Name: מערכת ל Vivo לשעבר Culturing של לבלב עוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למד שיטה לגידול ניצני לבלב עובריים של עכברים ex vivo לחקירת מורפוגנזה והתמיינות תאים. המערכת מאפשרת הדמיה ישירה של התפתחות הלבלב וארגון הציטוסקלטון לאורך שבוע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר ב Spagnoli המעבדה. ממומן על ידי אגודת הלמהולץ, FP7-IRG-2008-ENDOPANC המענק וגרנט HEPATOPANCREATIC ERC-2009 החל-.

<ol><li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li>
<li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li>
<li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endoderm+to+pancreas%3A+a+multistep+journey%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li>
<li>Hick, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li>
<li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li>
<li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li>
<li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li>
<li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ברגע שגורל לבלב מצוין, ותאי לבלב לעבור התפשטות נרחבת, בידול והמורפוגנזה סופו של דבר ליצירת איבר בוגר ותפקודי 2,4. נכון לעכשיו, איך ההסתעפות מתרחשת בלבלב ואיך זה קשור לריבוי מולידו ובידול היא במידה רבה לא ידוע. תרבויות explant לבלב מייצגות מערכת אידיאלית להבהיר תהליכים אלה vivo לשעבר 5,9,11. על ידי שילוב הדמיה חייה תאים עם explants vivo לשעבר של ניצני לבלב המוקדמים ניתן לקבל תמונה ברורה של האירועים שמתרחשים במהלך המורפוגנזה לבלב בעובר. מאמר ז...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> נוגדנים: Carboxypeptidase E-cadherin ה-F-תקטין גלוקגון אינסולין β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-היסטון H3 </td><td> עבד Serotec Invitrogen בדיקות מולקולריות ImmunoStar Millipore Millipore Abcam היברידומה בנק איתות תא </td><td> 1810-0006 13-1900 -12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> אסאל בינוני נשר (BME) </td><td> סיגמא </td><td> B1522-500 מ&quot;ל </td><td> המשיך בתנאים סטריליים </td></tr><tr><td> מי כיתת תרבית תאים </td><td> Paa </td><td> S15-012 </tד&gt; <td> המשיך בתנאים סטריליים </td></tr><tr><td> מנות תרבות (בעלת קרקעית זכוכית), 35-מ&quot;מ </td><td> מאטק תאגיד </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> דונקי סרום </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> עגל עוברי סרום זהב </td><td> Paa </td><td> A15-151 </td><td> המשיך בתנאים סטריליים </td></tr><tr><td> פיברונקטין </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> מניית סול. 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במי כיתת תרבית תאים </td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> המשיך בתנאים סטריליים </td></tr><tr><td> גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> המשיך בתנאים סטריליים </td></tr><tr><td> Multidishes 4-כן </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופים: Confocal מיקרוסקופ ההפוך (LSM 700) סטראו (גילוי V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> מטרות: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist 1.8 מ&quot;מ;. עומק הדמיה ~ 100 מ&quot;מ); C-Apochromat 40X / 1.2 W הקור M27 (work. 0.28 מ&quot;מ dist;. ~ עומק ההדמיה 50 מיקרומטר) קוף מלמטה ותאורת סיבים אופטיים מלמעלה </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> רוט </td><td> 0,335.3 </td><td> פתרון מנייה 20% </td></tr><tr><td> Pipet פסטר (זכוכית), 150 מ&quot;מ </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Paa </td><td> P11-010 </td><td> המשיך בג סטריליonditions </td></tr><tr><td> צלחות פטרי, 60 מ&quot;מ </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי, 35 מ&quot;מ </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH7.4 </td><td> Paa </td><td> H15-002 </td><td> המשיך בתנאים סטריליים </td></tr><tr><td> להב מספרי 8 מ&quot;מ האביב מעוקל </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון-x100 </td><td> רוט </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> של שען foreceps דומון # 5 </td><td> רוט </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

מערכת ל<em&gt; vivo לשעבר</em&gt; culturing של לבלב עוברי

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

הלבלב שולט בתפקודים חיוניים של הגוף שלנו, כולל ייצור של אנזימי עיכול ופיקוח על רמות סוכר בדם 1. אמנם בעשור האחרון מחקרים רבים תרמו ליסודות מוצקים להבנת organogenesis לבלב, פערים חשובים להתמיד בידע של היווצרות לבלב המוקדמת 2 שלנו. הבנה מלאה של האירועים המוקדמים הללו תספק תובנה לתוך הפיתוח של איבר זה, אלא גם למחלות חשוכות מרפא המתמקדות בלבלב, כמו סוכרת או סרטן הלבלב. לבסוף, את המידע הזה יפיק תכנית לפיתוח טיפולים להחלפת תא בהקשר של סוכרת. במהלך התפתחות עוברת, הלבלב נובע מאוטופיות צמחה עובריות שונות של האנדודרם המעי הקדמי גב וגחון ביום עוברי (E) 9.5 בעבר עכבר 3,4. שני האוטופיות צמח evaginate לmesenchyme מקיף כepithelia מוצקניצני הליטר, שעוברים התפשטות, מסתעף ובידול לייצר איבר בגרות מלאה 2,5,6. העדויות האחרונות הראו כי צמיחה והתבדלות של תאי לבלב שושלות, כולל את β-תאים המייצרים אינסולין-, תלויות ברקמות ארכיטקטורת שיפוץ ראוי, אפיתל ומיצוב תא בתוך אפיתל לבלב הסתעפות 7,8. עם זאת, איך מסתעף המורפוגנזה מתרחשת ומתואם עם ריבוי ובידול בלבלב הוא ידוע ברובם. זה בחלקו בשל העובדה שהידע נוכחי על תהליכים התפתחותיים אלה הסתמך כמעט אך ורק על ניתוח של דגימות קבועות, תוך אירועים המוךפו&quot;גנטי הם דינמיים מאוד. כאן, אנו מדווחים שיטה לvivo culturing העכבר העוברי לבלב הניצנים לשעבר במנות תחתית זכוכית, המאפשרות הדמיה ישירה של לבלב הפיתוח (איור 1) ולנתח. כת זומערכת יור פתח באופן אידיאלי למיקרוסקופיה confocal סריקת הליזר, ובהדמיה בפרט, חי תאים. explants לבלב יכול להיות מוכן לא רק מעוברי עכברי סוג פראי, אלא גם מזני עכבר מהונדס גנטי (למשל מהונדס או נוקאאוט), המאפשר לימודים בזמן אמיתי של פנוטיפים מוטציה. יתר על כן, מערכת תרבות vivo לשעבר זה יקר כדי לחקור את ההשפעות של תרכובות כימיות על התפתחות לבלב, ומאפשר לקבל מידע כמוני על שגשוג וצמיחה, התארכות, הסתעפות, tubulogenesis והבחנה. לסיכום, הפיתוח של שיטת vivo לשעבר לבלב explant תרבות בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מספק פלטפורמה חזקה להתבוננות אירועים המוךפו&quot;גנטי ובידול כפי שהם מתרחשים בתוך עובר העכבר המתפתח.

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג מצוין<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; מערכת ללימוד היבטים שונים של פיתוח לבלב, כולל המורפוגנזה, התמיינות וגדילה. explants ניצן הלבלב יכול להיות מתורבת במשך כמה ימים ולהשתמש במגוון של יישומים שונים, כולל כל הר-immunofluorescence והדמיה חייה.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

הלבלב שולט בתפקודים חיוניים בגופנו, כולל ייצור של אנזימי עיכול וויסות רמות הסוכר בדם1. למרות שב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע דיסקציה וגידול של ניצני לבלב עובריים של עכבר, ex vivo, המאפשרים הדמיה ישירה של הלבלב המתפתח. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע דיסקציה לעוברי עכבר ביום עוברי 11.5 או 12.5 והסרת אזור הגוף העליון והזנב כדי לבודד את מרכז גוף העובר. השלב השני הוא חשיפת אזור התריסריון והקיבה לצורך מיקום, ולאחר מכן ביצוע דיסקציה של ניצן הלבלב הגבי.בשלב הבא, מעבירים את הנבט למסגרת מיקרו-באר של צלחת MacTech ומגדלים אותו למשך שבוע לכל היותר. לבסוף, ניתן לנתח את האקספלאנט באמצעות הדמיה של תאים חיים, או שניתן לקבע את האקספלאנט, לצבוע אותו בשיטת whole mount ולנתח אותו באמצעות הדמיה של אימונופלואורסצנציה. באופן סופי, ניתן להעריך את הדיפרנציאציה של תאי הלבלב, את ארגון השלד התאי, את קוטביות התאים ואת המורפוגנזה של ההסתעפות.תרבית ex vivo של נתחי לבלב יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאורגנוגנזה של הלבלב, כגון מורפוגנזה של התשעפות. כיצד היא מתרחשת בלבלב המתפתח וכיצד אירוע זה קשור לצמיחה ולדיפרנציאציה. ביום שלפני הניסוי, כסו את מיקרו-בארים בעלות תחתית זכוכית בקוטר 20 מילימטר שבתוך צלחות פטרי של MacTech בקוטר 35 מילימטר, באמצעות כ-150 µL של פיברונקטין כך שיכסה את כל פני השטח של הזכוכית.לאחר מכן, העבירו את הצלחות למקרר בטמפרטורה של 4 °C לדגירה למשך לילה. ביום הניתוח, שאבו את הפיברונקטין. שטפו את המיקרו-בארים במים בדרגת תרבית תאים, והוסיפו נפח מינימלי של 150 µL של מדיום ניתוח לכל באר.כדי להבטיח את הצלחת הנתיחה, חיוני להכיר היטב את המבנה האנטומי של העובר ולהיות מסוגלים לאתר את הניצן הלבלבי הגבי (dorsal pancreatic bud) תחת מיקרוסקופ סטריאו עם תאורה מלמעלה. השתמשו בפינצטת Dumont כדי להפריד את הרחם למקטעי עוברים בודדים. לאחר מכן, קלפו בעדינות את שרירי הרחם והוציאו את העוברים הבודדים העטופים בדסידואה (decidua).בעזרת טכניקות סטנדרטיות לדיסקציה של עובריים, חשפו את העוברים והסירו את שקיק החלמון ואת השליה. לאחר מכן, הסירו את אזור הזנב ואת חלקו העליון של גוף העובר מעל הכבד. כעת, באמצעות תאורה תמיכה (trans illumination) מלמטה בלבד, השתמשו בפינצטה כדי לבצע חתך צדי עדין לפתיחת מרכז גופו של העובר, כדי לאפשר חשיפה של האיברים הפנימיים.אתרו את הקיבה ואת הטחול. הניצן הלבלבי הגבי (dorsal pancreatic bud) מחובר לצד האחורי של אזור הקיבה. בעזרת פינצטת Dumont, הפרידו את הניצן הלבלבי הגבי מהקיבה ומהטחול, אך השאירו כמות מסוימת של מזנכימה סביב האפיתל, כפי שמוצג עבור הניצן הלבלבי באיור זה.לבסוף, השתמשו בפיפט פסטור מזכוכית כדי להעביר את הניצן המבודד למנתra פטרי בקוטר 35 מילימטר המכילה מצע גידול קר. לאחר חימום מוקדם של מצע הגידול, החליפו את מצע הדיסקציה בכלי ה-matte tech המצופים ב-fiber nin בכ-150 µL של מצע הגידול. תחת מ 빠르게 למינרית סטרילית, חשוב להניח את ה-pancreatic exponent בזהירות במרכז צלחת ה-Matt כדי להבטיח היצמדות ופריסה של התאים.לאחר מכן, השתמשו בפיפטת זכוכית (pasture pipette) כדי להעביר בזהירות רגש לבלב (explan) אחד לכל אחת מהצלחות המט-טק (matte tech) המצופות. כדי להבטיח התפשטות במהלך התרבית, קרעו חלקית את המזנכימה הסובבת את הרגש באמצעות מחט עדינה. כעת, הניחו בעדינות את הרגש בתוך אינקובטור לתרביות רקמה למספר שעות כדי לאפשר להם להיקשר לתחתית הזכוכית של המיקרו-בארים.לאחר שהאקספלנטים נצמדו, מלאו את צלחות הטכניקה במטריצה עם 1.5 עד שני מיליליטר של מצע גידול שחומם מראש. החליפו את מצע הגידול מדי יומיים למשך חמישה ימים ועד שבוע. התחילו בשאיבת מצע הגידול ושטפו את האקספלנט פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS.לאחר מכן, הסירו את ה-PBS וקבעו את שתלי ה-X עם שני מיליליטר של 4% para formaldehyde קר מאוד (בטמפרטורת קרח), והניחו את צלחת ה-matte tech על קרח למשך 20 דקות, תוך כדי סיבוב עדין של הצלחת מדי פעם. לאחר מכן, הסירו את ה-paraform aldehyde ושטפו את האקספלנט שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS למשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה, בצעו חסימה עם שני מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. כעת, העבירו את צלחות ה-mat tech לחדר הקירור והניחו אותן בתוך תא לחות.כדי למנוע התאיידות, הוסף לפחות 150 µl של הנוגדן הראשוני המדולל בתמיסת חסימה ישירות למרכז המיקרו-באר בעלת קוטר של 20 mm. הנח את לוחות MatTek המכסים את כל שטח הפריסה לדגירה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף שלוש פעמים כל נוגדן שאינו קשור באמצעות 2 mL של PBS plus tween 20, למשך 30 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.לאחר השטיפה, הוציאו את ה-PBT וכסו את כל החתך במינימום 150 µL של תמיסת הנוגדן המשני, והדגירו את החתך למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך לצורך צביעה בנוגדן המשני. שטפו את החתך שלוש פעמים עם 2 mL של PBS plus tween 20, למשך 30 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן פעם אחת עם PBS בלבד כדי להסיר את ה-tween 20.לבסוף, הסירו את ה-PBS והוסיפו בטיפות של תמיסת קיבוע מימית עם חומר למניעת דהייה (anti fading) לתוך מיקרו-באר של 20 מילימטר בלוחיות ה-mat tech. לאחר מכן, כסו בעדינות את הנתח (explan) עם כיסוי זכוכית תוך מניעת בועות אוויר. לאחר שהנתח הלבלבי נצמד בחוזקה לתחתית הזכוכית, הרכיבו והפעילו את תא החימום לפחות שעה לפני הדימות; בזמן שהציוד מתחמם, שאבו והחליפו את מצע הגידול של הנתח במצע תרבית טרי בתוך מabilis זרימה למינרית. לאחר מכן, העבירו בעדינות את השתלים לחדר המיקרוסקופ והניחו את לוחית ה-mat tech לתוך מחזיק הדגימות של מיקרוסקופ הקונפוקלי.הוסיפו מ">';מים למסביב העדשה. סגרו את תא הסביבה ולאחר מכן התמקדו באזור הרלוונטי בתוך הפיס השערה (explan). לאחר יומיים של תרבית, פיסות של הלבלב עוברות גדילה משמעותית ומתחילות להתארגן למבנים אפיתליאליים מסועפים.שימו לב לאזור שבו החלה ההסתעפות. שחזור תלת-ממדי מייצג זה של צביעה אימונוהיסטוכימית של דגימה שלמה (whole mount) ביום השלישי לתרבית של הלבלב, המסומן בתמונה הימנית על ידי קו מקווקו אדום, מדגים כיצד האקספלנטים מראים רשתות של תאים חיוביים ל-PDX1 שעוברים הסתעפות נרחבת תוך 48 שעות של תרבית. אקספלנטים ביום הרביעי לתרבית עוברים הפרדה טיפוסית של קצות (tips) וגזעים (trunks) של האפיתל, תוך הצגת צביעה ל-E-cadherin באדום ול-phospho-histone בכחול. carboxypeptidase 1 או CPA1 בירוק מופיע בתאי פרוגניטור בקצות הענפים האפיתליים, המסומנים אף הם על ידי הקווים המקווקווים. בצביעה אימונוהיסטוכימית מייצגת של דגימה שלמה ביום השלישי לסמני שושרה אנדוקרינית באקספלנטים של לבלב, צביעת אינסולין מיוצגת בירוק, גלוקגון מופיע בכחול ו-E-cadherin באדום, כאשר החצים הצהובים מצביעים על מקבצים של תאים חיוביים לאינסולין וגלוקגון.בתמונה המוגדלת, אחד מאשקרי an endocrine מודגש. בנוסף, אפיתל הלבלב בתרביות ex vivo מראה ארגון תקין של השלד התאי וקוטביות תאית עם לוקליזציה אפקלית של F actin, המופיע כאן בירוק, ושל beta one integrin בממברנות הבזאלליות המופיע כאן באדום. שימו לב לתאי המזנכימה המסומנים בכוכבית, הפזורים בין תאי אפיתל חיוביים ל-P pdx one.באיור זה מוצגים פריימים מייצגים שנלקחו בכל 12 דקות למשך 15 שעות בסך הכל מסרט time-lapse של תרביות של explants של לבלב עגבנייה עם סימון של ממברנה. הקווים המקווקווים מצביעים על קצות הענפים ועל הגבול בין האפיתל למזנכימה. שימו לב כי לאחר ניסוי time-lapse שנמשך 12 שעות, האות הפלואורסצנטי של הממברנה בעגבנייה נותר חיוני וניתן לזיהוי, למרות שעוצמתו פחתה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ההפרדה והגידול של ניצות הלבלב (pancreatic buds), דבר שיסייע לכם לחקור היבטים שונים של התפתחות הלבלב, כולל מורפוגנזה, גדילה ודיפרנציאציה.

a-system-for-ex-vivo-culturing-of-embryonic-pancreas

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחקר הנוכחי מתאר גישה בידול מכוון של גרימת הבחנה הלבלב של בתאי גזע עובריים אנושיים. חשיבות רבה היא מציאת תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של תא גזע עובריים אנושיים נגזר אבות לתאי הלבלב אינסולין המבטאים.

תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי

בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחין בתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) לתוך הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) תאים עבור הדור של שושלות הלבלב בהתבסס על הגידול חד שכבתי ללא-המושבה סוג של חלופה מועדפת תאים בודדים. שיטה זו מתאימה בהפקת הומוגנית נגזר hPSC תאים, מניפולציה גנטית וסינון.

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למד שיטה לגידול ניצני לבלב עובריים של עכברים ex vivo לחקירת מורפוגנזה והתמיינות תאים. המערכת מאפשרת הדמיה ישירה של התפתחות הלבלב וארגון הציטוסקלטון לאורך שבוע.

מערכת ל

גלה סרטונים נוספים