Name: Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למדו לזהות גנים המווסתים תחזוקה והתחדשות עצמית של תאי גזע עובריים בעכברים באמצעות שיטת מדידת פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של תפקוד גנים בביולוגיית תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בראד Lackford לקריאה ועריכה של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, המכונים הלאומיים לבריאות תוכנית המחקר המיפוי Z01ES102745 (ל GH).

1. Oct4GiP עכבר ES Cell תחזוקה תאים Oct4GiP נמסרו באדיבות ד&quot;ר אוסטין סמית. הם הופקו מתוך עכברים שנשאו 129/Ola Oct4-GFPiresPac transgene 4,5. הם שמרו על ג&#39;לטין מצופים צלחות תרבית רקמה במדיום ESGRO מלאה בתוספת משובט ציון (Millipore), או בינוני M15: DMEM (Invitrogen) השלימו עם 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x ללא חומצות אמינו חיוניות (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), ו -10 מיקרומטר β-mercaptoethanol. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל צלחות עם 0.1% ג&#39;לטין (Sigma) בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות (0.1 מ&quot;ל ג&#39;לטין פתרון / cm 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oct4GiP צלחת התאים ג&#39;לטין מצופים צלחות ב ~ 2 x 10 4/2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול התאים כל יומיים עם טריפסין 0.05%. </li></ol> 2. siRNA transfection בתאים Oct4GiP Assay כתב Oct4GiP היא convenien ביותרנשאו את tly בתחתית ג&#39;לטין מצופה שטוח 96 - או 384 צלחות היטב (Corning או BD) במדיום M15. הליך הכולל מתואר באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> siRNA-השומנים מתחמי הרכבה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 96-גם צלחות, להרכיב-siRNA השומנים מתחמי ב U-96-התחתונה גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל אחד טוב, לערבב 10 OptiMEM μl (Invitrogen) ו 0.3 Lipofectamine μl 2000 (Invitrogen) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 siRNA pmol לתערובת שומנים בדם OptiMEM ו דגירה למשך 15 דקות. SiRNA: יחס שומנים בדם הוא 100 pmol: 6ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את siRNA-השומנים מתחמי ב OptiMEM של צלחת U-התחתונה לצלחת שטוחה ג&#39;לטין התחתון מצופה עם פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 384 גם הצלחות, להכין את siRNA-השומנים באמצעות מתחמי 0.1 Lipofectamine μl 2000 ו 2 siRNA pmol ב OptiMEM 10 μl. </li></ol></li></ol> הערה: ריכוז siRNA האחרוןtransfections הוא 50 ננומטר. ביצוע הביולוגי 3-4 משכפל את כל transfection siRNA. הגדרת תערובות אמן של siRNA-השומנים מתחמי בצלחת U-התחתונה ו aliquot לתוך צלחת ג&#39;לטין מצופה שטוח התחתונה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oct4GiP ציפוי התא transfection: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 96-גם צלחות, לאסוף את התאים Oct4GiP ו resuspend אותם במדיום M15 טרי 9 x 10 4 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של השעיה תא זה גם באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה התא עם מראש aliquoted-siRNA שומנים מתחמי ב גם על ידי pipeting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. שינוי עצות transfections siRNA שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 384 צלחות היטב, תאים resuspend Oct4GiP עד 6 x 10 4 תאים / מ&quot;ל ו - 30 aliquot תא μl ההשעיה זה היטב. </li></ol></li></ol> הערה: צפיפות אופטימלית ציפוי התא הוא בדרך כלל 3 x 10 ס&quot;מ / 5 תאים 2, אבל מ &#39;איי דורש אופטימיזציה נוספת siRNAs כי להשפיע באופן דרמטי צמיחת תאים או יכולת הקיום. צפיפות נמוכה ציפוי תוביל הישרדות התא העניים במהלך transfection. צפיפות גבוהה ציפוי תוביל רקע גבוהה בשל בידול מפגש גבוהה הנגרמת התא. אם ציפוי הצורך, בדיקת צפיפות בין 2-4 x 10 ס&quot;מ / 5 תאים 2. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני השינוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן באמצעות הרב ערוצית aspirator (Corning) או ואקום שרביט (VP-Scientific). יש להיזהר שלא לשרוט את התאים בחלק התחתון של הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את התאים עם המדיום הסלולרי טרי ES (100 μl לצלחת 96-30 μl היטב על צלחת 384 היטב), תוך שימוש רב ערוצי פיפטה כל יום. </li></ol></li></ol> 3. FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא דיסוציאציה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה ימים לאחר transfection, הסר בינוני באמצעות הרב ערוצית aspirator (Corning) או ואקום שרביט (VP-Scientific). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 96-גם צלחות, שטפו תאים פעם אחת עם 100μאני PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl טריפסין 0.25% זה גם באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5minutes בהתרגשות מדי פעם, וגם מבחינה ויזואלית לבדוק על מנת להבטיח ניתוק מוחלט של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 90 μl של PBS עם FBS 10% להשבית טריפסין ו לנתק את התאים לתוך ההשעיה תא בודד על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 384 גם הצלחות, לנתק את התאים עם טריפסין 10 להרוות μl עם 30 PBS μl עם FBS 10%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS ניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקרינה GFP על נתח LSRII FACS BD מצויד ביחידת HTS או מנתח אחר מצויד באופן דומה FACS (כגון Accuri או Intellicyt). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במצב תפוקה גבוהה על HTS ולנתח 10 μl ההשעיה התא. הגדרת הסף הספירה 1.0 x 10 4 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח הסף PMT כדי ללכוד תאים של העלילה קדימה מול תופעות פיזור. שער לאוכלוסייה תא חי ב forwארד נגד תופעת פיזור העלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת העלילה היסטוגרמה עבור ערוץ ה-GFP. הגדר את השער בערוץ ה-GFP, כך ~ 10% של התאים נראה GFP שלילית בתאים transfected מדומים או שליטה siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע ה-GFP שלילית% תאים כל טיפול: תאים% הבדיל =% תאים GFP-שלילי. השווה את התאים% הבדיל בין הניסוי-and-siRNA השליטה transfections באמצעות 2 זנב מבחן t, וציון הלהיטים חיובית עם ערכי P-&lt;0.01. </li></ol></li></ol> 4. נציג תוצאות Oct4, Nanog, ו Sox2 שלושה גנים ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על התא ES עצמית חידוש 6,7,9-11. איור 2 מראה כי assay כתב Oct4GiP יכול בקלות לזהות את הבידול הנגרמת על ידי להשתיק את הגורמים הללו ב Oct4GiP גזע עובריים לתאים. איור 2 א מראה לתאי גזע עובריים הם Oct4GiP GFP חיובי כאשר שמרו כמו ES<html> תאים. איור -2 מציגה את העלילה קדימה לעומת פיזור לצד ההיסטוגרמה של ערוץ ה-GFP של תאים Oct4GiP transfected עם שליטה או Oct4 למוצרי siRNAs. יש לשער על תאים חיים בעלילה פיזור קדימה לעומת הצד, כמו תאים מתים ופסולת הם GFP-שלילי יגדיל את הרקע. מצד שני, כפיל אפליה להוציא גושי תאים אפשריים אין צורך תמיד. בפקד-siRNA תאים transfected, הרוב המכריע של התאים צריך להיות ה-GFP חיובי. אם ברור GFP שלילי אוכלוסיות קיימות בפקד-siRNA בארות transfected, התאים Oct4GiP החל או הליך transfection אולי נפרץ והתוצאה לא תהיה לפירוש. איור 2 ג מראה גרף עמודות של תאים% הבדיל (תאים% הבדיל = GFP שלילי תאים%) של שליטה, Oct4-, Nanog למוצרי ו Sox2-siRNA תאים transfected. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. תמציתי של assay כתב Oct4GiP. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> איור 2. Assay Oct4GiP הכתב יכול לזהות תאים ES בידול הנגרמת על ידי Nanog, Oct4 או Sox2 ההשתקה. א) E14Tg2a (wild-type, קו שחור) ו Oct4GiP (קו ירוק) תאים נותחו על ידי FACS. היסטוגרמה של הערוץ-GFP מראה כי תאים Oct4GiP הם GFP חיובי. ב &#39;) היו תאים Oct4GiP transfected ב 96-גם צלחות עם שליטה או Oct4-siRNA ו FACS ניתח 4 ימים לאחר transfection. קדימה לעומת פיזור מגרשים לוואי היסטוגרמות של ערוץ ה-GFP של תאים transfected מוצגים. C) תאים Oct4GiP היו transfected עם Control-, Nanog-, Oct4, או Sox2-siRNA. התאים% הבדיל נקבע מ% GFP שלילי תאים 4 ימים לאחר transfection, והיה זממו כמו ממוצע + / - טעות התקן של הממוצע (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Assay כתב Oct4GiP אנו מתארים לעיל ניתן למדוד כמותית את מידת ההתחדשות העצמית לעומת בידול. לעומת משיטות אחרות, כגון 12 מורפולוגיה מבוסס ושגשוגם / מבחני כדאיות מבוסס, הוא מציע רגישות גבוהה ותפוקה, כמו גם מדידה ישירה יותר של המדינה תא ES. לכן זה גם מתאים בקנה מידה גדול מסכי וניתוח epistasis גנטית. אכן, ואחרים השתמשו בהצלחה assay כתב Oct4GiP של הגנום כולו מסכי RNAi 3,8. כמו מבחני בכל זאת, יש לה גם מגבלות. זה רק יכול לשמש כדי לחקור את הגנים המווסתים במישרין או בעקי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ESGRO בינוני כיתה מלאה בתוספת משובט </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז גבוהה 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (להפחית בינוני סרום) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 units/1ml 7) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (לא חיוניות חומצות אמינו) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> נוקלאוזידים 100x לתא ES </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> M7522-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ES-מוסמך בסרום שור עוברית </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> SiRNA הבקרה: דופלקס siRNA מיקוד גחלילית בלוציפראז (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) מסונתז על ידי Dharamcon.

oct4gip assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency עצמית חידוש שני המאפיינים המגדירים של תאים עובריים (תאים ES). הבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס יהיה מאוד להקל על השימוש בתאי גזע עובריים לחקר הביולוגיה ההתפתחותית, מודלים המחלה, גילוי תרופות, ו רפואה רגנרטיבית (בדיקה ב 1,2). כדי לזרז את זיהוי ואפיון של הרגולטורים הרומן של תחזוקה ES תא עצמית והתחדשות, פיתחנו assay הקרינה הכתב מבוסס למדוד כמותית את מצב עצמי התחדשות התאים עכבר גזע עובריים תוך שימוש בתאי Oct4GiP 3. התאים Oct4GiP לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של האזור המקדם Oct4 גן 4,5. Oct4 נדרש תא ES עצמית והתחדשות, והוא הביע מאוד בתאי גזע עובריים ובמהירות למטה מוסדר במהלך התמיינות 6,7. כתוצאה מכך, ביטוי של GFP ו הקרינה בתאי הכתב וקושרת בנאמנותעם זהות ES Cell 5, הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) ניתוח יכול לשמש כדי לעקוב מקרוב אחר מצב עצמית חידוש התאים ברמת תא בודד 3,8. יחד עם RNAi, assay כתב Oct4GiP ניתן להשתמש כדי לזהות במהירות וללמוד הרגולטורים של תחזוקה ES תא עצמית חידוש 3,8. בהשוואה לשיטות אחרות עבור assaying עצמית והתחדשות, זה יותר נוח, רגיש, כמותי, של עלות נמוכה יותר. זה יכול להתבצע 96 - או 384 צלחות היטב בקנה מידה גדול מחקרים כגון תפוקה גבוהה מסכי או ניתוח epistasis גנטית. לבסוף, באמצעות אחרים שושלת ספציפיים גזע עובריים הכתב שורות תאים, assay המתואר כאן יכול גם להיות שונה כדי ללמוד מפרט הגורל במהלך התמיינות תאים ES.

אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

פלוריפוטנציה (Pluripotency) והתחדשות עצמית הן שתי תכונות מגדירות של תאי גזע עובריים (ES cells). הבנת המנגנון המולקולרי העומד בבסיסן תסייע...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע במהירות את תפקידו של הגן הנחקר בתחזוקת החדישות העצמית של תאי גזע עובריים של עכבר, או תאי ES. דבר זה מושג תחילה על ידי הרכבת תערובת מאסטר לטרנספקציה שתשמש להשתקת הגנים הנחקרים. כשלב שני.תערובת המאסטר לטרנספקציה מועברת לצלחת מצופה בג'לטין ומוסיפים לה תאי T 4G IP. לאחר מכן התאים גודלים בתנאי תרבית רגילים של תאי ES, כדי לאפשר להשפעת השתיקת הגנים לבוא לידי ביטוי. לאחר ארבעה ימי תרבית, התאים מופרדים מהצלחת ומצב ההתחדשות העצמית שלהם נקבע באמצעות ציטומטריית זרימה. לבסוף, ניתן להעריך באמצעות תוכנת facts את ההבדלים באחוז התאים השליליים ל-GFP בין תאי T 4G IP של הביקורת לבין תאי T 4G IP שעברו טרנספקציה ב-siRNA ניסויי.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח מורפולוגיה של תאים או ניתוח סמני שושלת, הוא שהיא מספקת רגישות ותפוקה גבוהות יותר, ולכן היא מתאימה יותר לסריקות גנטיות בהיקף בינוני עד גדול או לניתוח אפיסטזיס גנטי. שיטה זו יכולה להקל במידה רבה על חקר חשיבות הגנים לתחזוקה וחידוש עצמי של ESL. ניתן להתאימה גם לאירועי התמיינות עצמית המתרחשים במהלך התמיינות של ESL.תאי T 4G IP מטופחים בצלחות מצופות ג'לטין. הם נזרעים בריכוז של כמעט שתיים כפול 10 בחזקת 4 לסנטימטר רבוע ועוברים תת-תרבית כל יומיים עד שלושה ימים לצורך טרנספקציה. בצלחות 96 באריות בעלות תחתית שטוחה, התחילו בציפוי הצלחת ב-0.1% ג'לטין, לאחר מכן הכינו את תערובת המאסטר של Optum ו-Lipectomy 2000 וחלקו אותה למנות בצלחת 96 באריות בעלת תחתית בצורת U.דגרו את הפלטה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסיפו five picomoles של I a לתערובת הליפידים האופטימלית ודגרו למשך 15 דקות נוספות. כעת, הסירו את הג'לטין מפלטת ה-96 בארות בעלת התחתית השטוחה והשתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את קומפלקסי ה-i a ליפידים באופטימום מפלטת ה-U אל הפלטות בעלות התחתית השטוחה. כעת אספו את תאי OC 4G IP וסספנדו אותם מחדש במדיום M 15 טרי בריכוז של nine times 10 of the fourth תאים למיליליטר.לאחר מכן, השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 100 µL של תגליל התאים לכל באער של פלטה בעלת 96 באערים עם תחתית שטוחה, ובצעו שאיבה ודחיפה (pipette up and down) של הנוזל שלושה עד חמישה פעמים כדי לערבב את תגליל התאים עם קומפלקסי ה-seralipids, תוך החלפת הטיפים עבור כל סוג של seralipids שמועבר. לאחר מכן, הניחו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide, ותרבתו את התאים למשך ארבעה ימים. בכל יום של תרבית, השתמשו בשואב רב-ערוצי כדי להסיר את המצע הישן, תוך הקפדה שלא לשרוט את התאים בתחתית הפלטות.לאחר מכן, השתמש בפפיטה רב-ערוצית כדי להזין את התאים ב-100 microliters של מצע תרבית טרי לתאי ES ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה. הסר את המצע באמצעות שואב רב-ערוצי ושטוף את התאים פעם אחת ב-100 microliters של PBS. לאחר מכן, השתמש בפפיטה רב-ערוצית כדי להוסיף 25 microliters של 0.25%trypsin לכל באר.דגרו את התאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם. לאחר מכן, בצעו בדיקה ויזואלית של הפלטה כדי לוודא שהתאים ניתקו לחלוטין. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 90 µL של PBS עם 10%FBS כדי לנטרל את ה-trypsin, ושאבו את תמיסת התאים למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפטה כדי לפרק את התאים לסספנזיה של תאים בודדים.לבסוף, השתמשו במצב התפוקה הגבוהה (high throughput mode) ביחידת ה-HTS של אנליזר FACS כדי לנתח 10 µL מתליהיית התאים. הגדירו את סף הספירה ל-1.0 × 10⁴ תאים וכווננו את מתח ה-PMT כדי ללכוד את התאים בגרף הפיזור של forward scatter לעומת side scatter. הגדירו את שער הניתוח (analysis gate) עבור אוכלוסיית התאים החיים בגרף הפיזור של forward scatter לעומת side scatter, ולאחר מכן צרו תרשים היסטוגרמה עבור ערוץ ה-GFP.הגדרת השער (gate) בערוץ ה-GFP כך שכש-10% מהתאים ייראו כשליליים ל-GFP בתאי הבקרה (mock) או בתאים שעברו טרנספקציה של SINA, תקבע את אחוז התאים המובחנים על בסיס אחוז התאים השליליים ל-GFP. עבור כל טיפול, השווה את אחוז התאים המובחנים בין הקבוצות הניסיוניות לבקרות שעברו טרנספקציית irna.איור ראשון זה מראה שתאי wild type E 14 TG two A, המיוצגים על ידי ההיסטוגרמה השחורה, הם שליליים ל-GFP, בעוד שתאי T 4G IP, המיוצגים על ידי ההיסטוגרמה הירוקה, הם חיוביים ל-GFP כאשר הם מתוחזקים כתאי ES. בשני האיורים הבאים מוצגים בגרפי הפיזור תרשימי Forward versus side scatter והיסטוגרמות של ערוץ ה-GFP של תאי T 4G IP ארבעה ימים לאחר טרנספקציה עם בקרת T four siRNAs. תאים חיים מסוננים תחילה בגרף ה-forward versus side scatter מאחר שתאים מתים ופסולת הם שליליים ל-GFP ויוצרים רקע מוגבר כפי שניתן לראות בנתוני ההיסטוגרמה; בתאים שעברו טרנספקציה עם בקרת irna, הרוב המכריע של התאים הם חיוביים ל-GFP.גרפים של עמודות אלה מראים את אחוז התאים המובחנים מתאי ביקורת, ומתאי OCT 4 ו-SOX 2 שעברו טרנספקציית siRNA, ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה. בכל המקרים, כצפוי, נקבע כי תאים שעברו טרנספקציית siRNA מראים רמות גבוהות יותר של ביחון מאשר תאי הביקורת. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעה אחת של עבודה מעשית עבור כל פלטת 96 בארות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה באופן השימוש בבדיקת ה-Oxford GIP reporter כדי לקבוע במהירות את תפקידו של הגן הנחקר בשמירה על ESL בעכברים.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

עכבר Stemgent DOX ועין מתנהלת TF הגדר Lentivirus ניתן לתכנת מחדש fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הנגרמת על גזע pluripotent (שב"ס) תאים. כאן אנו מדגימים את פרוטוקול לביטוי DOX-ועין מתנהלת תכנות מחדש של העכבר גורמי תעתוק Oct4, Sox2, Klf4 ו c-myc ליצור מושבות iPS המבטאים משותף סמנים MES pluripotency.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Sc1 פונקציות על ידי עיכוב כפול של ראס-GAP ו ERK1. בדקנו את תפקוד sc1 בתמיכה ES העכבר תא עצמית חידוש בהעדר LIF והראה כי sc1 הוא מסוגל לשמור על התחדשות עצמית של ES תרבויות עכבר התא.

השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת פעילות חומצה רטינואית בעוברי עכברים. לאחר בידוד התאים מעוברי העכברים, התאים עוברים תרבית משותפת עם תאי כתב חומצה רטינואית (RA). תאים עובריים מייצרים RA, אשר גורם לביטוי בטא-גלקטוזידאז בתאי כתב, מה שמעיד על פעילות RA בתאים העובריים.

העסקת תאי כתב בתרבית משותפת לחקר ייצור חומצה רטינואית על ידי תאים עובריים של עכברים

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

במחקר זה, אנו מייצרים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתאי מי שפיר של עכברים, באמצעות מערכת טרנספוזון שאינה מבוססת ויראלית.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.

הערכה כמותית אופטימלית של יציבות RNA משפר בתאי גזע עובריים בעכבר

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

למדו לזהות גנים המווסתים תחזוקה והתחדשות עצמית של תאי גזע עובריים בעכברים באמצעות שיטת מדידת פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של תפקוד גנים בביולוגיית תאי גזע.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

גלה סרטונים נוספים