מערבבים את התגובה במשך שעתיים בפלטפורמה הרובוטית, אם לא שלמה כפי שנקבע על ידי TLC, מאריכים את תקופת הדגירה בכשעה.

לאחר השלמת התגובה, המוצר מטוהר על ידי FSPE כמו קודם. לאחר מכן, הסר את תוצר התגובה מהרובוט ועל הספסל הנתון לפירוק בטולואן נטול מים, ולאחר מכן אידוי להסרת שאריות מים. לאחר שהדגימה יבשה, החזר אותה לרובוט באותו מחזור כולל טיהור גליקוזילציה על ידי FSPE.

הגנה עמוקה על קבוצת ההגנה הזמנית ואחריה גליקוזילציה חוזרת על עצמה עד לקבלת אורך השרשרת הרצוי עבור מולקולת המטרה כדי להגן על המוצר המוגן המתקבל מאוטומציה, להסיר את הבקבוקון מהרובוט. השלבים האחרונים של ההליך משתמשים בגז מימן נפיץ ויש לבצע אותם מחוץ לפלטפורמת האוטומציה. על הספסל עוז, מתרחשת ליזה של הקשר הכפול בתג חנות הפרחים ואחריה חמצון של האלדהיד המיוצר לחומצה קרבוקסילית.

טהר את המוצר המתקבל על ידי כרומטוגרפיה של עמוד סיליקה ג'ל על ספסל באמצעות תערובת של 30% מתנול בדי כלורו מתאן. לבסוף, כדי להגן על קבוצות אתר הבנזו על ידי הידרוגנציה מזרזת פלדיום, העבירו את המוצר דרך משטח לוויין כדי להיפטר מפלדיום, כדי לקבל מוצר סופי טהור. אפיין את המוצר במלואו באמצעות תהודה מגנטית גרעינית או ספקטרוסקופיה NMR.

סינתזת פולימרים בזריקה גבוהה וייצור ננו-חלקיקים מתבצעים בהתאם לפרוטוקול שתואר על ידי פיטרסון ואחרים. כפי שמצוין במסמך הנלווה, מנגנון התצהיר האוטומטי המשמש לפונקציית חלקיקים מורכב משלוש משאבות ne 1000, שלב רובוטי משולב על ידי שני מפעילים, האחד לתנועה בכיוון X והשני לתנועה בכיוון Y ושלב רובוטי שני עם שני מתלים סמוכים המורכבים משלושה מפעילים, אחד לכל כיוון המשאבות ובסך הכל חמישה מפעילים מחוברים. בסדרה מפעילים ומשאבות מופעלים על ידי מחשב באמצעות תוכנת תצוגת מעבדה.

מערכות הקופולימר המשמשות לייצור חלקיקים מבוססות על חומצת SEBA או SA ואחד שש ביס, קרבוקסי פראי, אוקסיל היין או CPH ואחד שמונה BIS para carboxy פנוקסי שלוש שש דיאוקסאן או CP Teeg. לאחר מקום ייצור ננו-חלקיקים, מתלה המכיל את צינורות הצנטריפוגה של 1.7 מיליליטר עם ספריית ננו-חלקיקים לשלב המפעיל הליניארי להצמדת פחמימות לפני השטח של חלקיקי פולי אנהי ותגובת צימוד חומצה קרבוקסילית ממוצעת המורכבת משתי תגובות רצופות מבוצעת לתגובה הראשונה. מלאו מזרק במשאבת מזרק הניתנת לתכנות בתמיסה מימית של EDC ואתילן דיאמין בריכוז של שני מיליגרם למיליגרם ננו-חלקיקים ו-0.6 מיליגרם למיליגרם ננו-חלקיקים בהתאמה.

מלאו מזרק שני במשאבת מזרק הניתנת לתכנות ב-2.5 מיליגרם למיליגרם חלקיקים של NHSA בסך הכל 12 שווי ערך לדגימת ננו-חלקיקים, תמיסה מימית. לאחר מכן, באמצעות תוכנית תצוגת המעבדה, הורה לרובוט להפקיד תרחיפי ריאגנטים בספריית הננו-חלקיקים. לאחר מכן, המפעילים הרובוטים יעבירו את מחזיק הצינור למיקום הנכון בפלטפורמה לחלוקת פתרונות, EDC ו-NHS.

הפעל את קבוצות החומצה הקרבוקסילית על פני השטח של ננו-חלקיקי פולי אנהידריד ואפשר צימוד ממוצע. לאחר מכן, טבלו בדיקה סוניקציה בכל צינור ובצעו סוניקציה של כל דגימה למשך 30 שניות ב-40 הרץ. לפני המעבר לדגימה הבאה, נקה את הגשושית עם אצטון.

לאחר שכל הדגימות רוויות, מחזיק הצינור מנותק מהפלטפורמה הרובוטית. דגרו על מתלי הננו-חלקיקים למשך תשע שעות עם סיבוב קבוע בארבע מעלות צלזיוס. ניתן לשנות את זמני התגובה לתגובה הראשונה והשנייה כדי להתאים את ריכוז הסכריד הסופי.

לאחר השלמת התגובה, צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 פעמים G למשך חמש דקות. בסביבה קרה, חזור לתחנה הרובוטית. חבר מחדש את מחזיק הצינור לזרוע הרובוטית, ומלא את המזרק השני בפלטפורמה הרובוטית.

עם מים קרים, המזרק הראשון צריך להישאר ריק. הפעל את הרובוט. הסופרנטנט בכל צינור נשאב לתוך המזרק הריק והמשאבה השנייה מפקידה מים קרים לתוך הצינורות.

שלב זה מבוצע כדי להסיר ריאגנטים לא מגיבים ממתלי הננו-חלקיקים. לאחר מכן, הומוגניזציה של תרחיף הננו-חלקיקים על ידי סוניקציה כפי שהודגם קודם לכן. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 פעמים G למשך חמש דקות.

בצע שטיפה שנייה במים קרים תוך שימוש במנגנון הרובוטי לעומס התגובה השני 12 שווי ערך לדגימת ננו-חלקיקים של EDC למשאבה הראשונה ו-12 שווי ערך לדגימת ננו-חלקיקים של NHS למשאבה השנייה. הפעל את הפלטפורמה הרובוטית כדי להוציא נפחים נאותים לתוך הצינורות המכילים ננו-חלקיקים. נוכחותם של EDC ו-NHS תאפשר יצירת קשר אמיד בין קבוצות האמין מדיט האתילן שכבר מחובר למשטח הננו-חלקיקים לבין קבוצת החומצה הקרבוקסילית של הסוכר המוגן עמוק.

לאחר השלמת התצהיר, טען 10 מקבילות של סכריד ספציפי. במקרה זה, נעשה שימוש בלקטוז ובבקרת החומצה הגליקולית בשתי המשאבות הזמינות. כל סכריד מופקד במבחנות בהתאם לפונקציונליזציה הרצויה להשגה בכל שפופרת, שתוכנתה בעבר בתוכנית תצוגת המעבדה, המשמשת להפעלת המפעילים ופונקציות המשאבה לתגובה הספציפית המופעלת במחקר זה להצמדת פחמימות, חומצה גליקולית משמשת כבקרת קישור מכיוון שלסכרידים מוגנים עמוקים כבר יש מולקולה זו מקושרת קוולנטית, מה שמאפשר חיבור נוסף למשטח הננו-חלקיקים.

מתלי ננו-חלקיקים הומוגניים על ידי סוניקציה כמו קודם ולאחר מכן מודגרים במשך תשע שעות עם סיבוב קבוע בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את תרחיפי הננו-חלקיקים על ידי צנטריפוגה ולהוציא את הסופרנטנט, ואז Resus תולה את הגלולה במים קרים ומניחים את הצינורות, המכילים כעת את ספריית הננו-חלקיקים הפונקציונלית בתא ואקום לייבוש למשך שעתיים לפחות. ננו-חלקיקים פונקציונליים מאופיינים בפיזור אור דינמי ובשיטות אחרות להערכת הרכב פני השטח, ריכוז, גודל חלקיקים, התפלגות גודל ומטען פני השטח.

צד הדיאנו המוגן במלואו המוצג כאן סונתז באמצעות פלטפורמת האוטומציה. התרכובת המסונתזת אופיינה על ידי תמ"ג פרוטון בספקטרומטר VXR 400 מגה-הרץ. באמצעות CDC 13 כממס, ניתן לאשר את היווצרות המוצר מנוכחותם של כמה פסגות אופייניות.

בדיאגרמת התמ"ג של הפרוטונים, ארבעת הפרוטונים מ-1.79 עד 2.21 ושני הפרוטונים ב-3.38 הם מתג חנות הפרחים. שיא הסינגלט ב-2.16 תואם את שיא האצטט ב-4.94 ו-5.11 הם הפרוטונים האנומריים כדי להעריך את השפעת זמן התגובה על המורפולוגיה הסופית של הננו-חלקיקים ומידת החיבור לסוכר שהושגה. הננו-חלקיקים תפקדו עם הגדלת זמני התגובה כפי שמוצג כאן, ריכוז הדיאנו על פני השטח של ננו-חלקיקי CPH של 50 50 CPT CPH גדל עם זמן התגובה הכולל והגיע למקסימום לאחר 18 שעות.

לאחר מכן נעשה שימוש בננו-חלקיקים מתפקדים עם זמן תגובה כולל של 24 שעות כדי להעריך את יכולתם למקד CLRs על תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם של עכבר באמצעות ציטומטריית זרימה כפי שמוצג כאן. ביטוי מוגבר של סימן DC וקולטן המאנו לקולטני לקטין מסוג C נצפו לאחר גירוי עם ננו-חלקיקים לא פונקציונליים כמו גם לקטוז ודאנו. זה מצביע על מיקוד יעיל.

עם זאת, חלקיקים מתפקדים של דיאנו הראו רמת ביטוי גבוהה יותר המצביעה על ספציפיות של ליגנד זה עבור הקולטנים שנחקרו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הסינתזה האוטומטית בתפוקה גבוהה של אוליגוסכרידים כמו גם את הפונקציונליזציה של ננו-חלקיקי פולי. שימוש בבסיס הפחמימות הללו בחומרים ממוקדים, לאחר שליטה בסינתזה של הסוכר המוגן על ידי מקבל התורם, כמו גם הרכבת המנגנון יכולה להיעשות תוך 24 עד 48 שעות.

כמובן שאורך הזמן תלוי בגודל הספרייה כמו גם בזמן הפונקציונליזציה. בעת השתתפות בשיטה זו, חשוב לזכור כי ניתן לייעל את תנאי התגובה של הפונקציונליזציה של חלקיקי פולי הידרו מתכלים בהתאם לכימיה של ננו-חלקיקים. על ידי ביצוע הליך זה, ניתן לסנתז מבנים שונים של פחמימות על מנת למקד לקולטני תאים שונים כדי להשפיע על התוצאה החיסונית.