Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למקם אוכלוסייה של תאי גזע בריאים בסמוך לרקמה שנכרתה בתאי גזע בתוך פריאן על מנת לנתח התנהגויות של תאי גזע וצאצאים in vivo במהלך ההתחדשות. זה מושג על ידי הרדמה וקיבוע של פריאן לא מוקרן או מוקרן עלים למניפולציה נוספת. לאחר מכן, הפריאן המשותק ללא הקרנה מוגן חלקית בעופרת ולאחר מכן מוקרן בקרני רנטגן, מה שמייצר פריאן לא פצוע עם רקמה מרוסקת של תאי גזע לצד הרקמה המוגנת שנותרה עמוסה בתאי גזע.

לחלופין, ניתן להשתיל שתל רקמה שנלקח מתורם שאינו מוקרן בעבר במארח שהוקרן בעבר על מנת לייצר פריאן עם אוכלוסייה מבודדת של תאי גזע. פלי נמצא בתוך תא גזע אחרת. מתקבלות תוצאות מארח Ablated המראות אוכלוסיות תאי גזע מבודדות הסמוכות לרקמות תאי הגזע על ידי RNA שלם במקום שתי הכלאות עבור גנים של סמני תאי גזע.

לכן השיטות המתוארות כאן שואפות להבין טוב יותר את פלנרי ההתחדשות על ידי חקר ההתנהגות של תאי גזע הן בפרדיגמת ההשתלה והן בפרדיגמת הקרנה חלקית, המאפשרת לנו לבדוק אם הרקמות הסובבות והסביבות המקומיות בהן שוכנים תאי גזע אלה, משפיעות או משפיעות על ההתנהגות של ניאו-בלסטים או תאי גזע אלה. בתהליך ההתחדשות, חודש עד חודשיים לפני הניסוי, יש להזין את הפלין בהתאם לכתב היד המצורף. על מנת להשיג את הגודל הרצוי בהדגמה זו, נבחר פלין באורך של בין סנטימטר לשני סנטימטרים ורחב משני מילימטרים.

לאחר מכן הם מורעבים שלושה עד שבעה ימים לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הכלורו טון הרדמה מקומית קלה על ידי המסת 0.1 עד 0.2% משקל לנפח קליאון במי הפריאן. לאחר מכן מצננים את התמיסה על קרח להשתלת רקמות בעזרת מבער בנסן, מכופפים צינור נימי בקוטר פנימי של 0.75 מילימטר בסנטימטר עד שני סנטימטרים מהקצה לזווית של 90 מעלות לחיתוך רקמת השתל.

לאחר מכן כופפו צינור נימי נוסף בקוטר חיצוני של 0.7 מילימטר בסנטימטר עד שני סנטימטרים מהקצה לזווית של 90 מעלות ליצירת חור במארח לקבלת השתל. לאחר מכן, חתוך את נייר הסינון השחור ווטמן. מספר שלוש, נייר סינון מגבון קים ונייר גלגול סיגריות לפי הגדלים המצוינים בכתב היד המצורף.

לאחר מכן, הכינו את תמיסת הולט פרס המותאמת ואת תמיסת הולט פרטר הרוויה של קיין. מצננים את שניהם לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן חבר מגבון קים מקופל לריבוע של Paraform.

הנח אותו על צלחת הקירור של פלטייר או מכשיר קירור אחר תחת מיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן יש להרוות את מגבון קים בתמיסת הולט פרטר צוננת. לאחר מכן הניחו שני מלבני נייר פילטר שחורים על מגבון קים.

כעת הניחו פיסת נייר סינון מספר שתיים של ווטמן בצלחת פטרי. הרטיבו את נייר הסינון בתמיסת Holt Fretter. ואז מצננים את המנה על קרח להקרנה חלקית.

מניחים תוחם נייר גדול יותר בכלי גדול יותר בדומה להשתלת רקמות. הרטיבו את נייר הסינון בתמיסת Holt Fretter. ואז מצננים את המנה על קרח.

בהליך זה, מלאו צלחת פטרי בתמיסת קליאון צוננת. פיפטה את הפלנריה לתוך הצלחת להשתלה. יש להרדים רק מארח אחד ותורם אחד בכל פעם.

להקרנה חלקית, ניתן להרדים בעלי חיים רבים בבת אחת. לאחר מכן הניחו לפריה להשרות בתמיסת הקליאון למשך חמש עד 10 דקות עד שהם הופכים ללא תנועה. שטפו את הפריה על ידי פיפטינג לכלי מלא בתמיסת הולט פרטר צוננת.

לאחר מכן, יש לשתק את אזור ה-plin על ידי פיפטינג על ניירות הסינון השחורים הרוויים בתמיסת הולט פרטר צוננת. לאחר מכן כוון אותם לצד הגחון כלפי מטה בעזרת זוג מלקחיים. כעת הניחו צלחת פטרי צוננת שהוכנה קודם לכן בדלי קרח שיתאים לתוך רדיאטור רנטגן ממקור עליון.

מסדרים את אזור הפלין המורדם בצלחת פטרי על ידי הזזת ניירות הסינון השחורים. לאחר מכן העבירו אותם למקור העליון, רדיאטור רנטגן, מקמו את דלי הקרח כך שהמרחק מצינור הקתודה לפאריה ממוזער. ובכך למקסם את שיעור המינון האפקטיבי.

לאחר מכן מקם את מגיני העופרת בין הפריה לצינור הקתודה למינון צילום רנטגן. אם יש צורך באבלציה מלאה של תאי גזע מאזורים לא מוגנים, יש לספק 30 אפורים ומעלה. מיד לאחר פליטת קרני הרנטגן, העבירו את הפאריאן למים פריאנים צוננים.

לאחר מכן, אפשר למים הפאריים להתחמם לטמפרטורת החדר ולבעלי החיים לעקור את עצמם מנייר הסינון השחור. הליך ההקרנה החלקית הושלם כעת. כדי להתחיל בהליך זה תחת מיקרוסקופ הניתוח, סדרו את המארח המורדם ואת אזור הפלין התורם על מסננים שחורים מלבניים נפרדים על מגבון קים, שכבר התקרר על צלחת הפלטייר או הצידנית.

השתמש בצינור נימי בקוטר פנימי של 0.75 מילימטר כדי לחתוך את פקק השתל מהתורם. לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים כדי להניח אותו על חלק מרוחק של המארח. לאחר מכן השתמש בצינור נימי בקוטר חיצוני של 0.7 מילימטר כדי להסיר תקע מהמארח.

לאחר מכן מקם את השתל בחור. העבירו את המארח המושתל על נייר הסינון השחור המלבני לצלחת הפטרי שהוכנה קודם לכן. הרטיבו פיסת נייר גלגול בתמיסת הולט פרטר רוויה של קיין.

לאחר מכן הניחו אותו על גבי המארח המושתל. לאחר מכן, יש להשרות ארבע חתיכות נייר פילטר העוטפות תמיסת הולטר רוויה, ובמקרה שהמארח המושתל משרים לאחר מכן ארבע חבילות של חיתוך, קים מנגב את תמיסת הולט פרטר הרוויה. הניחו אותם על ניירות הסינון.

לאחר מכן, סגור את המכסה. מניחים את צלחת הפטרי על קרח. לאחר מכן העבירו את הפריאן התורם למים הפאריאנים לצורך התאוששות והתחדשות.

לאחר השלמת כל ההשתלות, הנח את הפריאן המושתל באינקובטור של 10 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו אותו לצלחת פטרי מלאה במי פאריאן. אפשר לפאריאן לעקור את עצמו מנייר הסינון או להסיר אותו בעדינות בעזרת מלקחיים ולהחליף את מי הפאריאן אחת ליומיים-שלושה לאחר מכן.

הכלאה באתרה של חור בפריאן המוקרן, אך מסוכך לחלוטין שנקבע שלושה ימים לאחר ההקרנה, מראה התפלגות תאי גזע שלא ניתן להבחין בה מזו של הפריאן מסוג הבר. מצד שני, עבור הפריאן שהיה מוגן רק חלקית, השארת החלקים הקדמיים והאחוריים חשופים נראה שתאי גזע נלקחו מהאזורים הלא מוגנים. כאן מראה את מראות הגב והגחון של פריאן שהושתל בהצלחה.

שלושה ימים לאחר ההשתלה, השתל נראה בבירור הן על פני הגב והן על הגחון, ומוקף ברקמה לא פיגמנטית אופיינית בממשק מארח השתל. עם זאת, ההשתלה הלא מוצלחת אינה מציגה רקמת שתל נראית לעין באתר ההשתלה. הכלאה שלמה באתרה חשפה נוכחות של תאי גזע רק במיקום השתל או בסביבתו, מה שמעיד על הצלחת ההשתלה לאחר שליטה.

ניתן לבצע השתלות תוך חמש דקות כל אחת. עם שיעורי הצלחה המתקרבים ל-90 עד 100% והקרנה חלקית יכולה להיות מוגברת מאוד. בהנחה שגודל השדה של הרדיאטור שלך גדול מספיק.