הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות ולאתר אתרי השהיה תרגומית עיקריים עבור mRNA המתורגם במערכת תרגום נטולת תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי שיבוט הגן הרלוונטי תחת בקרתו של מקדם שעתוק T7. לאחר מכן, ה-mRNA משתכפל ומטהר.

לאחר מכן, מתבצע תרגום in vitro בנוכחות mRNA וחומצות אמינו רדיואקטיביות כדי לסמן את החלבון המסונתז ואת הפוליפפטידים המתהווים. לבסוף, הפוליסומים מבודדים באמצעות סנטריפוגה במהירות שיקוע, והשרשראות המתהוות המבודדות מופרדות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. כתוצאה מכך, ניתן לקבל תוצאות המראות פוליפפטידים מתהווים באורכים שונים באמצעות Tristine SDS page ואוטורדיוגרפיה, דבר המעיד על נוכחותם של אתרי עצירה (pause sites) לאורך ה-mRNA הנבדק.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון micro cocal nucleus protection assay, הוא שהיא פשוטה, מהירה ויעילה ביותר, ומאפשרת קביעה וזיהוי של אתרי התרגום העיקריים לאורך כל MNA במערכת תאיה נתונה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על חלק מהשאלות המרכזיות בתחום התרגום וקיפול חלבוני תרגומי, כגון כיצד גורמים כגון שימוש בקודונים, שכיחות TNA ו/או מבנה שניוני של mRNA עשויים להשפיע על קינטיקת התרגום. שיטה זו עשויה להסב תועלת נוספת להבנתנו את הקשרים שבין קינטיקת התרגום לבין השלבים המרכזיים במסלול קיפול החלבון בתרגום הקוד.

ההשלכות של טכניקה זו נשמעות על הבנת תהליך קיפול החלבונים in vivo, אשר לפי האמונה הרווחת מתרחש באופן קו-טרנסלציונלי במהלך התרגום בריבוזום, אף שבעבודה הנוכחית נעשה שימוש בתרגום ללא תאים של gamma bicrystalline באמצעות תמצית תאים זמינה מסחרית. ניתן להחיל טכניקה זו גם לזיהוי IDE טרנסלציונליים פוטנציאליים בכל חלבון, תוך שימוש בתמצית בעלת יכולת תרגום שהוכנה מכל מקור תאי. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה בשני שלבים מרכזיים של הפרוטוקול.

הדבר הראשון הוא קביעת הזמן הכולל הנדרש להרצת תגובת התרגום, מה שיבטיח שמרבית הפוליפפטידים הנסתרים (nascent polypeptides) יישארו קשורים לריבוזום. הדבר השני הוא מציאת מערכת הפרדה מתאימה כדי לבודד את מרבית הפוליפפטידים הנסתרים; בחירת מערכת ההפרדה תלויה בגודל החלבון הנחקר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר החלטנו לבחון את קינטיקת התרגום של מולקולות הגלובין באמצע שנות השמונים, בהקשר למודל המוצע של קיפול תרגומי קו-טרנסלציונלי (COT) של גלובין.

חוסר האחידות של תרגום הגלובין הובחן לראשונה על ידי PRO ו-Maurice בשנת 1974 בעת שימוש בכרומטוגרפיית CLO של חסימת גודל עבור שרשראות הגלובין NAS. עם זאת, הניתוח שלהם לא היה בעל הדיוק הרצוי; Pro ו-more הבחינו בארבעה אתרי כוח תרגומיים עיקריים במהלך תרגום הגלובין. לאחר מכן, הניתוח שלנו אפשר לחשוף כ-10 אתרי כוח נוספים ולהבנות מודל מפורט של קיפול הגלובין התרגומי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הטכניקה המתוארת כאן כוללת בידוד של פוליסומים וניתוח של פוליפפטידים נולדים באמצעות ג'ל Tri S Ds page.

שני שלבים אלה קריטיים להשגת תוצאות באיכות גבוהה ובשחזוריות. הדגמה של הפרוג'ל תתבצע על ידי סטודנט לתואר מתקדם ממעבדתו של Sujata For עבור תעתוק במקום (in vitro transcription) של RNA שליח. התחל עם גן עניין ששוכפל תחת פרומוטר T7 ו/או SP6; בעזרת אנזים הגבלה מתאים, לינאריז את תבנית ה-DNA במורד מקודון העצירה ו/או מקצה ה-3' של ה-mRNA.

מדגם של עיכול הרסטריקציה יעבור אלקטרופורזה בגל של אגרוז כדי לוודא שה-DNA לינארי לחלוטין. לאחר קביעת ריכוז תבנית ה-DNA האופטימלי, השתמש בערכה לטרנסקריפציה כדי לבצע טרנסקריפציה של mRNA in vitro בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמש בשיקוע באמצעות ליתיום כלוריד כדי לטהר את ה-mRNA.

לאחר מכן, השתמש באלקטרופורזה של ג'ל אקרילאמידה או אגרוז כדי לאמת את טהרתו. הכן תגובת תרגום in vitro בנפח 100 µL במים נקיים מנוקלאז על ידי הוספת תערובת חומצות אמינו בריכוז 1 mM ללא methionine, 10 units של מעכב RNA, 20 µCi של 35 S methionine רדיואקטיבי וליזאט רטיקולוציטים של ארנב. לאחר מכן, חמם מראש את התגובה על ידי הדגרה בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 2 µg של mRNA והדגרימו בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש דקות כדי לעצור את התגובה, והניחו על קרח כדי לבודד פוליפפטידים ראשוניים (nascent polypeptides) הקשורים לריבוזומים. שכבו את תגובת התרגום מעל 4.5 mL של 30% glycerol ב-Tris-HCl pH 7.6 עם potassium chloride ו-magnesium chloride, תוך שימוש בצנטריפוגה עם rotor TLA 110 ב-100,000 ×g למשך שעה ב-4 °C. לאחר מכן, הסירו בזהירות את העלייה (supernatant), ושעלקו מחדש את משקע הפוליסומים המכיל פוליפפטידים ראשוניים בנפח קטן של 1 mM Tris-HCl buffer pH 7.6 המכיל 0.5 mg/mL של ribonuclease A, והדגרימו למשך 30 דקות ב-37 °C.

כדי להגביר את ההידרוליזה של קשר האסטר של ה-TRNA בפפטיד, הוסף נתרן הידרוקסיד בריכוז סופי של 10 millimolar לתגובה והדגרה אותה למשך 30 דקות נוספות. הפרד את הפוליפפטידים הצעירים באמצעות Tris-Tricine SDS-PAGE, ולאחר מכן קבע וייבש את הג'לים. העבר את הג'לים לאוטורדיוגרפיה, ולאחריה לדימות פוספורי (phospho imaging) לצורך זיהוי הפוליפפטידים הצעירים.

תנועה משתנה של הריבוזום המושרה על ידי שינויים במאגר ה-TRNA צריכה להוביל לשינויים בהתפלגות הגדלים של פוליפפטידים צעירים המצטברים במהלך התרגום, וכן בעוצמות היחסיות שלהם, המשקפות את משך ההפסקה בנקודה זו. פוליפפטידים צעירים עבור חלבון ה-gamma B crystalline בודדו והופרדו באמצעות Tristine SDS page. האורכים והעוצמות השונים של הפוליפפטידים במערכות RRL ו-e coli מעידים כי תנועת הריבוזומים לאורך ה-mRNA בשתי מערכות אלו עוקבת אחר קינטיקת תרגום שונה.

לדוגמה, שימו לב לפס הבולט של 17.7 kilodalton בליזאט של e coli, שאינו קיים במערכת הליזאט של רטיקולוציטים של ארנב. Gamma B crystalline מכילה קודוני ארגנין רצופים הנפוצים במערכות של יונקים, אך ידועים כנדירים ביותר ומתורגמים באיטיות ב-e coli, מה שמרמז כי פס זה נגרם על ידי עצירה של הריבוזום בקודונים נדירים רצופים אלו, כפי שמוצג כאן.

לא ניתן להבחין בפסים בהיעדרו של mRNA, וטיפול ב-puromycin מסיר את רוב השלשלאות הנסמכות מהפוליסום. בנוסף, טיפול ממושך ב-puromycin מסיר את כל השלשלאות הנסמכות, מה שמאשר כי תוצרי הפוליפפטיד שנצפו הם שלשלאות נסמכות הקשורות לריבוזום ולא MRPs השוקעיםร่วม עם הפוליסום. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בתוך יום עד יומיים. משך הפרוצדורה תלוי בעיקר במשך שלב הסנטריפוגציה ובשלב האלקטרופורזה של הפפטידים הנסמכים בג'ל.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להפסיק את תגובת התרגום מיד לאחר זמן הדגירה. כדי למנוע שחרור של פוליפפטיד ראשוני (nascent polypeptide) מהריבוזום, קריטי להימנע מחשיפה ל-RNAs בכל שלב. זיהום ב-RNAs עלול להשפיע על יעילות התרגום של התמצית ולהוביל לשחרור של הפוליפפטיד הראשוני מהריבוזום בעקבות ביצוע פרוצדורה זו.

ניתן לבחון לאחר פיתוחה גם מטרות אחרות, כגון השפעתם של חלבונים נקשרי mRNA על יעילות תנועת הריבוזום על מסר נתון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום קיפול חלבונים לחקור את תפקידה של השהיית התרגום הנובעת מנוכחותם של קודונים נדירים במהלך קיפול חלבונים תרגומי. טכניקה זו הועסקה בעבר לבחינת תפקידן של החלפות קאון בתנועת הריבוזום על מסר ובקיפול חלבונים תרגומי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן לזהות אתרי כוח תרגומיים של mRNA המוצג על ידי בידוד פוליפפטיד גדל (nascent polypeptide) הקשור לריבוזום. זכרו כי עבודה עם איזוטופים רדיואקטיביים וחומצות אמינו מסומנות, כגון למשל $^{35}\text{S-methionine}$, מחייבת נקיטת אמצעי זהירות מיוחדים ויש להתחשב בכך תמיד בעת ביצוע פרוצדורה זו.