ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

ספקטרוסקופיית ראמאן היא טכניקה מתאימה ללא מגע, תווית ללא ניתוח של תאים חיים, רקמות מהונדסות בונה רקמות מקומיות. מקור ספציפיים טביעות אצבעות ספקטרלית ניתן להפיק נותחו באמצעות ניתוח רב משתני.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר תאים ורקמות בשיטה ללא מגע וללא סמנים. זה מושג באמצעות ספקטרוסקופיה של ראמן, טכנולוגיה מבוססת לייזר המזהה את הפיזור הלא אלסטי של אור מונוכרומטי, ומייצרת דפוס ספקטרלי אופייני לכל דגימה ביולוגית המבוססת על ההרכב הביוכימי הטבוע בה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי המחובר לספקטרומטר ראמן. השוואה ישירה של תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי עם ראמן ספקטרה משמשת לניטור דגימות ביולוגיות רבות.

כל רטט כימי מוקצה לרצועת רמאן ספציפית, ועוצמת השיא מתואמת עם כמות הקשרים המולקולריים הנוכחיים. מתגלים קווי דמיון והבדלים בין מערכי הנתונים הספקטרליים. על ידי שימוש בניתוח רב-משתני, ניתן להשתמש בספקטרום המתקבל כדי לבדוק את תקינות הרקמות לאחר קצירת ביופסיה או כדי להוכיח את הסטריליות של תאים מבודדים.

בנוסף, טכניקה זו מאפשרת אפיון וזיהוי של סוגי תאים שונים במבחנה. בסופו של דבר, ספקטרוסקופיה של ראמן היא טכניקה מבטיחה מבוססת לייזר להנדסת רקמות ויישומים קליניים באמצעות ניתוח ללא מגע ללא תוויות, ידגימו את ההליך דניאל קבאל באריו, טכנאי, ומרים טאלה, דוקטורנטית במעבדה שלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות שגרתיות קיימות, כגון היסטולוגיה והדמיה אימונופלואורסצנטית, הוא שאין צורך בעיבוד דגימה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מצב תא בודד ורכיבי מטריצה, ניתן ליישם אותה גם על רקמות ואיברים רב-תאיים. להכנת ספקטרום ראמן מותאם אישית, מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי מחובר לספקטרומטר ראמן המאפשר השוואה ישירה של תמונות פלואורסצנטיות עם ספקטרום ראמן. המערך הבסיסי מורכב מלייזר דיודה של 784 ננומטר, מסנן חריץ להפרדת הראמן, אור מפוזר מאור העירור, מיקרוסקופ וספקטרוגרף עם מכשיר מצמד מטען המותאם לזיהוי מידע ספקטרלי.

כדי לשלוט בתפקוד הלייזר, הפעל את התוכנה ו/או הנחמה והגדר את הטמפרטורה של מצלמת ה-CCD ל-60 מעלות צלזיוס שלילית כדי למזער את הרעש הנגרם על ידי זרמים המושרים תרמית במצלמה. הנח פרוסת סיליקון על המיקרוסקופ stage להליך הכיול. הפעל את הלייזר והגדר את ההספק ל-85 מילי-וואט.

השתמש בתא התוכנה B כדי למקד את הלייזר על הוופל עד להופעת XY. מדוד את פרוסת הסיליקון עם זמן אינטגרציה יחיד של שנייה אחת. באמצעות יעד אוויר של 60X, שנה את היחידה של ציר X ממספר פיקסלים לראמן.

תזוזה בתוכנת ו/או סולי משנה את מיקוד הלייזר של פסגת הסיליקון בגל מספר 520 בספקטרום שנאסף. על מנת למצוא את העוצמה המקסימלית האפשרית עבור רצועת ראמן זו, כמות הספירות המינימלית חייבת להיות גבוהה מ-11,000 כדי לבצע כיול מוצלח לפני המדידה הספקטרלית, הכינו את הדגימות הביולוגיות לפי ההוראות בפרוטוקול הכתוב. בליווי סרטון זה, כל המדידות מבוצעות בטמפרטורת החדר.

באמצעות יעד טבילה במים של פי 60 עם צמצם מספרי של 1.2, יש לאסוף ספקטרום באמצעות 10 אינטגרציות לכל 10 שניות בסך הכל 100 שניות למדידה. כדי לבצע מדידה של תאים נצמדים, הנח צלחת תחתית זכוכית המחזיקה את התאים על שלב המיקרוסקופ. על מנת להשיג אות טוב יותר ולהבטיח שחזור, מקדו את הלייזר על גרעין התא, כבו את אור המיקרוסקופ והתחילו לאסוף את הספקטרום.

מדוד ספקטרום ייחוס של הרקע כל 10 ספקטרום על ידי הזזת מיקוד הלייזר לצד התא. חשוב לקחת בחשבון שבעת שינוי המיקוד, יש לאסוף רקע חדש עבור כל עומק מיקוד. לחלופין, על מנת למדוד תאים ותרחיף, העבירו 100 מיקרוליטר מתרחיף התא לכלי תחתית זכוכית.

לאחר ההנחה על שלב המיקרוסקופ, מקדו את הלייזר במרכז התא, כבו את אור המיקרוסקופ והתחילו לאסוף שוב את הספקטרום. מדוד ספקטרום ייחוס של הרקע כל 10 ספקטרום על ידי הזזת מיקוד הלייזר לצד התא. כדי למדוד את ספקטרום הרקמות המקומיות, הנח את הדגימה בכלי תחתית זכוכית.

יש לכוון את אזור העניין מול תחתית המנה. מלאו את המנה במספיק PBS כדי לכסות את הדגימה. הנח כיסוי מעל הדגימה כדי למנוע כל תזוזה של הדגימה.

במהלך המדידות, הגדר את מיקוד הלייזר למבנה המעניין והתחל לאסוף את הספקטרום. אסוף ספקטרום ייחוס של הרקע כל 10 ספקטרום על ידי הזזת מיקוד הלייזר מכל אזור הרקמה, ותמיד אסוף רקע חדש לכל עומק מיקוד למדידה ספקטרלית של קטעי קריו המסומנים באימונופלואורסצנטיות. חתך דגימות רקמות קפואות טריות.

בעזרת קריו רגיל, הרכיבו אותם על משקפי כיסוי מצופים סיליקה. צביעת חלקי הקריו בהתאם לפרוטוקול שגרתי לאימונופלואורסצנטיות, תוך שימוש בשלב קיבוע קצר בלבד ושימוש בנוגדנים מתאימים לזיהוי החלבון המעניין שבוצע. מדידות ראמן מתמקדות באזור בו מתרחשת הקרינה.

כדי להדגים ניסויי פירוק אלסטין, הגחון של עלוני שסתום אבי העורקים החזירי המנותחים ממוקמים מול תחתית הזכוכית. מנה תחתונה. מדוד את הרקמה המקורית כבקרה ללא דגירה ב-30 נקודות אקראיות על פני כל משטח הרקמה.

התמקדות במבנים הסיביים חילקה את הדגימה לשני חלקים והניחה אותם בצינורות נפרדים של 2.5 מיליליטר מלאים בשני מיליליטר של תמיסת אלסטאז. דגרו על הרקמה למשך 15 או 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש להוציא את הרקמות מצינור העינור ולשטוף בזהירות עם PBS על מנת להפסיק לחלוטין את התגובה האנזימטית.

מדוד כל דגימה ב-30 נקודות אקראיות תוך התמקדות במבנים הסיביים. עיבוד Raman Spectra מתחיל בטיפול מקדים בספקטרום שנוצר באמצעות תוכנת Opus. ראשית, הפחיתו את ספקטרום הרקע המתאים מהספקטרום שנאסף כדי להפחית אותות מפריעים מהזכוכית והמדיום, כמו גם כדי למנוע שינויים הנגרמות על ידי שינויים במיקוד.

במהלך המדידות, צמצם את הספקטרום לאזור מספר הגל בין 401, 800, המציע את כמות המידע הגבוהה ביותר במידת הצורך. מנרמל את הספקטרום לנורמליזציה השיא המקסימלית, גורם את תנודות העוצמה בכשלים שיטתיים, ומפשט את זיהוי השינויים המבניים בספקטרום הדגימה. בצע תיקון בסיסי כדי להגדיל את יכולת ההשוואה בין ניסויים שונים.

נתח את ספקטרום ה-Raman באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים או PCA עם תוכנת unscrambler. ניתוח רב-משתני זה מזהה הבדלים ודמיון בתוך מערכי הנתונים הספקטרליים. כל ספקטרום משורטט כנקודה בודדת במרחב רב-ממדי בהתבסס על הספירה שנאספה עבור כל הזזת ראמן.

כל רכיב עיקרי, מחשב מקוצר מתאר כמות מסוימת של המידע הכולל הכלול בנתונים המקוריים. המחשב הראשון הוא זה שמכיל את מקור השונות הגבוה ביותר. כל מחשב עוקב מכיל בסדר פחות מידע מהקודם.

לכל משתנה יש ציון ועומס על כל PC.By מחשבים מתווים, ניתן לחשוף מתאמים חשובים לדוגמה. העומסים מתארים את התרומה של כל משתנה שנבדק ל-PCA. תווית, כל קבוצת מדידות על ידי יצירת טווחי שורות עבור כל קבוצת דגימה, השתמש בהגדרות הבסיסיות הבאות עבור אימות צולב PCA, אלגוריתם Nip Al, ללא סיבוב והתחל את הניתוח.

הגדרות אלה תלויות ספקטרה. לבסוף, בצע את ספקטרום הראמן הגולמי PCA שנוצר מתאים דבקים חושף לעתים קרובות יחס אות לרעש נמוך ועוצמת אות כוללת נמוכה. יש לכוון את מיקוד הלייזר ליד תחתית הזכוכית, מה שמסווה את אות הדגימה בפועל.

כתוצאה מכך, אות הדגימה עשוי להיות ממוזער או אפילו להתבטל במהלך חיסור רקע עוקב. לעומת זאת, תאים ותרחיפים מאפשרים זיהוי של מידע ספקטרלי מפורט יותר. עם זאת, הספקטרום של תאים נצמדים ותרחיפים מציג את אותן פסגות עיקריות הנבדלות רק בעוצמותיהן לאפיון סוגי תאים שונים בתוך תרחיף, אין צורך בטיפול מקדים.

ספקטרום הרמאן הממוצע וסטיות התקן של פיברובלסטים אנושיים, תאי גזע מזנכימליים, כונדרוציטים וקרטינוציטים הנמדדים בתרחיף מתוארים כאן. כל ספקטרום הראמן בנוי באופן דומה עם פסגות שמקורן בביומולקולות טיפוסיות כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. עבור סוגי תאים אלה, האזור הספקטרלי בין גל מספר 601, 800 מכיל את המידע הספקטרלי הרלוונטי ביותר שבאמצעותו ניתן לזהות הבדלים ברורים בין סוגי התאים השונים.

אזור ספקטרלי אחד לדוגמה מציג הבדלים מבניים ברורים, הניתנים להקצאה לתנודות מולקולריות של קולגן ושומנים. לעומת זאת, ניתוחים מורפולוגיים אינם מתאימים לזיהוי והבחנה של רוב התאים. בעוד שההבדל בין כונדרוציטים לתאי עור ניכר, קשה להפריד בין פיברובלסטים לתאי גזע מזנכימליים.

באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בלבד להקצאת רקמה מקורית לספקטרום טביעות אצבע ספציפי, Raman Spectra נוצרו מחלבונים טהורים זמינים מסחרית וקטעי קריו מוכתמים היסטולוגית חיסונית. כאן, ספקטרום טביעות אצבע של סיבים אלסטיים זוהה בתוך רקמות טבעיות על ידי השוואה לקטעי קריו מוכתמים בליופיליזציה, אלסטין וחיסון פלואורסצנטי שסומנו באמצעות נוגדן נגד אלסטין. עם זאת, מכיוון שאלסטין כולל אוטופלואורסצנטיות גבוהה, המשתקפת בספקטרום ראמאן, ניתוח הנתונים מאתגר להפחית את הכשל השיטתי עקב מאפיינים ספציפיים של דגימה כגון אוטופלואורסצנציה ועיבוד מתאים של מערכי הנתונים הוא קריטי.

בניתוח הנתונים. נורמליזציה שימשה כדי לבטל את עוצמת האות הגבוהה משמעותית של חלבון האלסטין הטהור וכתוצאה מכך ספקטרום ראמאן דומה. אלסטין הוא אחד מחלבוני המטריצה החוץ-תאיים היציבים ביותר בגוף ולכן קשה מאוד לפירוקו. הנה.

פירוק אלסטין הושרה בעלונים בריאים של מסתם אבי העורקים החזירי על ידי ביצוע עיכול אנזימטי תוך יישום הניתוח הרב-משתני, PCA זוהו הבדלים משמעותיים בין ספקטרום ה-Raman של דגימות שטופלו אנזימטית לבין בקרות מקומיות. הבדלים ספקטרליים אלה נצפו בספקטרום הטעינה במספרי גל 861, 1003 ו-1,664 שינויים מבניים צפויים בסיבים המכילים אלסטין עקב זמני חשיפה ממושכים לאלסטאז באו לידי ביטוי בציון מובהק יותר הניתן להפרדה אשכולות המוצגים כאן הם ציוני ההשוואה בין בקרה לא מטופלת לסיבים אלסטיים מושפלים אנזימטית בתוך הרקמה הטבעית. שינויים מבניים צפויים אלה ניכרים גם בעלוני המסתם אבי העורקים המוכתמים של הלב כפי שניתן לראות בכניסה זו על ידי השוואת הבקרה הלא מטופלת לדגימות הרקמה שנחשפו לאלסטין המשלב אנזים אלסטאז למשך 30 דקות.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של התא והמטריצות, כמו גם ברפואה רגנרטיבית והנדסת רקמות לבצע לא רק ניתוח פנוטיפ תאים בזמן אמת, אלא גם לזהות אינטראקציות חיוניות בין תאים ומטריצות תאים ב-Z 2 בסביבה ילידית.