מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לערבב במהירות שני תמיסות כדי להתחיל תגובה ביוכימית בלוח זמנים של מיקרו-שניות. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור של מערבל מיקרופלואידי. השלב השני הוא הדבקת השבב לזכוכית כיסוי כדי לאטום את התעלות.

בשלב הבא, השבב מורכב למניפולטור (manifold) המכיל את מאגרי התמיסות. השלב הסופי הוא דימוי של התמיסה המעורבבת באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית. בסופו של דבר, התגובה הביוכימית נקלטת בפרק זמן של מיקרו-שניות על ידי המרת המרחק לאורך תעלת היציאה לזמן.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון stop flow mixing, הוא שהערבוב אינו מוגבל על ידי טורבולנציה והוא מתרחש בתוך מיקרו-שניות בודדות. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום קיפול חלבונים, כגון מתי מתרחש קריסה הידרופובית? את הפרוצדורה תדגים ling woo, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי, כדי להתחיל בייצור של שבבי ערבוב מיקרופלואידיים.

ראשית, נקו פרוסות סיליקה FU של ארבעה אינץ' באמצעות תמיסת פיראנה טרייה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. לאחר מכן, השתמשו בתנור למשקיב כימי באדים בלחץ נמוך (low pressure chemical vapor deposition) כדי להחיל ציפוי פוליסיליקון בעובי של כמיקרון אחד עבור כל עומק של 10 מיקרון המתוכנן לתעלות המיקרופלואידיות הסופיות. לאחר טיפול נוסף בפרוסות כפי שמתואר בטקסט, בצעו ציפוי ספין (spin coat) לפרוסות בשכבה בעובי 900 ננומטר של פוטורזיסט Z 52 14, ולאחר מכן בצעו אפייה רכה (soft bake) בטמפרטורה של 90 °C ישירות על פלטה חמה למשך דקה אחת, או בתנור בטמפרטורה של 110 °C למשך 30 דקות.

לאחר יישור מסיכת הצילום, צור מגע קשיח בואקום על ידי חשיפת הפוטורזיסט לאור UV למשך מספר שניות. לאחר מכן, פתח את התבנית בפוטורזיסט כפי שמרשם בפרוטוקול הכתוב. בדוק את המבנים על גבי הפרוסה באמצעות מיקרוסקופ ובצע אפייה קשיחה בטמפרטורה של 115 °C ישירות על פלטה חמה למשך שתי דקות.

בשלב הבא, בצעו ניקוי של משטחי הסיליקון (DCU) באמצעות Asher או פלזמה של חמצן למשך 2.5 דקות בהספק RF של 100 watts. בעזרת תכנור יונים עמוק (deep reactive ion etcher), תעשו תעלה (etch) בשכבת הפולי-סיליקה עד להגעה לסיליקה המותכת (fused silica) שמתחתיה. הסירו את שאריות הפוטו-רזיסט ועבדו את פרוסת הסיליקון כפי שהודרך בטקסט.

מדדו את עומק התעלה כדי לוודא שהיא חודרת באופן מלא דרך ציפוי הפולימר. באמצעות מכשיר תסריג יונים עמוק (deep reactive ion etcher) המסוגל לתסריג תחמוצות, תסריגו סיליקה מותכת (fused silica) לעומק של כ-10 מיקרון עבור כל מיקרון עובי של ציפוי הפולימר. נקו את הפרוסה באמצעות matrix Asher למשך ארבע דקות, בהספק RF של 100 watts, והסירו את הפוליסיליקון באמצעות תסריג xenon di fluoride. לפני קידוח חורים בפרוסה, בצעו ציפוי סבב (spin coat) של שכבת פוטורזיסט חדשה בעובי מיקרון אחד כדי להגן על התעלות במהלך הטיפול הבא.

לאחר מכן, הצמידו את הפרוסה כאשר צד התכונות פונה כלפי מטה על גבי פלטת זכוכית הקרבה באמצעות Aqua Bond 55. תוך הקפדה על מניעת בועות בחומר ההדבקה, השתמשו במקדח בעל קצה יהלום הנשלט במחשב עם תמיסת ניקוי micro 90. פעולה זו מונעת מרסיסי זכוכית קטנים להידבק לתעלות, דבר שעלול לגרום לסתימה של השבב במהלך השימוש.

המשיכו לקדיחה של חורי כניסה ויציאה בכל שבב. שטפו את הפרוסה במים דה-יוניים באמצעות מזרק להזרקת מים לתוך כל חור. לאחר מכן, השרו במים עם סבון למשך שעה לאחר הסרת הפוטו-רזיסט.

יש להנחיל רזיסט וחומר הדבקה (bonder) כפי שמתואר בטקסט. שטפו את הפרוסה במים דאיוניים ובמים חמימים עם סבון. שטפו שוב כל חור באמצעות מזרק, תוך הימנעות ממגע עם התכונות שנחרטו, לאחר הזרמת חנקן על הפרוסה.

המשיכו לייבש בתנור ואקום המכוון ל-120 °C. בדקו את החורים כדי לוודא שהם נקיים משאריות חלקיקים וחזרו על שלבי הניקוי במידת הצורך. את השלבים הבאים יש לבצע בחדר נקי.

מדוד את עומק התעלות באמצעות פרופילומטר (surface profiler) אופטי או מכני. נקה את הפרוסה (wafer) וכן זכוכית כיסוי מסיליקה מותכת (fuse silica) כפי שמתואר בטקסט בחדר נקי. ייבש את הפרוסה ביסודיות באמצעות גז חנקן למשך חמש דקות לפחות.

לאחר מכן, הניחו את הפרוסה כאשר הצד עם התכונות פונה כלפי מעלה על גבי ערימה של שלושה עד ארבעה מגיבויים של חדר נקי, המוצבים על משטח קשיח ושטוח כגון לוח זכוכית קטן. חזרו על הפעולה עם זכוכית הכיסוי. הרימו את זכוכית הכיסוי מקצותיה והפכו אותה כך שהצד המלוטש פונה כלפי מטה מעל הפרוסה.

יישרו את הקצוות השטוחים בזהירות, הניחו את זכוכית הכיסוי על גבי הפרוסה והמתינו להשתקעותה; דחפו בעדינות באופן אופקי רק כדי לדייק את היישור. לחצו באצבע אחת על מרכז הפרוסה. יש לצפות בקו חיבור (bonding front) שמתחיל להתרחב כלפי חוץ.

במידת הצורך, הפעל לחץ נוסף במיקומים אחרים מסביב לפרוסה כדי לקדם את חזית ההדבקה. לאחר הנחת הפרוסות האטומות בתנור בטמפרטורה גבוהה המתוכנת לפי פרופיל הטמפרטורה המפורט בטקסט, חתוך את הפרוסה באמצעות מסור חיתוך פרוסות לשבבים בודדים. ניתן להכין את המניפולטור להחזקת שבב הערבוב והתמיסות מפלסטיק כגון lexan או plexiglass, או מאלומיניום.

לבקרת טמפרטורה, חברו את השבב לסעפת באמצעות טבעות O קטנות וקבעו אותו במקומו בעזרת טבעת אבטחה המאפשרת ראות אופטית ברורה של מרכז השבב. חריצי טבעות ה-O צריכים להיות רדודים יותר מהסטנדרט כדי להבטיח התאמה טובה מבלי להפעיל לחץ רב מדי על השבב. לאחר התקנת השבב, הוסיפו תמיסות למאגרים המרכזיים והצדדיים, תוך הקפדה על שחרור בועות אוויר שנלכדו בתחתית הבארות.

הנח את המניפולד (manifold) על מיקרוסקופ הפוך ובחן את אזור הערבוב באמצעות העינית או פלט המצלמה. פנס עם נורה להט שיוצב מעל המניפולד יספק תאורה מספקת. השתמש בצבע או בתמיסה בעלת מקדם שבירה גבוה בתעלה המרכזית כדי לצפות בסילון.

מכיוון שהנפחים המשמשים במערבל זה קטנים מאוד, ניתן לשלוט בזרימה באמצעות לחץ אוויר המופעל מעל בארי התמיסה. כדי להמחיש את הסילון, התחילו עם לחץ של אפס pounds per square inch בערוץ הצדדי והעלו אותו לאט עד להשגת לחץ השווה לזה של הערוץ המרכזי. אם אחד מערוצי הצד חסום, הסילון יידחף לעבר אחד מקירותיה של תעלת היציאה.

אם מופיעה סתימה נראית לעין, ניתן לשחרר אותה על ידי הפעלת לחץ או ואקום בערוץ היציאה באמצעות מזרק. אם חלבון או חומר אורגני אחר סותמים את השבב, ניתן לנקות אותו על ידי השריה בתמיסת piranha למשך הלילה. הכניסו קרן לייזר מצופה לתוך מיקרוסקופ ברמה מחקרית באמצעות מראה דיכרואית, בתוך המיקרוסקופ או ממש מחוצה לו.

יישרו את הלייזר כך שניתן יהיה לראות את המוקד בעין או במצלמה בקרבה מסוימת לאזור הערבוב. פלואורסצנציה מהחלבון בערבוב נאספת על ידי העדשה והנשלחת דרך המראה הדיכרואית, ממוקדת על ידי עדשה לחור סיכה (pinhole) ומדומיינת על גבי סופר פוטונים. סרקו את השבב באמצעות סורק פיזואלקטרי בצירים x ו-y כדי לדמיין את אזור הערבוב.

בחרו מיקום על הסילון ובצעו סריקה בצירים X ו-Y כדי למצוא את המוקד במרכז התעלה באופן אנכי. עומק השדה של המיקרוסקופ קטן בהרבה מעומק התעלה, וקצב הזרימה בתעלה הוא אחיד למעט בטווח של מיקרון אחד מהדפנות. לכן, הרזולוציה הזמנית של הפלואורסצנציה הנצפית נקבעת בעיקר על ידי גודלו של המוקד הקונפוקאלי.

בצעו סריקה אופקית בתוך תעלת היציאה במרווחים של 100 micron לאורך הסילון, תוך תצפית של כמילישנייה אחת לכל מיקום. הזיזו את בסיס המיקרוסקופ ב-80 עד 90 micron לאורך הסילון כדי ללכוד זמנים מאוחרים יותר. לחלופין, ניתן לגלא את האור באמצעות ספקטרוגרף ו-CCD לאחר המראה הדיכרואית, תוך שימוש בעדשה למיקוד האור על חריץ הכניסה.

מכיוון שאיסוף הנתונים הוא איטי יותר מאשר במונה הפוטונים, בדרך כלל מצלמים תחילה את הסילון באמצעות מונה הפוטונים ולאחר מכן מודדים נקודות לאורך הסילון באמצעות הספקטרוגרף. הנתונים ממונה הפוטונים מנותחים על ידי סיכום של שלושה עד חמישה פיקסלים סביב הסילון בכל מיקום כדי ליצור גרף של עוצמה לעומת מרחק. הזמן מחושב מהמרחק באמצעות מהירות שחושבה על בסיס הלחצים המופעלים.

כשלב סופי, נתחו את הנתונים מהספקטרוגרף באמצעות אחת השיטות המתוארות בטקסט. מוצג כאן תרשים קווי מתאר (contour plot) של העוצמה באזור הערבוב שנמדדה על ידי מונה הפוטונים. הרקע בערוץ היציאה מחוץ לסילון צריך להיות קרוב לרצפת הרעש של הגלאי ובדרך כלל אינו מופחת.

רקע גבוה יותר עשוי להעיד על יישור לקוי או על כך שהחלבון נדבק לדפנות התעלה. לעומת זאת, סילון שנראה מקומט או עקום, במיוחד בקרבת אזור הערבוב, מעיד על תכסיר (etch) לקוי של הדיזות. מוצג ספקטרום ברזולוציית זמן של protein ACell coenzyme a binding protein או A CBP המסומן ב-Alexa 488 ו-Alexa 647.

המלבנים הירוקים והאדומים מראים את אורכי הגל שהוגדרו כערוצי התורם והמקבל, בהתאמה. מנתונים אלו הופחתו הרקעים כדי להסיר את מטען הרעש (dark charge) ואת אות הלייזר. אות הרקע נלקח כאשר הלחץ בערוץ המרכזי היה אפס psi.

ניתן למדוד את זמן הערבוב על ידי מדידת תגובה מהירה שהיא מהירה בהרבה מהערבוב, כגון כיבוי פלואורסצנציה של tryptophan על ידי potassium iodide. כיוון שהסילון קטן מהרזולוציה האופטית של המיקרוסקופ, קיימת ירידה גדולה בעוצמה באזור הערבוב. עם היווצרות הסילון, ניתן להסיר תגובה מכשירית זו על ידי ביצוע מדידת ביקורת שבה שום תנאי תמיסה אינו משתנה.

איור זה מציג את היחס בין ניסויי ערבוב לניסויי אי-ערבוב של פלואורסצנציה של N-Acetyl tryptophan amide. הקו מציג את הריכוז החזוי של potassium iodide מדגמי סימולציות ומידול multiphysics של console. זמן הערבוב, כפי שנמדד לפי הזמן הדרוש לירידה של 80% בריכוז, הוא שמונה מיקרו-שניות.

תרשים זה מציג את השינויים ב-fret בחלבון A CBP לאחר דילול של חומר דנטורציה מ-six molar ל-0.06 molar. נתונים אלו אינם דורשים ניסוי ביקורת. מכיוון שה-fret הוא כבר יחס ותגובת המכשיר כבר הוסרה, הקפיצה המהירה בקרבת T שווה לאפס מייצגת שינוי מהיר באות ה-fret בתוך זמן הערבוב.

בעקבות פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום קיפול חלבונים לבחון את השלבים המוקדמים ביותר של היווצרות מבנה החלבון.