Name: מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: למדו כיצד לייצר מערבל מיקרו-פלואידי לערבוב מהיר של תמיסות בקנה מידה של מיקרו-שניות. השיטה משתמשת בזיהוי ספקטרוסקופי ובמיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית לחקר קיפול חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע FIBR (NSF EF-0623664) ו IDBR (NSF DBI-0754570). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון הקרן הלאומית למדע FIBR גרנט 0623664 מנוהל על ידי המרכז Biophotonics, מדע וטכנולוגיה NSF המרכז, המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית PHY 0120999. מחקר של ליסה לפידוס, Ph.D. הוא נתמך בחלקו על ידי פרס קריירה ממשק מדעי מהקרן בורוז ברוך הבא.

<ol><li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li>
<li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li>
<li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+microfluidic+mixer+for+studying+protein+folding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics.</a> Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).</li>
<li>Yao, S., Bakajin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Mixing+Time+and+Mixing+Uniformity+in+Devices+Designed+for+Studies+of+Protein+Folding+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics.</a> Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).</li>
<li>Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Hydrophobic+Collapse+and+Early+Folding+Steps+Observed+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).</li>
<li>Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchannel+solution+mixer+for+studying+microsecond+protein+folding+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions.</a> Review of Scientific Instruments. 76, (2005).</li>
<li>Chan, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous-flow+capillary+mixing+method+to+monitor+reactions+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale.</a> Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).</li>
<li>Pollack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compactness+of+the+denatured+state+of+a+fast-folding+protein+measured+by+submillisecond+small-angle+x-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).</li>
<li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li>
<li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip%3A+Mixing+nanoliters+in+microseconds%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li>
<li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li>
<li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L%5BTitle%5D)+AND+%22Hfsp+Journal%22%5BJournal%5D)">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li>
<li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

ערבוב מהיר הייתה המטרה פיתוח בתחום קיפול חלבונים במשך שנים רבות משום שהיא מוכרת מזה זמן רב כי התהליכים המולקולריים של ביומולקולות להתרחש על סולמות זמן החל picoseconds כדי שניות. קונבנציונאלי עצר זרימה מערבלי יש פעמים המתים של 1-5 MS אשר מוגבלת בעיקר על ידי תסיסה. הסוערים מערבלי זרימה רציפה עם זמני ערבוב של 30-300 μs פותחו במהלך 15 השנים האחרונות על ידי מספר קטן של קבוצות, אך בדרך כלל דורשים ספיקות גבוהות כדי להשיג את הזמנים ערבוב ולכן משתמשים הרבה מדגם 6-8. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של שבבי ערבוב microfluidic להשיג דילול מהיר של משטר זרימה למינרית. יש יתרונות רבים על עבודה במסגרת המשטר הזה, אבל העיקרית היא היכולת לדמות את תהליך ערבוב כל עם דיוק גבוהה, אשר מאפשר לשנות את התגובה ערבוב. T-מערבלי שפותחו על ידי קבוצות אחרות עם geom פשוטהetries הוכיחו פעמים ערבוב של 100-200 μs כי היו מוגבלים בעיקר על ידי גודל של 9-10 ערוצים. לפי קנה המידה את הגודל של הערוצים כדי נייט 10 מיקרומטר הפחית את הזמן כדי ערבוב ~ 10 μs 11. יאו ו Bakajin הראו כי שינויים קטנים בגיאומטריה יכול להוביל לשיפור משמעותי בזמן ערבוב 4. עם זאת, העבודה מראה כי האצת ערבוב יכול גם להוביל בשלבים איטיים יותר גם כן. העיצוב נעשה שימוש בעבודה זו 12-13 היא פשרה בין שני העיצובים הטובים ביותר התייחסות 4 כדי למזער את הדעיכה המעריכית איטי יותר בריכוז denaturant וגם להפוך תכונה לשחזור יותר תחריט DRIE. יש כבר כמה מחלוקות בתחום ultrarapid ערבוב על ההגדרה של זמן ערבוב. חשוב להכיר את ההבדל בין &quot;זמן ערבוב&quot; ו - &quot;זמן מת&quot;. זמן מת מוגדר במיקסר סוערת עם הזמן שבמהלכו מדידותלא לא יכול להיות ויכול למעשה להיות משמעותית יותר זמן ערבוב בפועל. זה נקבע בדרך כלל על ידי ביצוע מדידות שונות של תגובה פסאודו 1 כדי bimolecular (כגון מרווה של טריפטופן הקרינה על ידי N bromosuccinate) בריכוזים שונים. דועך מעריכית הנצפות מצוידים להתכנס לפי שווי אחת מניחה כי t = 0 s ואת הזמן בין נקודה לבין הנקודה נמדד הראשון הוא זמן מת. עבור מערבלי זרימה למינרית, מדידות יכול להתבצע בתהליך ערבוב אז אין זמן מת, רק זמן ערבוב. זמן ערבוב פשוט הזמן לשלב בין שני פתרונות עד אחידות מספיק הוא הגיע. הגדרנו קודם לכן את הזמן ערבוב להיות זמן 90/10, זמן הריכוז של denaturant להפחית בין 90% ל 10% משווי נפרדות. עם זאת, את הצורה של עקומת ערבוב אינו סימטרי לחלוטין עם זנב של ריקבון שיש מרכיב מעריכי קטן. יתר על כן, יש קיפול חלבוניםביותר שאינו ליניארי תלות ריכוז denaturant כך מתקפל שניתן לעיתים קרובות להתחיל גם אם denaturant מצטמצם רק פי 2. לכן הגדרנו ולאחרונה זמן ערבוב עם הזמן להפחית את ריכוז denaturant ב -80%. בהחלט הגדרות אחרות ניתן להשתמש בהתאם לדרישות של הניסוי. שימוש במיקסר זה ללמוד קיפול חלבונים חשף באופן עקבי תוצאות מפתיעות. קיפול של ציטוכרום C ו apomyoglobin כבר מזמן למד להיות צעדים מתקפלים מספר רב של תוצאות מוקדמות עם מערבלי זרימה רציפה הראה קריסה להתרחש ב ~ 100 μs זמנים 10,14-15. המדידות שלנו עם מערבל זה הראה שיהיו לפחות 2 צעדים על לוח זמנים זה, מהר מאוד, סביר להניח שאינו ספציפי, קריסה (כפי שנמדד על ידי שינוי הקרינה trp רפאים) תוך פרק זמן של ערבוב במערבל ואחריו שלב איטי יותר (כמו נמדד על ידי מרווה מכלל פליטת TRP), כי סביר להניח First הקמת מבנה יליד 5. ראינו גם תהליך 50 μs בתחום B1 של L חלבון, הופכת את הפרשנות המקובלת כי חלבון זה הוא תיקיה 2 המדינות 13. היתרון של מיקסר זה מהיר הוא שהוא יכול לחקור את קיפול של חלבונים מתקפלים המהיר ביותר אשר בדרך כלל היו רק measureable על ידי T-קפיצה מכשירים שבריר שנייה. T-קפיצה בדרך כלל דורש התבוננות קיפול / התגלגלות רגיעה ליד טמפרטורת ההתכה של חלבון ולכן לא עוקב המתקפל של האוכלוסייה. עם מערבל זו אנו בחנו מתקפל של γ-repressor (λ 6-86) עם פליטת הן בסך הכל TRP ו SHIFT רפאים מצאו עדויות כי חלבון אין מחסום קיפול בתנאים מתקפלים חזקים שלא היו נגישים T הקודמות הקפיצה מדידות 12. סוף סוף יש לנו למדוד את המתקפלים של כיסוי ראש villin HP-35, אחד לאהוא המהיר ביותר שנמדד תיקיות עדיין ומצא כי שיעור מתקפל נמדד לאחר ערבוב ~ 5 פעמים לאט יותר מאשר נמדד על ידי קפיצה-T באותם תנאים 16. הדבר מצביע על כך קינטיקה מתקפלים תלוי את תנאי הפתיחה, הופכת ההנחה העיקרית בתחום.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> AZ P4110 photoresist </td><td> AZ הצג אלקטרוניים חומרים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K Developer </td><td> AZ הצג אלקטרוניים חומרים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בייקר PRS 2000 photoresist חשפנית </td><td> Avantor חומרים ביצועים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond טכנולוגיות </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 מיקרומטר כיסוי רקיק </td><td> חיישן הכנה שירותים </td><td></td><td> O: 100 מ&quot;מ ± 0.5 מ&quot;מ עובי: 0.5 מ&quot;מ ± 0.025 מ&quot;מ טולרנסים רגילים (אלא אם כן צוין אחרת) לסיים את פני השטח: SI: 4-8A, ת&quot;י: 8-12A דירות: ראשית אחת STD למחצה, אחת הסופר נקי ומצוחצח, שני הצדדים </td></tr><tr><td> 170 מיקרומטר כיסוי רקיק </td><td> חיישן הכנה שירותים </td><td> 7980 2 G ופלים </td><td> O: 100 מ&quot;מ ± 0.5 מ&quot;מ עובי: 0.17 מ&quot;מ ± 0.025 מ&quot;מ טולרנסים רגילים (אלא אם כן צוין אחרת) לסיים את פני השטח: SI: 4-8A, ת&quot;י: 8-12A דירות: ראשית אחת STD למחצה, אחת הסופר נקי ומצוחצח, שני הצדדים </td></tr><tr><td> חרט עמוק יון תגובתי עבור תחמוצות </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> ארגון יון לייזר </td><td> קיימברידג&#39; לייזר מעבדות </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> ארגון יון לייזר </td><td> Melles המכשף </td><td></td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ המטרה </td><td> תור Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ המטרה </td><td> אולימפוס </td><td> UPLSAPO 60XW 1.2 NA </td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> תרגום ממונע הבמה </td><td> Semprex קורפ </td><td> KL-Series 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP פוטון מונה </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> HORIBA מכשירים Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> אנדור טכנולוגיה </td><td> iDus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Guanidine hydrochloride (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><tד&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

תהליך שבו חלבון מתקפל לתוך קונפורמציה המקורית שלו רלוונטי במיוחד ביולוגיה בריאות האדם אך עדיין ממעטים להבין. אחת הסיבות לכך היא מתקפלת מתרחש על פני טווח רחב של לוחות הזמנים, החל ננו שניות עד שניות או יותר, תלוי חלבון 1. קונבנציונאלי עצר זרימה מערבלי אפשרו מדידה של קינטיקה מתקפלים החל על 1 טרשת נפוצה. פיתחנו לאחרונה מערבל microfluidic כי מדלל denaturant ~ 100 של פי ~ 8 μs 2. שלא כמו מערבל הפסיקה זרימת, מערבל זה פועל משטר הזרימה למינרית שבו מערבולות אינה מתרחשת. העדר מערבולת מאפשר סימולציה נומרית מדויקת של כל תזרימי בתוך מיקסר עם הסכם מצוין להתנסות 3-4. זרימה למינרית מושגת על מספרי ריינולדס מחדש ≤ 100. עבור תמיסות מימיות, זה דורש מידה הגיאומטריות מיקרון. אנו משתמשים מצע קשה, כמו סיליקון או sili התמזגוCA, כדי להפוך את ערוצי 5-10 מיקרומטר רחב ו 10 מיקרומטר עמוק (ראה תרשים 1). הממדים הקטנים ביותר, בכניסה לאזור ערבוב, הם בסדר גודל של 1 מיקרומטר בגודל. השבב הוא חתום עם זכוכית דקה או coverslip סיליקה מותכת עבור גישה אופטית. טיפוסי סך הכל תזרים ליניארי הם ~ 1 מ &#39;/ ש, Re מניב ~ 10, אבל את צריכת החלבון הוא רק ~ 0.5 NL / s או 1.8 μL / שעה. ריכוז החלבון תלויה בשיטה זיהוי: עבור טריפטופן הקרינה ריכוז טיפוסי הוא 100 מיקרומטר (לחלבון 1 / TRP) ועל סריג ריכוז טיפוסי הוא ~ 100 ננומטר. תהליך הקיפול הוא שיזם דילול מהיר של denaturant מ ז 6 ל hydrochloride 0.06 guanidine ז. חלבון denaturant גבוה זורם במורד הערוץ המרכזי מתקיים בכל צד על אזור חיץ על ידי ערבוב ללא denaturant נע ~~~HEAD=NNS 100 פעמים מהר יותר (ראה איור 2). גיאומטריה זו גורמת התכווצות מהירה של תזרים החלבון לתוך צרהמטוס ~~~HEAD=NNS 100 ננומטר רחב. דיפוזיה של מולקולות denaturant האור הוא מהיר מאוד, תוך דיפוזיה של מולקולות חלבון כבדות הרבה יותר לאט, מתפשטים והולכים פחות מ 1 מיקרומטר 1 טרשת נפוצה. ההבדל דיפוזיה מתמדת של denaturant והתוצאות חלבון בדילול מהיר של denaturant מהנחל חלבון, הקטנת ריכוז יעיל של denaturant סביב החלבון. מטוס חלבון זורם בקצב קבוע לאורך ערוץ התבוננות הקרינה של חלבון במהלך קיפול ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת 5.

בעבודה זו נסביר את ייצור ושימוש במיקסר microfluidic מסוגל ערבוב שני פתרונות ~~~HEAD=NNS 8 μs. כמו כן, אנו מדגימים את השימוש מערבלי אלה עם זיהוי ספקטרוסקופיות באמצעות הקרינה UV ותהודה הקרינה העברת אנרגיה (סריג).

התהליך שבו חלבון מקפל את עצמו לקונפורמציה הטבעית שלו רלוונטי ביותר לביולוגיה ולבריאות האדם, אך עדיין אינו מובן דיו. סיבה אחת לכך...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לערבב במהירות שני תמיסות כדי להתחיל תגובה ביוכימית בלוח זמנים של מיקרו-שנייה. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור של מיקסר מיקרו-פלואידי. השלב השני הוא הדבקת שבב לזכוכית כיסוי כדי לאטום את התעלות.בשלב הבא, השבב מורכב למניפולטור (manifold) המכיל את מאגרי התמיסה. השלב הסופי הוא הדמיה של התמיסה המעורבבת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית. בסופו של דבר, התגובה הביוכימית נלכדת בלוח זמנים של מיקרו-שניות על ידי המרת המרחק לאורך תעלת היציאה לזמן.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ערבוב בשיטת stop flow, הוא שהערבוב אינו מוגבל על ידי טורבולנציה ומתרחש בתוך מיקרו-שניות בודדות. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום קיפול החלבונים, כגון מתי מתרחש קריסה הידרופובית? את הפרוצדורה תדגים לינג וו, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי, כדי להתחיל בייצור של שבבי ערבוב מיקרופלואידיים.ראשית, נקו פרוסות סיליקה FU של ארבעה אינץ' באמצעות תמיסת פיראנה טרייה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. לאחר מכן, השתמשו בתנור לשיקוע כימי מאדיים בלחץ נמוך כדי להחיל ציפוי פוליסיליקון בעובי של כמיקרון אחד עבור כל 10 מיקרון של עומק התעלות המיקרופלואידיות הסופיות. לאחר טיפול נוסף בפרוסות כפי שמתואר בטקסט, בצעו ציפוי ספין (spin coat) לפרוסות בשכבה בעובי של 900 ננומטר של פוטו-רזיסט Z 52 14, ולאחר מכן בצעו אפייה רכה (soft bake) בטמפרטורה של 90 °C ישירות על פלטה חמה למשך דקה אחת, או בתנור בטמפרטורה של 110 °C למשך 30 דקות.לאחר יישור מסכת הפוטו (photo mask), צרו מגע קשיח בואקום על ידי חשיפה ראשונית של הפוטורזיסט (photo resist) לאור UV למשך מספר שניות. לאחר מכן, פתחו את התבנית בפוטורזיסט כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב. בחנו את המבנים על גבי הפרוסה (wafer) באמצעות מיקרוסקופ ובצעו אפייה קשיחה (hard bake) בטמפרטורה של 115 °C ישירות על פלטה חמה למשך שתי דקות.לאחר מכן, בצעו DCU לפרוסות הסיליקון באמצעות Asher או פלזמה של חמצן למשך 2.5 דקות בהספק RF של 100 watts. באמצעות תכונן חריטה יונית עמוקה (deep reactive ion etcher), חרטו את שכבת הפולי-סיליקה עד להגעה לסיליקה המותכת (fused silica) שמתחתיה. הסירו את שאריות הפוטורזיסט וטפלו בפרוסת הסיליקון כפי שהורה הטקסט.מדדו את עומק התעלה כדי לוודא שהיא חודרת באופן מלא דרך ציפוי הפולימר. באמצעות מכשיר לתסריס יונים עמוק (deep reactive ion etcher) המסוגל לתסריס תחמוצות, בצעו תסריס של סיליקה מותכת (fused silica) לעומק של כ-10 מיקרונים עבור כל מיקרון עובי של ציפוי הפולימר. נקו את הפרוסה באמצעות matrix Asher למשך ארבע דקות, בהספק RF של 100 ווטים, והסירו את הפוליסיליקון באמצעות תסריס xenon di fluoride. לפני קידוח חורים בפרוסה, בצעו ציפוי סבב (spin coat) של שכבת פוטו-רזיסט חדשה בעובי מיקרון אחד כדי להגן על התעלות במהלך הטיפול הבא.לאחר מכן, הצמידו את הפרוסה כאשר צד התכונות פונה כלפי מטה על לוח זכוכית להקרבה באמצעות Aqua Bond 55. תוך הקפדה לשמור על החיבור ללא בועות, קררו מקדח בעל קצה יהלום הנשלט במחשב עם תמיסת ניקוי micro 90. פעולה זו מונעת מרסיסי זכוכית קטנים להידבק לתעלות, מה שעלול לגרום לסתימה של השבב במהלך השימוש.המשיכו לקדוח חורי כניסה ויציאה בכל שבב. שטפו את הפרוסה במים דאיוניים באמצעות מזרק להזרקת מים לתוך כל חור. לאחר מכן, השרו במים עם סבון למשך שעה לאחר הסרת הפוטו-רזיסט.יש להחיל רזיסט וחומר הדבקה (bonder) כפי שמתואר בטקסט. שטפו את הפרוסה במים דה-יוניים ובמים חמימים עם סבון. שטפו שוב כל חור באמצעות מזרק, תוך הימנעות ממגע עם התכונות שנחרטו, לאחר הזרמת חנקן על הפרוסה.המשך לייבש בתנור ואקום המכוון ל-120 °C. בדוק את החורים כדי לוודא שהם נקיים משאריות חול וחזור על שלבי הניקוי במידת הצורך. את השלבים הבאים יש לבצע בחדר נקי.מדדו את עומק התעלות באמצעות פרופילומטר פני שטח אופטי או מכני. נקו את הפרוסה וכן זכוכית כיסוי מסיליקה מותכת (fuse silica) כפי שמתואר בטקסט בחדר נקי. ייבשו את הפרוסה ביסודיות באמצעות גז חנקן למשך חמש דקות לפחות.לאחר מכן, הניחו את הפרוסה כאשר הצד עם התכונות פונה כלפי מעלה על גבי ערימה של שלושה עד ארבעה מגבוני חדר נקיים, שהונחו על משטח קשיח ושטוח, כגון לוח זכוכית קטן. חזרו על הפעולה עם זכוכית הכיסוי. הרימו את זכוכית הכיסוי מהקצה והפכו אותה כך שצד הפוליש פונה כלפי מטה מעל הפרוסה.יישרו את הקצוות השטוחים בזהירות, הניחו את זכוכית הכיסוי על גבי הפרוסה והמתינו עד שתתמקם; דחפו אותה אופקית בלבד כדי לדייק את היישור. לחצו בעזרת אצבע אחת על מרכז הפרוסה. ניתן יהיה להבחין בחזית הידבקות המתפשטת כלפי חוץ.במידת הצורך, הפעל לחץ נוסף במיקומים אחרים מסביב לווייפר כדי לקדם את חזית ההדבקה. לאחר הנחת הווייפרים האטומים בתנור בטמפרטורה גבוהה המתוכנת לפי פרופיל הטמפרטורה המפורט בטקסט, חתוך את הווייפר באמצעות מסור לחיתוך וייפרים לשבבים בודדים. ניתן להכין את המניפולטור להחזקת שבב הערבוב והתמיסות מפלסטיק כגון lexan או plexiglass, או מאלומיניום.לבקרת טמפרטורה, חברו את השבב למניפולד באמצעות טבעות O קטנות וקבעו אותו במקומו בעזרת טבעת אבטחה המאפשרת ראות אופטית ברורה של מרכז השבב. חריצי טבעות ה-O צריכים להיות רדודים יותר מהסטנדרט כדי להבטיח התאמה טובה מבלי להפעיל לחץ רב מדי על השבב. לאחר התקנת השבב, הוסיפו תמיסות למאגרים המרכזיים והצדדיים, תוך הקפדה על שחרור בועות אוויר כלשהן שנלכדו בתחתית הבארות.הנח את המניפולד על מיקרוסקופ הפוך ובחן את אזור הערבוב באמצעות העינית או פלט המצלמה. פנס להט שיונח מעל המניפולד יספק תאורה מספקת. השתמש בצבע או בתמיסה בעלת מקדם שבירה גבוה בתעלה המרכזית כדי לצפות בסבך.מכיוון שהנפחים המשמשים במערבל זה הם קטנים מאוד, ניתן לשלוט בזרימה באמצעות לחץ אוויר המופעל מעל בארי התמיסות. כדי להדמיאן את הסילון, התחילו עם לחץ אפס psi בערוץ הצד והגבירו אותו לאט עד להשגת לחץ שווה לזה של הערוץ המרכזי. אם אחד מערוצי הצד סתום, הסילון יידחף לעבר אחד מקירותיה של תעלת היציאה.אם מופיעה סתימה נראית לעין, ניתן לשחרר אותה על ידי הפעלת לחץ או ואקום בערוץ היציאה באמצעות מזרק. אם חלבון או חומר אורגני אחר סותמים את השבב, ניתן לנקות אותו על ידי השריה בתמיסת piranha למשך לילה. הכניסו קרן לייזר מצופה לתוך מיקרוסקופ ברמה מחקרית באמצעות מראה דיכרואית, בתוך המיקרוסקופ או ממש מחוצה לו.יישרו את הלייזר כך שניתן יהיה לראות את המוקד בעין או במצלמה בקרבת אזור הערבוב. פלואורסצנציה מהחלבון בערבוב נאספת על ידי העדשה ומועברת דרך המראה הדיכרואית, ממוקדת על ידי עדשה אל תוך חור סיכה (pinhole) ומדומיינת על גבי מונה פוטונים. סרקו את השבב באמצעות סורק פייזו-אלקטרי בצירים x ו-y כדי לדמיין את אזור הערבוב.בחרו מיקום על הסילון ובצעו סריקה בצירים X ו-Y כדי למצוא את המוקד במרכז התעלה בצורה אנכית. עומק השדה של המיקרוסקופ קטן בהרבה מעומק התעלה, וקצב הזרימה בתעלה הוא אחיד למעט במרחק של מיקרון אחד מהדפנות. לפיכך, הרזולוציה הזמנית של הפלואורסצנציה הנצפית נקבעת בעיקר על ידי גודלו של המוקד הקונפוקאלי.בצעו סריקה אופקית בתוך תעלת היציאה במרווחים של 100 micron לאורך הסילון, תוך תצפית של כמילישנייה אחת לכל מיקום. הזיזו את בסיס המיקרוסקופ ב-80 עד 90 micron לאורך הסילון כדי ללכוד זמנים מאוחרים יותר. לחלופין, ניתן לגשת לגילוי האור באמצעות ספקטרוגרף ו-CCD אחרי המראה הדיכרואית, תוך שימוש בעדשה למיקוד האור על חריץ הכניסה.כיוון שאיסוף הנתונים איטי יותר מאשר במונה הפוטונים, בדרך כלל מצלמים תחילה את הסילון באמצעות מונה הפוטונים, ולאחר מכן מודדים נקודות לאורך הסילון באמצעות הספקטרוגרף. נתונים ממונה הפוטונים מנותחים על ידי סיכום של שלושה עד חמישה פיקסלים מסביב לסילון בכל מיקום, כדי ליצור גרף של עוצמה לעומת מרחק. הזמן מחושב מהמרחק באמצעות מהירות מחושבת המבוססת על הלחצים המופעלים.כשלב סופי, נתחו את הנתונים מהספקטרוגרף באמצעות אחת השיטות המתוארות בטקסט. מוצג כאן תרשים קונטור של העוצמה באזור הערבוב שנמדדה על ידי מונה הפוטונים. הרקע בערוץ היציאה מחוץ לסילון צריך להיות קרוב לרצפת הרעש של הגלאי ובדרך כלל אינו מופחת.רקע גבוה יותר עשוי להצביע על יישור לקוי או על כך שהחלבון נדבק לדפנות התעלה. לעומת זאת, סילון שנראה מקופל או עקום, במיוחד סמוך לאזור הערבוב, מעיד על תכתוש (etch) לקוי של הדיזות. מוצג ספקטרום ברזולוציית זמן של חלבון ACell coenzyme a binding protein או A CBP המסומן ב-Alexa 488 וב-Alexa 647.המלבנים הירוקים והאדומים מראים את אורכי הגל שהוגדרו כערוצי התורם והמקבל, בהתאמה. נתונים אלה עברו חיסור רקע כדי להסיר את מטען החושך ואת אות הלייזר. אות הרקע נלקח כאשר הלחץ בערוץ המרכזי היה אפס pounds per square inch.ניתן למדוד את זמן הערבוב על ידי מדידה של תגובה מהירה שהיא מהירה בהרבה מהערבוב, כגון כיבוי פלואורסצנציה של tryptophan על ידי potassium iodide. מכיוון שהסילון קטן מהרזולוציה האופטית של המיקרוסקופ, חלה ירידה משמעותית בעוצמה באזור הערבוב. בעת היווצרות הסילון, ניתן להסיר תגובה זו של המכשיר על ידי ביצוע מדידת ביקורת שבה לא משנים את תנאי התמיסה.איור זה מציג את היחס בין ניסויי ערבוב לניסויי אי-ערבוב של פלואורסצנציה של N-Acetyl tryptophan amide. הקו מציג את הריכוז החזוי של potassium iodide מתוך מידול וסימולציות של console multiphysics. זמן הערבוב, כפי שנמדד על פי הזמן הדרוש לירידה של 80% בריכוז, הוא שמונה מיקרו-שניות.תרשים זה מציג את השינויים ב-fret בחלבון A CBP לאחר דילול של חומר דנטורציה מריכוז של six molar ל-0.06 molar. נתונים אלו אינם דורשים ניסוי ביקורת. מכיוון שה-fret הוא כבר יחס ותגובת המכשיר כבר הוסרה, הקפיצה המהירה סמוך ל-T ששווה לאפס מייצגת שינוי מהיר באות ה-fret בתוך זמן הערבוב.בעקבות פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום קיפול חלבונים לחקור את השלבים המוקדמים ביותר ביצירת מבנה החלבון.

microfluidic-mixers-for-studying-protein-folding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן, אנו מתארים הליך המשתמש בטכניקת שלירן בקנה מידה מיקרו כדי למדוד אי הומוגניות ערבוב במכשיר מיקרופלואידי. באמצעות כיול ניתן לגזור את התפלגות שיפוע הריכוז מתמונת המיקרו-שלירן.

ניתוח inhomogeneity ערבוב במכשיר microfluidic על ידי טכניקת microscale Schlieren

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לפברק ופועלים microfluidic התקנים עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. בנוסף, הוא מתאר כיצד לפקח התגבשות חלבונים על ידי פיזור אור דינאמי וקיבלתי כיצד לעבד ולנתח נתונים עקיפה.

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

נדגים את ייצור ושימוש של מכשיר microfluidic המאפשר מספר החלקיקים מעקב מדידות microrheology לחקור את ההשפעות rheological של מעברים שלב חוזרות ונשנות בעניין רך.

שילוב מיקרופלואידיקה Microrheology כדי לקבוע מאפייני Rheological מחומר רך במהלך שלב חוזרות מעברים

נייר זה מפרט את פרוטוקול הייצור של שבבים מיקרופלואידיים שפותחו להתגבשות  חלבונים על שבב בשיטת הדיאליזה ובניסויי עקיפת קרני רנטגן. תהליך microfabrication מאפשר לשלב קרום דיאליזה תאית מתחדשת למחצה עם כל משקל מולקולרי מנותק, בין שתי שכבות של השבב.

התגבשות חלבונים על שבב על ידי מיקרודיאליזה עבור In Situ רנטגן עקיפה מחקרים

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש ב- Spotiton, מערכת רובוטית חדשנית, כדי לספק שתי דוגמאות של עניין על רשת ננו-חוטים עצמית המערבבת לפחות 90 אלפיות השנייה לפני vitrification בקריוגן נוזלי.

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה משלב פוטומטריית מסה עם מערכת מיקרופלואידיקה חדשנית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בעלות זיקה נמוכה. גישה זו מבוססת על דילול מהיר של קומפלקסים מרוכזים מאוד בתמיסה, המאפשר מדידות בעלות זיקה נמוכה ומרחיב את תחולת פוטומטריית המסה.

ניתוח היווצרות קומפלקס חלבונים בריכוזים מיקרומולרים על ידי צימוד מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסה

הייצור של התקן דו-שכבתי מבוסס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) לייצור ספריות קומבינטוריות בתחליבים של מים בשמן (תקעים) מוצג כאן. החומרה והתוכנה הדרושים לאוטומציה של ייצור תקעים מפורטים בפרוטוקול, ומודגם גם ייצור ספרייה כמותית של תקעים פלואורסצנטיים.

התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי לייצור תקע קומבינטורי

פרוטוקול זה מפרט את התכנון והייצור של מכשיר מיקרופלואידי, המתאים לחקירת מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים. הסינתזה של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וטכניקות מידול חישוביות מאפשרת מערכת גמישה המתאימה באופן אידיאלי לחקירת השלד התאי במבחנה.

פיתוח גישה מבוססת מיקרופלואידיקה לחקר מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים

במאמר זה, אנו מציגים שיטה microfluidic מבוסס על הכליאה החלקיקים מבוסס על זרימה הידרודינמית. אנו מדגימים לכידה חלקיק יציב בנקודה נוזל הקיפאון באמצעות מנגנון בקרה ומשוב, ובכך מאפשרים כליאה ו המיקרומניפולציה של חלקיקים שרירותי microdevice משולבת.

Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

למדו כיצד לייצר מערבל מיקרו-פלואידי לערבוב מהיר של תמיסות בקנה מידה של מיקרו-שניות. השיטה משתמשת בזיהוי ספקטרוסקופי ובמיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית לחקר קיפול חלבונים.

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

גלה סרטונים נוספים