בסיסי

בסרטון זה, נראה לכם כיצד לסנכרן תולעי C. elegans בשלב לבה L1. זוהי שיטה פשוטה, אך נפוצה מאוד, ולכן היא תהיה שימושית למדי עבורכם כמתחילים.

אם אתם מומחים בשפת C, ייתכן שתמצאו כאן מספר טיפים לאופטימיזציה של פרוטוקול זה. הבסיס לסנכרון התולעים מבוסס על העמידות היחסית של העוברים לעומת תולעי מבוגרים לתמיסת היפוכ לוריט בסיסית. תולעים בוגרות אלו, שבתוכן עוברים רבים, מדגירות עם תמיסת היפוכ לוריט כך שהן נהרגות ורק העוברים נותרים.

החלק השני של הסנכרון מושג באמצעות מחסור במזון, כך שגם אם העוברים נלכדים בזמנים שונים, הם אינם מתפתחים מעבר לשלב L1. השלב הראשון להתחלת פרוטוקול ה-blitzing הוא להביא את התולעים לשלב הטלת הביצים, כאשר מספר ביצים מפוזרות על הפלטה. השתמש ב-M9 כדי להחלים את הבוגרים לצורך איסוף.

בנוסף, ניתן לגרד את העובריים שכבר הגיעו לפני השטח של המצע באמצעות חומר רך, כגון פיסת סרט רנטגן, ולשטוף את החיידקים שנסחפו בעזרת מספר שטיפות של M9. בדרך כלל, שתי שטיפות מספיקות. לאחר שטיפת התולעים, ניתן להוסיף את תמיסת ההלבנה שהוכנה טרי, בהתאם להעדפותינו.

שמרו על זמן הדגרה קבוע תוךما ניעור של המבחנה. ניתן לעקוב אחר התפתחות הבוגרים תחת מיקרוסקופ סטריאו. כאשר כמעט ולא נותרים פגריים, הפסיקו את התהליך על ידי הוספת M nine עד שהמבחנה תהיה מלאה לחלוטין.

כדי להשלים את הפרוטוקול, בצעו לפחות שלושה שטיפות. ביצה ב-M nine מדוגרות עם ניעור רציף למשך הלילה בבופר M nine, מה שמאפשר בקע אך מונע התפתחות נוספת של התולעים. למרות שניתן לבצע סנכרון בכל טמפרטורה שבין 15 ל-25 מעלות, מומלץ להשתמש ב-15.

מכיוון שההתפתחות איטית יותר, וכפי שציינו במהלך התפתחותו, ה-C. elegans עובר ארבעה שלבי זחליים לפני הבגרות, כאשר משך הזמן תלוי בטמפרטורה שבה הוא גדל. בעוד שסוג C של C. elegans סובל טמפרטורות גידול הנעות בין 15 ל-25 מעלות, קצב הגדילה גבוה יותר.

בטמפרטורה הגבוהה יותר, ניתן לראות כי לאחר 24 שעות, השלבים שבהם נמצאים התולעים שונים. ב-15 וב-25 מעלות, לאחר 48 שעות ב-25 מעלות, אנו כבר 관צים עוברים. עם זאת, עלינו להמתין יותר מ-80 שעות כדי לראות עוברים על פני הפלטות.

כדי להשיג תוצאות אופטימליות עם תולעים שגודלו ב-15 מעלות, יש להביא בחשבון מספר סוגיות בעת ביצוע ניסוי בליצינג (blitzing). כמו כן, חשוב לזהות את התולעים הנמצאות בשלב הרצוי לביצוע הניסוי. לפיכך, נראה לכם כיצד להבחין בין השלבים השונים, בין אם על פי הגודל, מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast microscopy), או באמצעות צביעה.

בגרף זה ניתן להתרשם מקצב הגדילה של תולעי GaN בהתאם לטמפרטורה, כאשר ניתן לראות שהגדילה מהירה הרבה יותר ב-25 מעלות. קיימת קורלציה בין גודל בעל החיים לבין התפתחותו בסביבה ימית. באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן למדוד את בעלי החיים ולאחר מכן לסווג אותם לשלב ההתפתחותי המתאים.

עם זאת, על פי גרף זה, המיקום מהווה סמן כללי של שלבי התפתחות. ניתן להשיג סיווג שלבים מוסכם יותר על ידי התבוננות בחלקים של ה-seas, אנאטומיה שניתן להשתמש בה ולזהותה באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (differential interference contrast microscopy) או צביעת DPI. במעבדה שלנו, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לסנכרן תולעים עבור ניסויים שונים כביצי מיקרו בצביעה בודדת (mono staining), הדמיה in situ וצביעת up.

בנוסף, פרוטוקול זה מסייע גם במניעת זיהומים. לצורך הגברת הניגודיות נעשה שימוש במיקרוסקופיה בעלת ניגודיות של התאבכות דיפרנציאלית (Differential interference contrast) או במיקרוסקופיית Nomar. בדגימות שקופות שאינן צבועות, החיות מורכבות כשהן בחיים על בסיס של 2%Agros; ניתן להכין את ה-agros מראש ולאחסן אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות לשימוש בעת הצורך.

ניתן להמיס אותו ולשמור אותו בטמפרטורה של 65 degrees. לאחר שה-agros נמס, הדביקו סרט דביק על עלית זכוכית והניחו אותן משני צדדיו של עלית שלישית. קחו בזהירות מעט agros והניחו טיפה על העלית ללא הסרט הדביק.

כסו את ה-agros עם זכוכית כיסוי נוספת המוצמדת באופן רוחבי. ברגע שהנתיב יהיה מוצק, הפרידו בין שתי הזכוכיתות על ידי החלקה זהירה של אחת על השנייה. הפד יידבק לאחת מהן.

הוסיפו מעט Amazon על הפד כדי לשמור על התולעים מקובעות. בחרו מספר תולועים תחת מיקרוסקופ dissection והעבירו אותן לטיפת lele. הימנעו מפגיעה בנתיב.

קחו זכוכית כיסוי והוסיפו מעט לק ציפורים לשוליים. הניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי על השקופית כדי למנוע היווצרות בועות. ניתן לצפות בדגימה מיד תחת המיקרוסקופ. אחד המאפיינים הקלים ביותר לזיהוי באנטומיה של *C. elegans* הוא העולווה (Alva).

לדוגמה, aava בעלת צורת עץ חג מולד מאפיינת את שלב L four. מידע מפורט על האנטומיה של c elgan לאורך ההתפתחות ניתן למצוא בכתובת www.orla.org. צביעת Tapis היא פרוצדורה נפוצה לזיהוי תאים בודדים.

קיבוע באמצעות מנהרה היא שיטה מהירה לקיבוע תולעים. עבור צביעת DAPI, ראשית יש להוסיף טיפה של תמיסת M9 למשטח של תגית מיקרוסקופ. יש לאסוף מספר תולעים ישירות מהצלחת ולהעביר אותן אל טיפת ה-M9.

הסר עודפי M nine באמצעות פיפטה או בעזרת נייר סופג. הוסף תעלה לתולעים. חזור על הפעולה.

לאחר שהטיפה הראשונה התייבשה, הוסיפו מעט מדיום עיגון עם API ו-oversleep לפני העברת התכשיר למיקרוסקופ. ניתן לצפות בקלות בהתפתחות ה-go ב-warm stent עם api.